脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是属于医学免疫领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步说，本发明涉及脂蛋 白a (Lp (a))测定试剂盒检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白a测定试剂盒，该产品用于体外定量测定人血清中脂蛋白（a)(Lp(a))含量， 作辅助诊断用。脂蛋白（a)是一种独特的脂蛋白，脂质组成结构与LDL极其相似，因含有特殊 的载脂蛋白（a)而得名。1987年发现脂蛋白（a)的一级结构与纤溶酶原具有显著同源性，其 增高有导致血栓形成的倾向。Lp(a)体内水平高低与血脂、载脂蛋白不相关，是动脉粥样硬 化性心脑疾病的重要的独立危险因素。对冠心病、急性心梗的发病、病程变化以及转归极具 诊断价值。
[0003] 诊断方法:Lp(a)的测定一般采用RIA法、ELISA法与CL1A法、乳胶免疫比浊法等，但 在临床上多采用乳胶免疫比浊法 血清(含Lp (a))+试剂(乳胶抗人Lp (a)抗体)-抗原抗体复合物 产生浊度变化，在一定的波长下检测，其浊度的变化与其含量成正相关。
[0004] 目前抗体与乳胶的连接通常使用化学偶联法，其作为R2试剂，非常容易发生聚结， 使得试剂质量随着存放时间的延长而下降。使试剂的稳定性差。
【发明内容】
[0005] 本发明根据R2试剂稳定性不佳，提供了一种方法来克服现有技术的不足，使得其 保持质量稳定，提供了一种灵敏度高，稳定性好的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案： 一种脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述的试剂R1为 适当的缓冲液； 所述的试剂R2是用Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒置于缓冲液中，所述试剂R2的制 备步骤包括： 步骤（1):在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒(胶乳）中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚 胺(EDAC)，得到激活的胶乳颗粒； 步骤(2):将步骤(1)激活的胶乳颗粒和Lp(a)抗体混合，待反应结束后再加入葡萄糖封 闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球即Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗 粒，置于缓冲液中。
[0007] 作为进一步优选:步骤(2)中Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在试剂R2中的浓度 为0.08~0.28克/100ml。
[0008] 作为进一步优选:所述试剂R1中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓 冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES) 缓冲液缓冲液中至少一种。
[0009]作为进一步优选:所述试剂R2中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓 冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES) 缓冲液缓冲液中至少一种。
[0010]作为进一步优选:步骤（1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺:聚苯乙烯胶乳颗粒的 重量比为0.2~5:100。
[0011] 作为进一步优选:所述Lp(a)抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体。
[0012] 作为进一步优选:所述步骤（1)中的聚苯乙烯胶乳颗粒其平均粒径在0.01~0.2mm 之间。
[0013] 本发明所述试剂盒所采用的检测原理为胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是Lp (a)抗体的胶乳颗粒，与Lp(a)发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚 集物形成所产生的浊度，即可测出Lp(a)的含量。
[0014] 本发明的优点和有益效果： 1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成 本低的优点。
[0015] 2.本发明采用的Lp(a)检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得Lp(a)的检测 更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速 定量检测。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
[0017]
[0018]实施例l:Lp(a)检测试剂盒的制备 本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下： 1.1^(3)抗体:单克隆抗体(市售）。
[0019] 2.胶乳:本发明仅示例性的采用直径为80~200nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗 粒(市售)进行实验。
[0020] 本实施例的主要试剂的配制如下： 试剂R1:含1.5%PEG6000(聚乙二醇6000)、95mmol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，该试剂为无 色透明溶液。
[0021] 试剂R2:用抗人Lp(a)抗体致敏粒径为80nm的聚苯乙烯胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶 液。具体步骤如下： 1. 取lml (100mg/ml)胶乳，用0.02M(mo 1 /L)，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗 涤3次，超声分散； 2. 然后加入0.22ml用0.02M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(配制的溶液中EDAC的浓 度为10mg/ml)混合完全，室温混和15min; 3. 然后用0.05M，pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1Μ，ρΗ7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分 散备用； 4. 取2ml抗体（5mg/ml)溶液，加入0.3ml用0.02M，pH7.5的磷酸盐溶液配制，室温混合 15min， 5. 然后加入0.32ml 10 % BSA (小牛血清白蛋白）溶液，4 °C混合4h; 6. 再加入0.4ml 10 %葡萄糖溶液，4 °C混合过夜； 7. 然后用0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液洗涤3次，再加入0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液(含 1 % BSA，0 · 2 % NaN3，15% 庶糖，0 · 01%EDTA-Na2，0 · 0 l%trtonX-l 00 的甘氨酸缓冲液)至胶乳(结 合抗体以后的胶乳重量)终浓度为〇. 18 % (质量体积比即0.18克/100ml)。
[0022]实施例2:Lp(a)的测定 检测工具：日立7060型自动分析仪。
[0023] 分析方法：两点终点法；主波长：570nm，副波长：700nm:样品量：2ul (微升）；R1: 200ul; R2:50ul;反应方向：上升；测定温度：37°C ;样品与R1混匀后，于第10秒读取吸光度 A1;于3~5min时加入R2,于5min后读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的差值。
[0024] 计算方法:多点定标，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可 根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
[0025] 实施例3: Lp(a)检测试剂盒性能评价 1. 分析灵敏度评估 采用5 %牛血清白蛋白溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连 续检测20次，计算20次结果的均值与标准差SD。以空白均值加两倍标准差(+2SD)作为报告 方法的检测限。从表1可见，灵敏度为6.42mg/L。
[0026] 表 1
2. 尚值线性评估 将 1份低值血清（l〇mg/L)和 1份高值血清（1000mg/L)按 9:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1: 4、1:9(样本顺序编号为1~6号），制备出6个不同浓度样本，每个样本重复测定2次，从表2可 见， 本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到901mg/L，判定依据r2 2 0.990。
[0027] 表 2 3. 精密度评估
使用2个不同Lp(a)含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个 批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表 明，本发明检测试剂盒的批内精密度为3.2 %和2.8 % (见表3)，而批间相对极差为3.04 % (见表4)。
[0028] 表 3
4. 准确性(回收实验)评估 选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3份。在其中2份样本中加入不同量的 待测物标准，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本 中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。对回收样本和基础样本进行3次重复测定 分析，取其均值进行计算。（见表5) 表5
5. 干扰试验 在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的 测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率，试验结果表明胆红素、血红蛋白、甘油三 酯以及类风湿性因子的不同浓度以下时，对检测结果无显著干扰（以Lp(a)的回收率在90% ~110%之间为准）。（见表6)。
[0029] 表6
本发明的优点和有益效果： 1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成 本低的优点。
[0030] 2.本发明采用的Lp(a)检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得Lp(a)的检测 更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速 定量检测。
[0031] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施 例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述的试剂R1 为适当的缓冲液； 所述的试剂R2是用Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒置于缓冲液中，所述试剂R2的制 备步骤包括： 步骤（1):在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒(胶乳）中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚 胺(EDAC)，得到激活的胶乳颗粒； 步骤(2):将步骤（1)激活的胶乳颗粒和Lp(a)抗体混合，待反应结束后再加入葡萄糖封 闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球即Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗 粒，置于缓冲液中。2. 根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于:步骤(2)中Lp(a)抗 体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在试剂R2中的浓度为0.08~0.28克/100ml。3. 根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于:所述试剂R1中的缓 冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳 酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液缓冲液中至少一种。4. 根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于:所述试剂R2中的缓 冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳 酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液缓冲液中至少一种。5. 根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于:步骤（1)中乙基二 甲基胺丙基碳化二亚胺:聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为〇. 2~5:100。6. 根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于:所述Lp(a)抗体包 括多克隆抗体或单克隆抗体。7. 根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于:所述步骤（1)中的 聚苯乙烯胶乳颗粒其平均粒径在0.01~0.2mm之间。
【专利摘要】本发明公开了一种脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为的缓冲液；所述的试剂R2为脂蛋白a(Lp(a))抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒与缓冲液的混合物。1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。2.本发明采用的脂蛋白a(Lp(a))检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得脂蛋白a(Lp(a))的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。
【IPC分类】G01N33/92
【公开号】CN105675891
【申请号】CN201610050618
【发明人】陆雪龙, 宋高峰, 李清华, 周裕国
【申请人】宁波天康生物科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月26日