应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法

应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及凝集素亲和材料应用技术领域，涉及到以硅胶为基质，伴刀豆凝集素 concanavalin A(Con A)为配基的亲和材料SG ConA的制备，以标准糖蛋白和糖肽为富集对 象，评价SG Con A的基本性质，应用SG Con A制备ovalbumin糖蛋白或者糖蛋白经过胰蛋 白酶（trypsin)酶解得到的糖肽，并用内切糖苷酶PNGase F(切除与天冬酰胺Asn相连的 聚糖和糖蛋白/糖肽），酶解糖蛋白/糖肽，释放糖链，经过富集得到聚糖，结合质谱表征的 方法鉴定聚糖的结构，并将此评价方法应用于富集实际样品中的糖蛋白或者糖肽。
【背景技术】
[0002] 凝集素（Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋 白或结合糖的蛋白，可以特异性的识别聚糖或者含有聚糖的糖蛋白或者糖肽，并被认为 是破译聚糖构型的密码子（L. Albert, N.Miyako，H. Marina, H. William S·，The Lectin Riddle:Glycoproteins Fractionated from Complex Mixtures Have Similar Glycomic Profiles，A Journal of Integrative Biology，14(2010)487-499·)。因此凝集素亲 和色谱广泛应用于糖蛋白糖肽的富集中，在蛋白质组学的分析中，多种凝集素连用的 技术在复杂样品的分析中发挥着卓越的功能（P. Tatiana，W. Eric，H. William S.，H. Marina, Combination of abundant protein depletion and multi-lectin affinity chromatography (M-LAC)for plasma protein biomarker discovery, J. Proteome Res. ,6 (2007) 662 - 671. ；G. Francisea 0. , H. Brian B. , P. Katie, G. Carolina, H. Marina, H, William S. , Characterization of Glycoproteins in Pancreatic Cyst Fluid Using a High-Performance Multiple Lectin Affinity Chromatography Platform， J. Proteome Res. , 13 (2014) 289 - 299.) 〇
[0003] 在蛋白质的富集策略中，存在自上而下（从蛋白质水平）和自下而上（糖肽水 平）两种富集策略，即使富集后的糖蛋白经过酶解后仍然存在着大量的非糖肽，使得应 用自下而上的富集策略更为广泛（S.Bingyun，R. Jeffrey A.，U.Angelita G.，W. James T.,Y. Xiaowei, L. Biaoyang, H. Leroy, Shotgun Glycopeptide Capture Approach Coupled with Mass Spectrometry for Comprehensive Glycoproteomics， Mol Cell Proteomics， 6(2007) 141-149. )〇
[0004] 在糖肽的质谱鉴定中，由于高强度非糖肽信号峰的存在，严重抑制了糖肽 的分子离子峰的强度，从而衍生出很多的富集材料和富集方法以提高糖肽的检测效 率。除了凝集素亲和色谱方法外，广为流行的富集方法有肼化学法（z. Li juan，J. Hucong, Y. Jun,ff. Yali,F. Caiyun,Y.Pengyuan, L.Haojie,Highly specific enrichment of N_1inked glycopeptides based on hydrazide functionalized solublenanopolymers, chem. commun. , 50(2014) 1027-1029.) 〇 硼酸亲和色谱法 (Boronate affinity chromatography. 2000. 119-128.) 〇 亲水色谱法（￥丄〇邱，1^· Xiuling,G.Zhimou, Z. Xiuli, L. Xinmiao, Hydrophilic interaction chromatography based enrichment of glycopeptides by using click maltose:A matrix with high selectivity and glycosylation heterogeneity coverage. Chemistry-A European Journal, 15 (2009) 12618-12626.)。肼化学法是利用固定于基质上的肼官能团和经高碘酸 钠氧化聚糖得到的醛基反应生成Shiff-base的方法，将聚糖化合物（糖蛋白或者糖肽） 固定于基质上，与非聚糖化合物分离，并再次通过PNGase F酶切聚糖，从基质上释放出蛋白 质或者肽；此方法的优点是可以快速的鉴定出糖蛋白或者糖肽的糖基化位点，缺点是聚糖 被氧化，从而破坏了其构型，不能实现对聚糖构型的解析；
[0005] 硼亲和色谱富集糖蛋白是应用硼酸在酸性条件下和聚糖化合物的邻二醇可逆性 结合，在碱性条件下与聚糖化合物分离的原理实现对糖蛋白糖肽的捕获，该方法的缺点在 于硼酸和聚糖化合物中的邻二醇的结合力十分弱，在富集过程中遗漏部分糖蛋白和糖肽； 亲水色谱由于其对糖化合物的亲水作用，被广泛应用于糖肽的富集中，但此种方法的批次 重复性不高；虽然凝集素亲和色谱和聚糖的结合力不是十分强，由于凝集素对特定构型的 聚糖化合物的特异性识别能力仍备受青睐，并被广泛应用于蛋白质组学的研究中。
[0006] 硅胶基质本身具有亲水性，机械强度高和易于修饰的优点，我们选取硅胶基质的 凝集素亲和材料，评价其基本性质，优化富集条件，在高效液相色谱（HPLC)模式下选择性 的富集糖蛋白和糖肽，其优点是操作简单快捷，所用试剂为环境友好型试剂，经济且环保， 并能够高通量的应用于含有糖蛋白的药物纯化制备中；而对于微量的糖肽，也可以在SPE 模式下应用此方法富集糖肽，结合质谱表征，鉴定出肽段异常糖基化的聚糖结构，半个小时 以内即可得到结果，此检测方法方便快捷有效。

【发明内容】

[0007] 为了更有效的富集糖肽，我们应用凝集素亲和材料分别采用自上而下（糖蛋白质 水平）和自下而上（糖肽水平）的两种富集策略富集糖蛋白或者糖肽；在自上而下（糖 蛋白质水平）的富集过程中，将富集得到的糖蛋白分别经过PNGase F酶切或者胰蛋白酶 (trypsin)酶解并PNGase F酶切释放糖链；在自下而上（糖肽水平）的富集过程中，糖蛋白 首先经过胰蛋白酶（trypsin)酶解得到糖肽，经过凝集素亲和材料富集糖肽后再用PNGase F酶酶切释放糖链；通过亲水材料富集两种策略中释放的糖链，并结合质谱QT0F-ESI-MS 的方法鉴定聚糖的结构；此种方法依据凝集素和聚糖的特异性识别作用，用于富集实际样 品中的糖蛋白或者糖肽，丰富了凝集素亲和色谱在蛋白质组学研究中的应用。应用方法如 下：
[0008] 以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalin A (Con A)为配基，制 备硅胶凝集素亲和材料SG Con A ;
[0009] 其制备特征为：
[0010] a.硅胶预处理：用酸溶液处理硅胶，活化硅胶表面的羟基；
[0011] b.含有双官能团间隔臂的制备：在惰气气氛保护下，室温，将氨丙基烷氧基硅烷 溶于非质子极性溶剂中，加入双官能团试剂，电磁搅拌4~6小时，得到一端含有烷氧官能 团，另一端含有羧基的硅烷试剂中间体；
[0012] 非质子极性溶剂包括：二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二噁烷、二甲亚砜、乙 腈中的一种或二种以上；
[0013] 双官能团试剂中的两个官能团可以相同也可以不同，如丁二酸酐、戊二酸酐、苯甲 酸酐中的一种或二种以上；
[0014] c.双官能团硅烷化试剂修饰硅胶的制备：在惰气气氛保护下，将步骤a处理好的 硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b所得到的产物溶液，加热回流，反应16~48小时；反应 体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯、四氢呋喃、甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在60~ 100°C下干燥12~24小时，得到间隔臂末端含有可活化官能团的硅胶固定相；
[0015] 氨丙基烷氧基硅烷的使用量与所修饰的硅胶用量的对应关系为0. 03~3mmol氨 丙基烷氧基硅烷/g娃月父；
[0016] d.凝集素Con A键合硅胶亲和材料的制备：在惰气气氛保护下，将上述经过合成 的烷氧基硅烷化试剂修饰后的硅胶SG固定相加入无水有机溶剂或者不含有一级氨基的缓 冲盐溶液中，加入活化官能团试剂，室温反应2~4小时，减压抽滤，用不含有一级氨基的缓 冲盐溶液洗涤并将所得固定相重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液置于玻璃容器中；
[0017] 活化官能团的试剂为1-(3-二甲氨基丙基）-3乙基碳二亚胺（EDCI)、EDCI/N-羟 基琥珀酰亚胺（NHS)中的一种或二种以上；
[0018] 不含有一级氨基的缓冲盐溶液为磷酸盐（PBS)缓冲溶液、2-(N-吗啡啉）乙磺酸 (MES)缓冲溶液、N-2-羟乙基哌嗪W -2-乙基磺酸（HEPES)缓冲溶液中的一种；
[0019] 在惰气气氛保护下，将凝集素与和凝集素有特异性结合的糖溶解于不含有一级氨 基的缓冲盐溶液中，加入上述的硅胶缓冲盐溶液中，4~25°C搅拌4~24小时，然后加入含 有一级氨基的试剂，对未反应完全的活化基团封尾2~4小时，离心，收集固体，得到键合有 凝集素的硅胶亲和材料；
[0020] -级氨基试剂可以为三羟甲基氨基甲烷、氨基乙醇和BSA缓冲溶液中的一种或两 种以上。
[0021 ]