层流扩散电喷雾质谱装置及快速获取连续pH下蛋白质构象的方法
【专利摘要】本发明公开了一种层流扩散电喷雾质谱装置及快速获取连续pH下蛋白质构象的方法，该装置由第一进样针、第一恒流注射泵、直立层流管、质谱检测器、流通阀、第二恒流注射泵、第二进样针组成，采用该装置能够实现连续快速变化的pH条件下蛋白质的电喷雾质谱检测。本发明装置结构简单，样品消耗量少，能够提供任意pH下溶液相中蛋白质的全貌构象信息，且获得蛋白质全貌构象信息的整个过程只需要几分钟，同时该装置可用于在溶液相中寿命非常短暂的蛋白质构象的研究，为研究蛋白质构象变化的快速动力学过程提供了新方法。
【专利说明】
层流扩散电喷雾质谱装置及快速获取连续pH下蛋白质构象的 方法
技术领域
[0001] 本发明属于质谱检测技术领域，具体涉及一种层流扩散电喷雾质谱装置，以及采 用该装置快速获取连续pH下蛋白质构象的方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质作为生命的物质基础，在维持生命体的生理功能上起着至关重要的作用。 天然蛋白质以特定的氨基酸序列折叠成一个三维结构，通常被称为蛋白质的构象。蛋白质 只有通过正确地折叠和组装才能在生命体中发挥正常的生物学功能。一旦蛋白质发生错误 折叠和聚合(或淀粉样纤维的形成），不仅会丧失其生物活性，还有可能导致神经衰退性疾 病的发生。因此研究蛋白质构象变化具有重要意义，而且这些细节性的构象信息往往可以 为蛋白质的折叠机制研究提供依据，但前提是必须能够准确获取连续变化的蛋白质构象。
[0003] 溶液中蛋白质分子的构象不仅受到肽链内部和肽链之间相互作用的影响，而且也 取决于肽链和溶剂分子的相互作用。除此之外，还有很多因素可以影响溶液中蛋白质的构 象，例如溶液酸碱度、盐(金属)离子、溶剂种类和缓冲液种类等。调节溶液的pH促使蛋白质 发生构象变化是一个较为普遍的改变溶液相蛋白质构象的方法。
[0004] W.Braun等人（Proc.Natl .Acad. Sci.USA.1992,89(21) :10124-10128 ;Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy.2014,82:27-38·)常用X-射线晶体衍射 法和核磁共振技术来研究大分子的构象变化，但这些方法或多或少都有其适用的限制条 件。X-射线晶体衍射法研究大分子构象的前提是需要获得待测分析物的晶体，但是有些蛋 白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的晶体，而且X-射线晶体衍射法不能 测定不稳定的过渡态的构象。核磁共振技术中要求待测物质的浓度最好在毫摩尔/升的浓 度水平以上，消耗样品量大。
[0005] 电喷雾质谱技术因其"软"电离特性和灵敏度高的特点为蛋白质构象变化研究提 供了一个很好的选择。在采用电喷雾质谱方法研究pH改变如何影响溶液相中蛋白质的构象 变化时，pH选择几乎都是一些不连续变化的数值，这些离散的pH并不能提供蛋白质构象随 pH变化的全貌。研究表明很多蛋白质都存在复杂的折叠中间体(J Mol Biol. 1998,276(2): 491-504.)，即除了折叠态和去折叠态外，还有可能存在两种状态之间的过渡态，而这些细 节信息也只有在采用尽量细化pH的间距并考察其对蛋白质构象的细致影响才可以获得 (Anal Chem. 2007，79(11):4154-4161 .)，但这些细节信息往往可以为蛋白质的折叠机制研 究提供依据。传统的电喷雾质谱方法在研究溶液相中蛋白质构象时存在一个限制：蛋白质 在溶液中的构象必须是稳态的。然而研究表明蛋白质的构象变化很多时候是一个快速动力 学过程（Nat .Struct .Biol. 1998,5(2): 148-155 ;Int.J.Mol .Sci .2013,14(7): 14287-14300.)，有些蛋白质的寿命极为短暂，并且在一些条件下发生的非特异性的聚合也会影响 电喷雾质谱方法对蛋白质构象的检测。基于以上分析，在采用电喷雾质谱作为检测手段考 察pH对溶液相中蛋白质构象的影响时，极其需要一种能够快速、准确、连续的pH变化的方 法。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种结构简单、样品消耗量少的层流扩散电 喷雾质谱装置，以及采用该装置快速、准确的获取连续pH下蛋白质构象的方法。
[0007] 解决上述技术问题所采用的技术方案是：在第一恒流注射栗上设置有第一进样 针，在第二恒流注射栗上设置有第二进样针，第一恒流注射栗和第二恒流注射栗分别通过 连接管与流通阀相联通，流通阀通过连接管与直立层流管相联通，所述的直立层流管的内 径为40~100μπι，长度为30~80cm，直立层流管通过连接管与质谱检测器相连接。
[0008] 上述的流通阀优选三通阀。
[0009] 上述的质谱检测器优选电喷雾液质联用四级杆飞行时间质谱。
[00? 0]上述直立层流管的内径优选80μηι，长度优选50cm，其材质为聚醚醚酮。
[0011] 采用上述层流扩散电喷雾质谱装置获取连续pH下蛋白质构象的方法由下述步骤 组成：
[0012] 1、向乙酸铵缓冲液中加入甲酸或氨水，配制成pH值小于7或大于7的乙酸铵缓冲 液，然后向第一进样针和第二进样针中分别注入pH值不大于7或不小于7的乙酸铵缓冲液， 且第一进样针和第二进样针中缓冲液的pH值不同。
[0013] 2、打开流通阀，使第一恒流注射栗与直立层流管相连通，待第一进样针中缓冲液 充满直立层流管后，立即将流通阀与第二恒流注射栗相连通，使第二进样针中的缓冲液流 入直立层流管中，控制第二进样针的进样流速v为2~lOyL/min，根据下述公式（1)计算由第 二进样针进入直立层流管的缓冲液的最大流速v max，单位m/s。
(1)
[0015] 式中R为直立层流管的内径，单位m。
[0016] 第二进样针中的缓冲液沿着直立层流管轴向方向扩散，采用matlab 12.0根据下 述公式计算层流扩散时间t时，直立层流管上出口截面处溶液中甲酸或NH3 · H20的浓度C (t)：
[0018] 式(2)中，CQ为第二进样针中甲酸或NH3 · H2O的初始浓度，单位mol/L，t的单位为s， XI、k和erf分别根据下述公式(3)~(5)计算：
[0022]式（3)中L代表直立层流管的长度，单位m;式(4)中D代表扩散系数，D = 1.0X1(T (6.) 9m2/s;式(5)中的z根据公式(6)计算：
[0024]当第一进样针和第二进样针中的缓冲液pH值均不大于7时，采用matlab 12.0根据 下述公式(7)计算层流扩散时间t时，直立层流管上出口截面处溶液中H+浓度：
[0026] 式中Ka(HA)、\(册4+丨、Ka(HAc)、心册3!分别代表甲酸、順4+、HAc、順3的解尚常数，K w代表 水的离子积常数，CHA=C(t)，代表乙酸铵的初始浓度；
[0027] 当第一进样针和第二进样针中的缓冲液pH值均不小于7时，根据下述公式(8)~ (9)计算层流扩散时间t时，直立层流管上出口截面处溶液中H+浓度：
[0030] 式(8)中1^代表水的离子积常数，111(_财4+|、1〇^)分别代表順4 +、说〇的解离常数，(3总 为乙酸铵和NH3 · H20浓度的总和，CAc-代表乙酸的初始浓度，％代表乙酸铵的初始浓度。
[0031] 根据层流扩散时间t时直立层流管上出口截面处溶液中H+浓度，即可得到直立层 流管上出口截面处溶液pH随层流扩散时间t的变化曲线。
[0032] 3、将待测蛋白质加入第一进样针或第二进样针的缓冲液中，打开流通阀，使第一 恒流注射栗与直立层流管相连通，待第一进样针中溶液充满直立层流管后，立即将流通阀 与第二恒流注射栗相连通，使第二进样针中的溶液流入直立层流管中，控制第二进样针的 进样流速v与步骤(2)相同，采用质谱检测器记录层流扩散时间t时的离子流色谱图和质谱 图，结合直立层流管上出口截面处溶液pH随层流扩散时间t的变化曲线，即可获得连续pH下 蛋白质的构象。
[0033] 本发明基于溶液层流扩散理论和扩散流路的搭建，通过氢离子的层流扩散在流动 体系里形成快速并且连续的pH变化，结合电喷雾质谱优点，提出一种基于层流扩散电喷雾 质谱快速获取连续pH下蛋白质构象的装置及方法，该装置采用直立层流管减少了重力对层 流轮廓的不均匀影响并且减小了因阀突然转动引起的溶液泄露的可能性。相对于现有技 术，本发明的有益效果如下：
[0034] 1、本发明实现了在连续快速变化的pH条件下对蛋白质的电喷雾质谱的检测，能够 得到任意pH下溶液相中蛋白质的全貌构象信息。
[0035] 2、本发明方法消耗蛋白质的用量只需要几十个微升，而常规方法中每个pH都至少 需要十几个微升的样品。
[0036] 3、本发明获得蛋白质全貌构象信息的整个过程只需要几分钟，而传统的方法(离 散pH)获得单个pH下蛋白质构象的检测就需要几分钟。
[0037] 4、更为重要的是，本发明方法能够获得溶液相中蛋白质构象随pH变化的全貌信 息，同时可用于那些在溶液相中寿命非常短暂的蛋白质的构象研究，也为研究蛋白质构象 变化的快速动力学过程提供了新方法。
【附图说明】
[0038]图1是本发明层流扩散电喷雾质谱装置的结构示意图。
[0039 ]图2是实施例1中直立层流管3上出口截面处pH随层流扩散时间t的变化曲线图。 [0040]图3是pH = 7的脱辅基肌红蛋白质溶液向pH=2的乙酸铵缓冲液中扩散的归一化电 喷雾质谱随层流扩散时间t的变化图。
[0041 ]图4是pH = 7的脱辅基肌红蛋白质溶液向pH=7的乙酸铵缓冲液中扩散的归一化电 喷雾质谱随层流扩散时间t的变化图。
[0042]图5是pH = 7的脱辅基肌红蛋白质溶液向pH = 2的缓冲溶液中扩散以及pH = 7.0的 脱辅基肌红蛋白质溶液向pH=7.0的缓冲溶液中扩散的平均电荷的变化曲线图。
[0043] 图6是采用经典方法获得的脱辅基肌红蛋白质溶液在不同pH的归一化电喷雾质谱 图。
[0044] 图7是细胞色素C蛋白质溶液的归一化电喷雾质谱图随层流扩散时间t的变化图。
[0045] 图8是还原性溶菌酶蛋白质溶液的归一化电喷雾质谱图随层流扩散时间t的变化 图。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0047] 实施例1
[0048] 如图1所示，本实施例的层流扩散电喷雾质谱装置由第一进样针1、第一恒流注射 栗2、直立层流管3、质谱检测器4、流通阀5、第二恒流注射栗6、第二进样针7组成。
[0049] 第一恒流注射栗2上设置有第一进样针1，第二恒流注射栗6上设置有第二进样针 7,第一恒流注射栗2和第二恒流注射栗6分别通过连接管与流通阀5相联通，流通阀5为三通 阀。流通阀5通过连接管与直立层流管3相联通，直立层流管的材质为聚醚醚酮，其内径为80 μπι、长度为50cm。直立层流管3通过连接管与质谱检测器4相连接，质谱检测器4是电喷雾液 质联用四级杆飞行时间质谱。
[0050] 采用上述层流扩散电喷雾质谱装置获取连续pH下脱辅基肌红蛋白质构象的方法 如下：
[00511 1、向0.01 mo 1/L pH=7的乙酸铵缓冲液中加入甲酸，配制成pH值为2的乙酸铵缓冲 液(其中甲酸的浓度为1.2mo 1 /L)，然后向第一进样针1中注入pH值为2的乙酸铵缓冲液，向 第二进样针7中注入0.01 mo 1/L pH=7的乙酸铵缓冲液。
[0052] 2、打开流通阀5，使第一恒流注射栗2与直立层流管3相连通，待第一进样针1中缓 冲液充满直立层流管3后，立即将流通阀5与第二恒流注射栗6相连通，使第二进样针7中的 缓冲液流入直立层流管3中，控制第二进样针7的进样流速v为5yL/min，根据下述公式（1)计 算由第二进样针7进入直立层流管3的缓冲液的最大流速v max，单位m/s;
⑴
[0054] 式中R为直立层流管的内径，单位m。
[0055] 第二进样针7中的缓冲液沿着直立层流管3轴向方向扩散，采用matlab 12.0根据 下述公式(2)计算层流扩散时间t时，直立层流管3上出口截面处溶液中甲酸的浓度c(t):
[0057]式(2)中，co为第二进样针7中甲酸的初始浓度，X1、k和erf分别根据下述公式(3)_ (5)计算：
[0061 ]式(3)中L代表直立层流管3的长度，式(4)中D代表扩散系数，D = 1.0 X 1 (T9m2/s，式 (5)中的z根据公式(6)计算：
(6)
[0063]采用matlab 12.0根据下述公式(7)计算层流扩散时间t时，直立层流管3上出口截 面处溶液中H+浓度：
[0065] 式中 Ka (HA)、、Ka (HAc)、灰6(,?%:)分别代表甲酸、顯4+、HAC、順3 的解尚常数，CHA = C (t)，代表乙酸铵的初始浓度;计算结果见表1。
[0066] 表1直立层流管3上出口截面处溶液中甲酸浓度及溶液的pH
[0068]根据层流扩散时间t时直立层流管3上出口截面处溶液中H+浓度，即可得到直立层 流管3上出口截面处溶液pH随层流扩散时间t的变化曲线，其中t从1.50min到2.83min的变 化结果见图2。
[0069] 3、将脱辅基肌红蛋白质加入第二进样针7内0.01 mol/L pH=7的乙酸铵缓冲液中， 使缓冲液中脱辅基肌红蛋白质的浓度为5wii〇 1/L，打开流通阀5，使第一恒流注射栗2与直立 层流管3相连通，待第一进样针1中pH值为2的乙酸铵缓冲液充满直立层流管3后，立即将流 通阀5与第二恒流注射栗6相连通，使第二进样针7中含脱辅基肌红蛋白质的缓冲液流入直 立层流管3中，控制第二进样针7的进样流速v为5yL/min，采用质谱检测器4(ESI正离子模 式，Z型电喷雾离子源，锥气和脱溶剂气体流速分别为60L/h和500L/h，毛细管电压3. OkV，脱 溶剂温度200°C，离子源温度80°C，采样锥电压为40V，射频透镜1电压为30V，所有的实验都 在室温(22±TC)条件下进行)记录不同层流扩散时间t时，pH=7的脱辅基肌红蛋白质溶液 向pH = 2的乙酸铵缓冲液中扩散的离子流色谱图和质谱图，其归一化电喷雾质谱图谱见图 3。结合图2中直立层流管3上出口截面处溶液pH随时间t的变化曲线，即可获得连续pH下蛋 白质的构象。
[0070] 同时将第一进样针1中pH值为2的乙酸铵缓冲液用0.01 mol/L pH=7的乙酸铵缓冲 液替换，其他步骤与上述步骤2和3相同，得到不同层流扩散时间t时pH=7的脱辅基肌红蛋 白质溶液向pH=7的乙酸铵缓冲液中扩散的归一化电喷雾质谱图4。
[0071] 图3和4中每个质谱图谱都对应一个平均电荷(qavg)，以层流扩散时间t为横坐标， 以平均电荷q avg为纵坐标，从而获得反映质谱图谱轮廓的一个重要参数平均电荷随扩散进 程的变化规律，见图5。由图5可见，对于pH = 7的脱辅基肌红蛋白质溶液向pH=7的缓冲液中 扩散，平均电荷不受扩散进程的影响，基本保持不变（10左右）；而对于pH=7的脱辅基肌红 蛋白质溶液向pH=2的缓冲液中扩散，平均电荷开始迅速下降，最后基本保持不变（10左 右），说明随着扩散的进行，蛋白质的电喷雾质谱图谱随扩散时间发生了显著改变，而且是 按照一定规律的变化，高荷电的信号越来越弱，低荷电的信号越来越强，这都和溶液中蛋白 质分子构象的变化紧密关联，反映了大部分蛋白质分子逐渐从去折叠状态向折叠状态过 渡。
[0072] 在以上方法中，时间t = 2.014min、2.255min、2.441min(见图2)对应的pH分别为 2.31、4.59及6.86，其电喷雾质谱图谱(见图3)显示这三个时间点对应的电喷雾质谱图谱和 由经典方法（S· Vahidi，Β·B· Stocks，Y. Liaghati-Mobarhan，et al .Mapping pH-Induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry[J] .Anal .Chem.2012,84(21) :9124-9130.)获得的电喷 雾质谱图谱轮廓(见图6)吻合完好，说明采用本发明装置获取蛋白质构象的方法是准确可 靠的。
[0073] 实施例2
[0074]本实施例中层流扩散电喷雾质谱装置与实施例1相同。采用该装置按照实施例1的 方法获取连续pH下细胞色素C蛋白质溶液的电喷雾质谱图谱，结果见图7。由图7可见，随着 直立层流管3中pH=7的细胞色素C蛋白质溶液向pH=2的缓冲液中不断扩散，电喷雾质谱中 的离子源喷出的液滴逐渐从强酸性(pH=2)过渡到弱酸性(pH=4)、中性(pH=7)，溶液相中 细胞色素C蛋白质的构象也从去折叠构象占主体逐渐过渡到折叠构象占主体，该结果和文 献报道（J Am Soc Mass SpectromJOHJSMhlSSS-lSSUAnal.ChemJOlSJTJASA-Sdd〗 ） 一致 。本发 明方法还可以观察到 pH= 2 到 pH= 7 期间任何一个 pH下的电 喷雾质谱图谱 (比如口11=4.34 = 2.25〇1^11)，从而可得到其溶液相中细胞色素(：蛋白质的构象信息。
[0075] 实施例3
[0076]本实施例中层流扩散电喷雾质谱装置与实施例1相同。采用该装置获取连续pH下 还原性溶菌酶蛋白质构象的方法如下：
[0077] 1、向0 · 0 lmo 1 /L pH = 7的乙酸铵缓冲液中加入氨水，配制成pH值为10的乙酸铵缓 冲液，然后向第一进样针1中注入0.0 lmo 1 /L pH=7的乙酸铵缓冲液，向第二进样针7中注入 pH值为10的乙酸铵缓冲液。
[0078] 2、按照实施例1步骤2的方法，先计算c(t)，然后采用matlab 12.0根据下述公式 (8)~(9)计算层流扩散时间t时，直立层流管3上出口截面处溶液中H+浓度：
[0081]式(8)中1代表水的离子积常数，l_:)、Ka(HAc)分别代表NH4+、HAc的解离常数，c总 为乙酸铵和NH3 · H20浓度的总和，CAc-代表乙酸的初始浓度，^?^代表乙酸铵的初始浓度。 [0082]根据层流扩散时间t时直立层流管3上出口截面处溶液中H+浓度，即可得到直立层 流管3上出口截面处溶液pH随层流扩散时间t的变化曲线。
[0083] 3、将还原性溶菌酶蛋白质加入第一进样针1内0.01m〇l/L pH = 7的乙酸铵缓冲液 中，使缓冲液中还原性溶菌酶蛋白质的浓度为5ymol/L，按照实施例1步骤3的方法获取不同 层流扩散时间t时，pH= 10的乙酸铵缓冲液向含还原性溶菌酶蛋白质的pH = 7的乙酸铵缓冲 液中扩散的离子流色谱图和质谱图，其归一化电喷雾质谱图谱见图见图8。结合直立层流管 3上出口截面处溶液pH随时间t的变化曲线，即可获得连续pH下蛋白质的构象。
[0084]由图8可见，随着扩散的进行，还原性溶菌酶蛋白质溶液的碱性增强，其与去折叠 构象对应的高荷电的信号越来越低，直到最后消失，而与折叠构象对应的低荷电的信号受 到的影响要相对弱得多，说明还原性溶菌酶蛋白质分子间的聚合首先从去折叠的构象开 始，最后折叠构象也由于平衡移动最终聚合形成尺寸显著的聚合物，该结论和文献 (Int.J.Mol.Sci.2013,14(7):14287-14300；Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2003,100(26), 15463-15468·)中的推测一 致，这也是首次得到还原性溶菌酶蛋白质溶液在pH=10下的电喷雾质谱图谱，也是首次采 用电喷雾质谱手段观察到还原性溶菌酶蛋白质分子在碱性发生聚合沉淀前溶液相中的构 象变化过程。
【主权项】
1. 一种层流扩散电喷雾质谱装置，其特征在于:在第一恒流注射栗(2)上设置有第一进 样针（1)，在第二恒流注射栗(6)上设置有第二进样针(7)，第一恒流注射栗(2)和第二恒流 注射栗(6)分别通过连接管与流通阀（5)相联通，流通阀（5)通过连接管与直立层流管(3)相 联通，所述的直立层流管（3)的内径为40~100μπι，长度为30~80cm，直立层流管（3)通过连 接管与质谱检测器(4)相连接。2. 根据权利要求1所述的层流扩散电喷雾质谱装置，其特征在于:所述的流通阀（5)为 三通阀。3. 根据权利要求1所述的层流扩散电喷雾质谱装置，其特征在于：所述的质谱检测器 (4)是电喷雾液质联用四级杆飞行时间质谱。4. 根据权利要求1所述的层流扩散电喷雾质谱装置，其特征在于：所述的直立层流管 (3)的内径为8(^111，长度为50〇11 〇5. 根据权利要求1所述的层流扩散电喷雾质谱装置，其特征在于：所述的直立层流管 (3)的材质为聚醚醚酮。6. 采用权利要求1所述的层流扩散电喷雾质谱装置获取连续pH下蛋白质构象的方法， 其特征在于它由下述步骤组成： (1) 向乙酸铵缓冲液中加入甲酸或氨水，配制成pH值小于7或大于7的乙酸铵缓冲液，然 后向第一进样针（1)和第二进样针(7)中分别注入pH值不大于7或不小于7的乙酸铵缓冲液， 且第一进样针(1)和第二进样针(7)中缓冲液的pH值不同； (2) 打开流通阀（5)，使第一恒流注射栗(2)与直立层流管(3)相连通，待第一进样针（1) 中缓冲液充满直立层流管(3)后，立即将流通阀（5)与第二恒流注射栗(6)相连通，使第二进 样针（7)中的缓冲液流入直立层流管（3)中，控制第二进样针（7)的进样流速V为2~IOyL/ min，根据下述公式（1)计算由第二进样针(7)进入直立层流管(3)的缓冲液的最大流速vmax， 单位m/s;Cl) 式中R为直立层流管的内径，单位m;第二进样针(7)中的缓冲液沿着直立层流管(3)轴向方向扩散，采用matlabl2.0根据下 述公式(2)计算层流扩散时间t时，直立层流管(3)上出口截面处溶液中甲酸或NH3 · H2O的浓 度c，十、. (2)式（2)中，Co为第二进样针（7)中甲酸或NH3 · H2O的初始浓度，单位mol/L，t的单位为s， Xi、k和erf分别根据下述公式⑶~（5)计算： (3) (4) (5) 式(3)中L代表直立层流管(3)的长度，单位m;式(4)中D代表扩散系数，D = 1.0 X I(r9m2/ s;式(5)中的z根据公式(6)计算：(6) 当第一进样针（1)和第二进样针(7)中的缓冲液pH值均不大于7时，采用matlab 12.0根 据下述公式(7)计算层流扩散时间t时，直立层流管(3)上出口截面处溶液中H+浓度：式中Ka(HA)、aW册>、Ka(HAc)、&(λ抑分别代表甲酸、NH4 +、HAc、NH3的解离常数，Kw代表水的 离子积常数，CHA = c (t)，代表乙酸铵的初始浓度； 当第一进样针（1)和第二进样针(7)中的缓冲液pH值均不小于7时，根据下述公式(8)~ (9)计算层流扩散时间t时，直立层流管(3)上出口截面处溶液中H+浓度：式(8)中1^代表水的离子积常数，K"(〇、Ka(HAc)分别代表NH4+、HAc的解离常数，c总为乙 酸铵和NH3 · H2O浓度的总和，CAc-代表乙酸的初始浓度，Cjw4a代表乙酸铵的初始浓度； 根据层流扩散时间t时直立层流管（3)上出口截面处溶液中H+浓度，即可得到直立层流 管(3)上出口截面处溶液pH随层流扩散时间t的变化曲线； (3)将待测蛋白质加入第一进样针（1)或第二进样针(7)的缓冲液中，打开流通阀（5)， 使第一恒流注射栗(2)与直立层流管(3)相连通，待第一进样针（1)中溶液充满直立层流管 (3)后，立即将流通阀（5)与第二恒流注射栗(6)相连通，使第二进样针（7)中溶液流入直立 层流管(3)中，控制第二进样针(7)的进样流速V与步骤(2)相同，采用质谱检测器(4)记录层 流扩散时间t时的离子流色谱图和质谱图，结合直立层流管(3)上出口截面处溶液pH随层流 扩散时间t的变化曲线，即可获得连续pH下蛋白质的构象。
【文档编号】G01N27/62GK106018540SQ201610545563
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】岳宣峰, 张智娟, 刘少贤, 尚晓
【申请人】陕西师范大学