一种lc-ms/ms测定食品中亮黑和罗丹明b的方法
【专利摘要】本发明公开了一种LC?MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法。本发明首先对样品进行粉碎、水浴加热提取、离心、上清液调酸后，再利用自组装的固相萃取净化小柱(阳离子交换填料+阴离子交换填料)对样品提取液进行净化处理，可在有效除去干扰物的同时实现对亮黑的净化、富集，并采用LC?MS/MS定量测定。该方法操作简单，净化效果好，灵敏度高，重现性好，符合食品添加剂分析标准，具有一定的新颖性和适用性。
【专利说明】
一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种食品中人工着色剂的测定方法，具体涉及一种食品中亮黑和罗丹 明B的固相萃取/LC-MS/MS方法。
【背景技术】
[0002] 人工合成着色剂是通过化学合成的方法生产的有机色素，主要以苯、甲苯、萘等芳 烃类化工产品为原料，经过磺化、卤化、偶氮化等一系列有机反应化合而成。其成本低廉、色 泽鲜艳、着色力强、性能稳定，在食品生产加工行业中被广泛应用。但人工合成着色剂大多 为偶氮类化合物，过量食用可对人体有致畸致癌作用。近年来，为了加强对食用合成着色剂 的管理，许多国家对食用合成色素的理化性质及安全性做了深入细致的研究，明确限定了 食用合成色素的使用品种、使用范围及使用量。联合国粮食及农业组织规定了亮黑PN INS151在不同食品基质中使用范围为12~500mg/kg;欧盟94/36/EC及(EU)No 1274/2013号 法规规定"加工鱼和水产品，包括软体动物和甲壳纲动物中可以使用E 151亮黑PN"，最大使 用量为250mg/kg;香港食品色素使用法规Chapter 132H允许使用亮黑，未规定限量;美国、 加拿大、日韩等国则严禁在加工食品中使用亮黑和罗丹明B，我国GB 2760-2014《食品安全 国家标准食品添加剂使用标准》批准使用的着色剂亦不包含亮黑和罗丹明B(玫瑰红B)。
[0003] 亮黑，中文名称食品黑1，英文名Brilliant black，分子式C28H17N5Na4〇i4S4，CAS号： 2519-30-4，目前主要用作化工染料。罗丹明B在溶液中有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧 光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。由于亮黑和罗丹明B价格低廉，可能存在不法商 人违规添加入食品中的问题。为了保障消费者的利益，需要对其进行检测。
[0004] 目前，国内外用于亮黑和罗丹明B的检测方法主要有高效液相色谱法。肖海龙等提 出了一种测定食品中亮黑等18种合成着色剂的HPLC方法（肖海龙，屠海云，等.反相高效液 相色谱法快速测定食品中18种水溶性合成着色剂[J].中国卫生检验杂志，2011，21 (2): 264-266"）；邵仕萍等用HPLC检测了亮黑等5种色素(邵仕萍，奚星林，等.饮料和糖果中5种 非法添加色素的检测[J].食品科学，2011，32(4): 189-192"）；杨建龙等用LC-MS/MS同时测 定朱砂中掺假染料猩红808和玫瑰红B，它是针对矿物基质的，前处理净化方法在该文献中 未有报道(杨建龙，谭纹.LC-MS/MS同时测定朱砂中掺假染料猩红808和玫瑰红B的含量[J]. 中国现代应用药学，2015,8(32):979-983)。液相色谱法是食品中人工合成着色剂检测应用 最广泛的方法，但是缺乏配套的确证技术，无法满足复杂的食品基质中目标物的定性确证 要求。已报道的检测食品中合成着色剂的LC-MS/MS方法，只涉及部分着色剂且无普适的前 处理净化手段。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗 丹明B的方法。该方法对样品的提取、SPE柱净化、LC-MS/MS定量检测食品中亮黑和罗丹明B 的方法进行了研究，结果表明该方法灵敏度高，重现性好，操作简单，可广泛应用于食品中 亮黑和罗丹明B的检测。
[0006] 本发明所采用的技术方案为:一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法，其 特征在于，包括以下步骤：
[0007] (1)制备:取具有代表性样品粉碎、搅拌均匀密封标识，待用；
[0008] (2)提取：取步骤（1)样品，置于离心管中，加入超纯水，于50-70°C水浴超声提取 10-30min，于离心机中4000r/min离心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液调试pH值至3-6,得待净化溶液；
[0009] (3)净化：
[0010] a、固相萃取小柱的组装：取40-60μπι阳离子交换填料和40-60μπι阴离子交换填料， 填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内，填料上端再以聚乙烯筛板固定；
[0011] b、柱活化:将上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化；
[0012] c、加样淋洗:转移上述待净化溶液至固相萃取小柱，依次用pH值3-6的水、甲醇淋 洗SPE柱；
[0013] d、洗脱：低真空吹干SPE柱，用氨化甲醇洗脱待分析成分并接收，收集液于50°C氮 气吹干，加水溶解，涡流混合后过0.22μπι滤膜，供LC-MS/MS分析；
[0014] (4)检测:步骤(3)得到的待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定。
[0015] 优选的，具体包括以下步骤：
[0016] (1)制备:取具有代表性试样500g粉碎、搅拌均匀，密封标识，待用。
[0017] (2)提取：取步骤（1)样品10g，置于50mL离心管中，加入25mL超纯水，于50-70°C水 浴超声提取10-30min，于离心机中4000r/min离心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液调 试pH值至3-6，得待净化溶液；
[0018] ⑶净化：
[0019] a、固相萃取小柱的组装:取40_80mg 4〇-60μηι阳离子交换填料和40_80mg 4〇-60μηι 阴离子交换填料，填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内，填料上端再以聚乙烯筛板固 定；
[0020] 所述的阳离子交换填料为选自苯磺酸键合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PCX)、苯磺 酸键合硅胶(SCX)、丙磺酸键合硅胶(PRS)中的至少一种;优选PCX填料；
[0021] 所述的阴离子交换填料为选自聚酰胺(pa)、nh2氨丙基键合硅胶、多胺化聚苯乙烯 二乙烯苯共聚物(PWAX)填料中的至少一种;优选PWAX填料；
[0022] 所述的阳离子交换填料和阴离子交换填料的比例为重量比1:0.5~1:2;优选1:1; [0023] 进一步优选，采用60mgPCX+60mgPWAX/6mL自行填制净化萃取柱对样品进行净化处 理；
[0024] b、柱活化:将上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化；
[0025] c、加样淋洗:转移上述待净化溶液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3-6 的水、4-8mL甲醇淋洗SPE柱；
[0026] d、洗脱:低真空吹干SPE柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇(优选5%氨化甲醇)洗脱 待分析成分并接收，收集液于50 °C氮气吹干，用水定容至1. OmL，涡流混合后过0.22μπι滤膜， 供LC-MS/MS分析；
[0027] (4)检测:步骤(3)得到的待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定。
[0028] 优选的，所述步骤(4)中液相色谱-串联四级杆质谱的仪器参数条件如下： ???'ι }']： Thermo Syncrortis Cl8 [??ΗΙ：； 3.0μηι, 150mnr<2Jnim 流动相 甲醇(A)，5 mmol乙酸铵水溶液(B) 流速 0.25 mL/niin 进样量 5μL 柱温 30'C
[0029] 梯度洗脱程序时间(min) A(%) B(%) 0.00 5 95 5.00 95 5 9.00 95 5 9.10 5 95 15.00 5 95
[0030] 质谱条件为： 离子源 电喷雾离子源 扫描方式 ESI源正负离子分段扫描模式
[0031] 监测方式 多反应监测(MRM) 电喷雾电压(IS) 4500 ￥ 离子源温度(TEM) 500 ?
[0032] 获 ^流速 15L/min 雾化器压力 45 psi
[0033] 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量为：
[0034] 名称 保留时间Cmin> 母:离子 子离子 去簇电压EtP〇)碰撞能CE(>) 亮黑 ?Μ 778.0 291.0*,732.0 -214 -55.-43 11 6- 443.1 390.1^,355.0 100 58, 80
[0035] 本发明的有益效果：
[0036] 本发明对食品中亮黑和罗丹明B的含量检测进行了研究，样品经超纯水水浴超声 提取后，用自组装固相萃取小柱净化，采用LC-MS/MS同步定量测定。该方法可实现性质不同 的人工合成着色剂一次过柱萃取净化、一次色谱过程定量分析，操作简单、灵敏度高、重现 性好、准确率较高。可广泛应用于复杂食品基质中亮黑和罗丹明B的准确定量分析，操作简 单、灵敏度高、重现性好。
[0037] 本发明利用自组装的固相萃取净化小柱对样品提取液进行净化处理，且采用阴离 子填料和阳离子填料按一定比例混装的方式制成固相萃取小柱，可在有效除去干扰物的同 时实现对不同性质人工合成着色剂的净化、富集，方法灵敏度、准确度和精确度均符合食品 添加剂分析标准，具有一定的新颖性和适用性。同时上述方式，相比采用两根不同的固相萃 取柱分开萃取的方式，节省了时间和成本。且本发明自组装小柱，可以根据样品中色素含量 适当调整填料的粒径和用量，方便适用。本发明首次使用PWAX柱进行固相萃取，它的吸附容 量大，萃取效果好。
[0038]本发明的方法中，亮黑和罗丹明B同时进行提取、净化等前处理(本发明的亮黑和 罗丹明B为非同系物，由于不同物质的性质不同，在提取的过程中，很难把所有目标物都提 取完全，但是，本发明的方法，同时提取、净化，并且亮黑和罗丹明B提取比较完全，实施例中 的回收率就可以说明这点），并且一次上机检测，节约时间和成本。
【附图说明】
[0039]图1为甲醇+5mmol乙酸铵水溶液亮黑和罗丹明B的MRM色谱图；
[0040] 图2亮黑和罗丹明B特征离子对色谱图；
[0041] 图3烤肉调味料样品中亮黑和罗丹明B的MRM色谱图；
[0042] 图4烤肉调味料加标样品中亮黑和罗丹明B的MRM对色谱图；
[0043] 图5是实施例1的分析色谱图（调味料）；
[0044] 图6是实施例2的分析色谱图（水果糖）。
【具体实施方式】
[0045] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。
[0046] 1仪器与试剂
[0047] 液相色谱串联质谱仪：Aglientl200高效液相色谱仪，API4000质谱仪（美国AB SCIEX) ;MS3涡流混匀器（IKA公司）；恒温超声水浴（IKA公司）；高速冷冻离心机（日本日立公 司）；感量为〇· lmg的分析天平(瑞士梅特勒公司）;Milli-Q纯水器(美国Millipore公司）;N-EVAP24氮吹仪(美国）；量程为10-100yL、100-1000yL移液枪(Eppendof公司）。
[0048] 亮黑、罗丹明B标准品（自制）；甲醇:色谱纯(Merk公司）；乙腈:色谱纯(Merk公司）； 甲酸：色谱纯(Merk公司）；乙酸铵:分析纯;柠檬酸：分析纯；氨水:分析纯;无水乙醇：分析 纯；PWAX 填料：Age la Technologies公司；PCX 填料：Age la Technologies公司；SCX 填料： Agela Technologies公司；PRS填料:Agela Technologies公司；NH2氨丙基键合硅胶填料： Agela Technologies公司；C18SPE萃取柱:Agela Technologies公司；阳离子交换（PCX)SPE 萃取柱:Agela Technologies公司；聚酰胺(PA)SPE萃取柱:Agela Technologies公司。
[0049] 2标准溶液配制
[0050] 称取亮黑、罗丹明B着色剂标准品100 . Omg，用水溶解，并定容于100mL棕色容量瓶 中，即得1000mg/L标准储备液。棕色瓶储存于-18°C备用。
[0051] 取空白样品按上述提取和净化方法进行处理，得到空白基质提取净化液。用该基 质溶液稀释标准储备制成系列标准工作溶液，进行LC-MS/MS分析。以标准工作液的浓度为 横坐标，峰面积为纵坐标，绘制相关线性方程。
[0052] 3样品提取与净化
[0053] 3.1制备：
[0054] 取具有代表性试样500g粉碎、搅拌均匀密封标识，待用。
[0055] 3.2提取：
[0056] 取步骤（1)样品，置于离心管中，加入超纯水，于50-70°C水浴超声提取10_30min， 于离心机中4000r/min离心5-15min，移取上清液用柠檬酸水溶液调试pH值至3-6,得待净化 溶液；
[0057] 3.3净化：
[0058] 3.3.1固相萃取小柱的组装：分别称取40-80mg 40-60μπι阳离子交换填料和40- 80mg 40-60μπι阴离子交换填料，填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内，填料上端再以 聚乙烯筛板固定；
[0059]所述的阳离子交换填料为选自苯磺酸键合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PCX)、苯磺 酸键合硅胶(SCX)、丙磺酸键合硅胶(PRS)中的至少一种，所述的阴离子交换填料为选自丙 基乙二胺(PSA)、聚酰胺(PA)、多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PWAX)填料中的至少一种； [0060]所述的阳离子交换填料和阴离子交换填料的比例为重量比1:0.5~1:2。
[00611 3.3.2柱活化:将上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化；
[0062] 3.3.3加样淋洗:转移上述待净化液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3- 6的水、4-8mL甲醇淋洗SPE柱；
[0063] 3.3.4洗脱:低真空吹干SPE柱，用4-8mL 3的氨化甲醇洗脱待分析成分并接 收，收集液于50°C氮气吹干，用水定容至1. OmL，涡流混合后过0.22μπι滤膜，供LC-MS/MS分 析。
[0064] 4 检测
[0065] 待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定，仪器参数条件见下表1，选择反 应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2。
[0066] 表1液相色谱-串联四级杆质谱的仪器参数条件
[0067]
[0068] 表2亮黑和罗丹明B的LC-MS/MS分析参数
[0070] 5.结果与讨论 [0071] 5.1色谱质谱条件的优化
[0072] 5.1.1流动相的选择
[0073] 比较了乙腈+0.1 %甲酸水溶液，甲醇+5mmol/L乙酸铵水溶液，甲醇+0.1 %甲酸水 溶液不同流动相对色谱图的影响。研究发现以乙腈+0.1%甲酸水、甲醇+0.1%甲酸水为流 动相，目标物峰形差，离子化响应值低。甲醇+5mmol/L乙酸铵水溶液为流动相，目标化合物 色谱峰对称尖锐，与食品中基质分离效果较好，MRM色谱图如附图1所示。
[0074] 5.1.2质谱测定条件的优化
[0075]首先采用浓度为500yg/L的标准溶液以蠕动栗连续进样的方式进行母离子全扫 描，确定亮黑和罗丹明B的母离子质量数，然后再以母离子进行2级碰撞扫描，选择两个丰度 比较高的子离子作为定性和定量离子。同时优化质谱条件，确定质谱最佳条件，建立多离子 反应监测模式。图2中下图为正离子模式下罗丹明B的特征离子色谱；图2中上图为负离子模 式下亮黑的特征离子色谱。
[0076] 5.2样品基质效应的消除
[0077] 电喷雾离子源(ESI)易受样品基质的影响。试验中发现样品基质对离子化有抑制 作用，不同样品基质对亮黑和罗丹明B离子化抑制程度存在差异。为消除样品基质效应，应 以空白样品提取液作为标注溶液的稀释液来消除样品基质效应。
[0078] 5.3净化SPE柱的选择
[0079] 常用来做色素的SPE净化萃取柱有阳离子交换（如PCX)SPE柱、阴离子交换柱（如 PWAX、PA)SPE柱及C18粉制成的SPE柱等，C18粉具有疏水作用对非极性的组分有吸附作用， 常用来去除杂质，对水溶性的着色剂几乎没有吸附能力。根据着色剂酸碱性的不同，填料有 选择性的吸附目标物，如PCX粉对目标物罗丹明B有很好的吸附，但对其他酸性着色剂吸附 差;PA粉、PWAX粉对酸性着色剂有很好的选择性吸附性。由于8种着色剂中既有酸性也有碱 性化合物，本课题主要研究采用一次过柱解决净化问题。优选地，采用PCX粉:PWAX为填料时 吸附两种性质的化合物能力最佳，60mgPCX: 60mgPWAX/6mL自行填制净化萃取柱对样品进行 净化处理。
[0080] 5.4洗脱液的选择
[0081] 本研究测试了纯甲醇洗脱上样后的SPE柱，发现目标化合物几乎洗脱不下来。比较 1%、2%、4%、5%、6%、10%氨化甲醇作为洗脱液的洗脱效果。发现同样取6!1^洗脱液时， 5 %氨化甲醇能洗脱完全，因此采用5 %氨化甲醇作为洗脱液。
[0082] 5.5方法验证
[0083] 5.5.1方法的线性和检出限
[0084] 将空白样品按上述提取和净化过程进行处理，得到空白基质提取净化液。用该基 质溶液将亮黑标准液稀释成10(^8/1，20(^8/1，40(^8/1，80(^8/1，100(^8/1的系列标准工 作液，罗丹明 B 标准系列：20yg/L，40yg/L，80yg/L，160yg/L，200yg/L; LC/MS/MS 进行分析后， 计算得到标准曲线及相关系数，见表3。由此可见亮黑和罗丹明B在线性范围内具有良好的 线性关系，相关系数分别为0.9929和0.9961。
[0085] 方法的检出限(L0D)以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪 比S/N = 3和样品处理过程的稀释倍数计算得出。定量限（L0Q)以空白样品基质稀释标准曲 线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N=10和样品处理过程的稀释倍数计算得出。具体数据 见表3。
[0086] 表3亮黑和罗丹明B的线性方程、线性范围、相关系数和方法检出限
[0088] 5.5.2回收率和精密度
[0089] 对烤肉调味料和水果糖中进行添加回收实验，由于罗丹明B响应值高，添加浓度为 5、10、50yg/kg;亮黑添加浓度分别为50、100、200yg/kg。称样后加入标准溶液，涡旋混匀放 置〇.5h后按上文进行样品处理。每个水平重复6次，测精密度。结果见表4。可见，亮黑和罗丹 明B在烤肉调味料和水果糖中添加平均回收率在81.2 %-96.0 %之间，相对标准偏差(RSD) 均小于6.0%。
[0090] 表4亮黑和罗丹明B的回收率和精密度实验结果
[0091]
[0093] 5.6方法的应用
[0094] 烤肉调味料样品，及加入标准溶液的样品，按"3样品提取与净化"的实验步骤操作 完毕后上机，测得色谱图如图3和图4所示：
[0095] 从色谱图中可以看出，烤肉调味料样品基质不干扰亮黑和罗丹明B的测定，加标样 品回收较好。但罗丹明B在空白中有本底，需要扣空白。
[0096] 实验表明，采用本法可利用自组装的固相萃取净化小柱对样品提取液进行净化处 理，可在有效除去干扰物的同时实现对亮黑和罗丹明B的净化、富集，并采用LC-MS/MS定量 测定，方法灵敏度、准确度和精确度均符合食品添加剂分析标准，完全满足进出口食品的产 品质量控制要求。
[0097] 实施例1:
[0098] 烤肉调味料样品中亮黑和罗丹明B的测定。
[0099] 3样品提取与净化
[0100] 3.1提取
[0101 ]取具有代表性试样500g粉碎、搅拌均匀，密封标识，待用。
[0102] 置于离心管中，加入超纯水，于50-70°C水浴超声提取20min，于离心机中4000r/ min离心10min，移取上清液用柠檬酸水溶液调试pH值4，得待净化溶液；
[0103] 3.2?争化
[0104] 3.2.1固相萃取小柱(6mL)的组装:分别称取60mg 40-60ym PCX阳离子交换填料和 60mg 40-60ym PWAX混合型弱阴离子交换填料，填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内， 填料上端再以聚乙烯筛板固定；
[0105] 3.2.2柱活化:将上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[0106] 3.2.3加样淋洗:转移上述待净化液lOmL至固相萃取小柱，依次用6mL pH值4的水、 6mL甲醇淋洗SPE柱；
[0107] 3.2.4洗脱:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脱待分析成分并接收，收 集液于50°C氮气吹干，用水定容至1. OmL，涡流混合后过0.22μπι滤膜，供LC-MS/MS分析； [0108] 4 检测
[0109] 待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应 监测母离子、子离子和碰撞能量见表2;其分析色谱图如图5所示，该样品回收率和精密度实 验结果见表4。
[0110] 实施例2
[0111] 水果糖样品中亮黑和罗丹明Β的测定。
[0112] 3样品提取与净化
[0113] 3.1提取
[0114]取具有代表性试样500g粉碎、搅拌均匀密封标识，待用。
[0115] 置于离心管中，加入超纯水，于50-70°C水浴超声提取15min，于离心机中4000r/ min离心10min，移取上清液用柠檬酸水溶液调试pH值至3-6，得待净化溶液；
[0116] 3.2净化
[0117] 3.2.1固相萃取小柱(6mL)的组装:分别称取60mg 40-60ym PCX阳离子交换填料和 60mg40-60ym PWAX混合型弱阴离子交换填料，填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内， 填料上端再以聚乙烯筛板固定；
[0118] 3.2.2柱活化:将上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[0119] 3.2.3加样淋洗:转移上述待净化液10mL至固相萃取小柱，依次用6mL pH值4的水、 6mL甲醇淋洗SPE柱；
[0120] 3.2.4洗脱:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脱待分析成分并接收，收 集液于50°C氮气吹干，用水定容至1. OmL，涡流混合后过0.22μπι滤膜，供LC-MS/MS分析。
[0121] 4 检测
[0122] 待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应 监测母离子、子离子和碰撞能量见表2;其分析色谱图如图6所示，该样品回收率和精密度实 验结果见表4。
【主权项】
1. 一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 制备:取具有代表性样品粉碎、搅拌均匀，密封标识，待用； (2) 提取:取步骤(1)样品，置于离心管中，加入超纯水，于50-70°C水浴超声提取，离心， 移取上清液用柠檬酸水溶液调试pH值至3-6，得待净化溶液； (3) 净化： a、 固相萃取小柱的组装:取40-60μπι阳离子交换填料和40-60μπι阴离子交换填料，填充 于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内，填料上端再以聚乙烯筛板固定； 所述的阳离子交换填料和阴离子交换填料的比例为重量比1:0.5~1:2; b、 柱活化:将上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化； c、 加样淋洗:转移步骤(2)的待净化溶液至固相萃取小柱，依次用pH值3-6的水、甲醇淋 洗固相萃取小柱； d、 洗脱：吹干固相萃取小柱，用氨化甲醇洗脱待分析成分并接收，收集液氮气吹干，加 水溶解，涡流混合后过〇. 22μπι滤膜，供LC-MS/MS分析； (4) 检测:步骤(3)得到的待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定。2. 如权利要求1所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法，其特征是，所 述步骤(4)中液相色谱-串联四级杆质谱的仪器参数条件如下： 色Thermo Syncronis Cl 8 (i；：iffl'!：> 3.0μπ?^ 150mm><2.1 mm 流动枏 甲醇，5 mmol乙酸铵水溶液 流速 0.25 mL/min 进样量 5pL 柱温 30°C 梯度洗脱程序时间(min)甲醇(％) 5 mmol乙酸铵水溶液(％) 0.00 5 95 5.00 95 5 9.00 95 5 9.10 5 95 ]5 00 5 95 质谱条件为： 离子源 电喷雾离子源 扫描方式 ESI源正负离子分段扫描模式 监测方式 多反应监测 电喷雾电压 4500 V 离子源温度 50(TC 载气流速 15 L/min 雾化器压力 45psL3. 如权利要求2所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法，其特征是，亮 黑和罗丹明B的LC-MS/MS分析参数如下表所示： 〇4. 如权利要求1-3中任意一项所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法， 其特征是，所述的阳离子交换填料为选自苯磺酸键合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PCX、苯磺酸 键合硅胶SCX、丙磺酸键合硅胶PRS中的至少一种。5. 如权利要求4所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法，其特征是，所 述的阳离子交换填料为苯磺酸键合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PCX。6. 如权利要求1-3中任意一项所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法， 其特征是，所述的阴离子交换填料为选自聚酰胺PA、NH 2氨丙基键合硅胶、多胺化聚苯乙烯 二乙烯苯共聚物PWAX填料中的至少一种。7. 如权利要求6所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法，其特征是，所 述的阴离子交换填料为多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物PWAX填料。8. 如权利要求1-3中任意一项所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法， 其特征是， (1) 制备:取代表性样品粉碎、搅拌均匀，密封标识，待用。 (2) 提取:取步骤（1)样品IOg，置于50mL离心管中，加入25mL超纯水，于50-70°C水浴超 声提取10-30min，于离心机中4000r/min离心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液调试pH 值至3-6,得待净化溶液； (3) 净化： a、 固相萃取小柱的组装:取40_80mg 40-60μηι阳离子交换填料和40_80mg 40-60μηι阴离 子交换填料，填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内，填料上端再以聚乙烯筛板固定； b、 柱活化:将上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化； c、 加样淋洗:转移步骤(2)的待净化溶液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3-6的水、4-8mL甲醇淋洗固相萃取小柱； d、 洗脱:低真空吹干固相萃取小柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇洗脱待分析成分并接 收，收集液于50°C氮气吹干，用水定容至1.0 mL，涡流混合后过0.22μπι滤膜，供LC-MS/MS分 析； (4) 检测:步骤(3)得到的待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定。9. 如权利要求8所述的一种LC-MS/MS测定食品中亮黑和罗丹明B的方法，其特征是，分 别称取60mg 40-60μηι苯磺酸键合聚苯乙稀二乙稀苯共聚物PCX填料和60mg 40-60μηι多胺化
【文档编号】G01N30/02GK106018583SQ201610311214
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】郑新华, 王乐, 陈晞, 张爱霞
【申请人】济南出入境检验检疫局检验检疫技术中心