一种抗alpha-烯醇化酶抗体免疫层析试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及一种层析试纸条，属于医学免疫分析检测领域。
【背景技术】
[0002] 稀醇化酶(enolase)是1934年Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸 向丙酮酸转换的过程中发现的。它既可催化糖酵解过程中2-磷酸-D-甘油酸(PGA)向磷酸-烯醇式丙酮酸(PEP)的转化，又可在糖原合成过程中，催化逆向反应，即作为磷酸丙酮酸水 合酶，使PEP向PGA转化，因此烯醇化酶在细胞能量代谢过程中起重要的作用【J Biol Chem， 2〇〇〇,275(8):5958-5965】。在脊椎动物中，烯醇化酶存在3种同功酶 :€1，0，丫。€[-烯醇化酶在 许多组织均存在，β-烯醇化酶几乎仅见于肌肉组织，γ-烯醇化酶则主要存在于神经元和神 经内分泌组织。根据它们的分布和作用不同，Ct-烯醇化酶又称为非神经元烯醇化酶(11 011-neural enolase，NNE)、enolase I (eno-1)、磷酸稀醇丙酮酸脱氢酶（phosphopyruvate hydratase)、c_myc启动子结合蛋白（c-myc promoter-binding protein，MBP_1 )、纤维蛋白 溶酉每原结合蛋白（plasminogen-binding protein) 0
[0003] NNE在结构上高度保守，除了作为糖酵解反应的限速酶，还作为自身抗原参与机体 免疫反应。研究证明，多种自身免疫病均可检出抗NNE抗体。NNE作为一种自身抗原，既是胞 浆酶，又可表达于肾脏、血管等组织及一些细胞如内皮细胞膜或与细胞表面结合。抗NNE自 身抗体通过识别NNE的膜联形式和/或干扰它的功能而于局部诱发免疫炎性反应。自身免疫 性视网膜病变患者体内存在抗NNE抗体，并特异定位于视网膜神经节细胞层及内核层，诱导 该区域细胞凋亡，导致失明【14此〇丨臟皿，2004,23(2):161-167】。存在于人呼吸道上皮细胞 中的NNE自身抗原诱导的自身免疫反应，造成呼吸道上皮细胞损伤，诱发气道炎症反应，参 与重症哮喘和阿斯匹林敏感性哮喘的发生【J Allergy Clin Immunol，2006，118(2) :376_ 381】。类风湿性关节炎患者的关节滑膜中可见大量的NNE表达，作为一种自身抗原，NNE发生 氨基甲酰鸟氨酸化，并刺激机体产生特异性自身抗体，从而引发类风湿性关节炎的慢性炎 症反应【Arthritis Res Ther，2005,7(6): 1421-1429】。研究还发现，大约有10-18%的炎症 性肠病（inflammatory bowel disease，IBD)血清中抗 NNE 抗体阳性【Clin Exp Tmmunol·1998;112:10-16】。
[0004] 目前实验室常用的检测抗NNE的方法是酶联免疫吸酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫迹法（immunoblotting test，IBT) 〇尚未发 现有商品化的抗NNE抗体检测试剂盒。
[0005] ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也较高，目前被广泛认可，但操作比 较繁琐，需多次加样和洗涤，完成整个实验过程需三小时左右，且易受温度和孵育条件的影 响，需酶标仪，亦需要专业免疫学技术人员在专业实验室中进行实验操作，给实验带来诸多 不便。
[0006] 免疫印迹法综合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELI SA法的高特异性和敏感性，但操作 相对复杂，完成整个实验过程需三小时左右，亦需要专业免疫学技术人员在实验室中进行 实验操作，同时易受各种温度和孵育时间等环境条件因素的影响，对试验带来诸多不便。且 试剂具有较强的毒性和污染性。
[0007] 免疫层析法（immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其原 理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样 品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区 域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检测带。现有的免疫 层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、乳胶等等，其中以纳米金应用最为 广泛。
[0008] 与其他检测方法相比，免疫层析法检测时间短，只需要5~20分钟，操作人员无需 培训，操作简便、快速，无需低温保存，储运方便等优势。
[0009] 在自体免疫性疾病诊断方面，已出现较多的免疫层析试纸，但抗NNE抗体的免疫层 析试纸在国内外市场上仍没有问世。 【实用新型内容】
[0010] 本实用新型所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用 到抗NNE抗体的检测中，采用间接免疫法来实现对样品中的NNE抗体进行检测，通过把NNE抗 原蛋白包被在结合垫或分析膜检测带上，实现对样品中NNE抗体的高特异、高准确性的检 测，快速筛查抗NNE抗体阳性标本，为临床炎症性肠病等自体免疫性疾病提供快速的辅助诊 断。
[0011] 本实用新型所要解决的技术问题在于提供一种免疫层析法抗NNE抗体测试纸条。
[0012] 本实用新型所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
[0013] -种抗NNE抗体免疫层析试纸条，包括样品垫（1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫 (6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板的上部贴合有分析膜，所述分析膜 上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫，所述结合垫上部的一端贴合有样品垫，所述检测 带T线和质控带C线设置在分析膜上。
[0014] 所述的结合垫(2)包被胶体金或彩色胶乳标记物。
[0015] 优选例1中，所述的结合垫⑵包被有标记的NNE抗原蛋白，所述的检测带T线⑷包 被有抗人IgG，所述的质控带C线(5)包被有NNE的单克隆或多克隆抗体的一种或多种。
[0016] 所述的NNE单克隆或多克隆抗体是指用NNE抗原蛋白作为免疫原所获得的鼠源、兔 源、马源、豚鼠源、骆驼源的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0017]优选例2中，所述的结合垫（2)包被有标记的NNE抗原蛋白和标记物b层;所述的检 测带T线(4)包被有抗人IgG，所述的质控带C线(5)包被有蛋白C。
[0018] 优选例3中，所述的结合垫（2)包被有标记物a层和标记物b层;所述的检测带T线 (4)包被有NNE抗原，所述的质控带C线(5)包被有蛋白C。
[0019] 所述标记物a层的标记蛋白为抗人IgG单克隆抗体、抗人IgG多克隆抗体、葡萄球菌 A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（Protein G)中的一种或多种。
[0020] 所述的抗人IgG多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源、骆驼源或豚鼠源中的一种； 所述的抗人IgG单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种。
[0021] 所述的控制线上的蛋白C与标记物b层中的标记蛋白B同时或不同时为单克隆抗体 或多克隆抗体中的一种，并且标记物b层中的标记蛋白B和质控线上的蛋白C可发生特异性 结合形成免疫复合物。所述的多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源、骆驼源或豚鼠源中的一 种，所述的单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种。
[0022] 本实用新型所用的包被在质控带C线上的蛋白包括但不限于:NNE的特异性单抗或 多抗、动物的免疫球蛋白或抗其抗体，但必须能与结合垫b层的标记蛋白发生免疫结合反 应，形成免疫复合物。比如结合垫b层的包被蛋白是标记的NNE，质控带的包被蛋白是任何动 物来源的抗NNE抗体;如果结合垫b层的包被蛋白是鼠 IgG，质控带的包被蛋白是任何动物来 源的抗鼠 IgG的单抗或多抗。选用哪一对的结合垫b层蛋白和质控带C线蛋白不是本实用新 型的关键，实施例例举几组常用的结合垫b层标记蛋白与质控带C线包被蛋白组合，其目的 不是限制该组合类型。
[0023] 所述的NNE抗原蛋白为通过原核/真核表达系统克隆化基因获得，或通过氨基酸合 成重要抗原表位偶联到载体蛋白上获得。
[0024] 所述检测是定性检测样本中的抗NNE抗体，对炎症性肠病进行辅助诊断。所述样本 为血清、血衆、全血或其他体液。
[0025] 本实用新型所用的单克隆抗体用现有技术杂交瘤方法制备或者通过重组DNA法进 行制备。
[0026] 本实用新型所用的多克隆抗体或通过免疫动物来制备。
[0027] 本实用新型所用的NNE抗原蛋白、SPA、Protein G用基因工程方法获得。
[0028]本实用新型的检测原理为（以结合垫上的标记蛋白A为NNE蛋白，B为兔IgG为例）：
[0029] 胶体金或彩色胶乳标记的蛋白A和蛋白B喷涂于结合垫，分析膜检测带T线上包被 抗人IgG，质控带C线上包被抗兔IgG。当样本随着层析泳动到结合垫并浸润胶体金或胶乳标 记物时，其中的人I gG和标记蛋白A结合形成人I gG-标记蛋白A复合物，由于毛细管效应，此 复合物沿向吸水垫方向泳动，如果样品中含有抗NNE抗体，此复合物与包被于检测带T线上 的抗人IgG发生特异性免疫结合反应，形成金标/胶乳蛋白A(NNE)-人抗NNE IgG抗体-抗人 IgG三联体复合物而被截留在检测线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带或胶乳颜色；由于 毛细效应继续泳动向前，金标/胶乳兔IgG与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的免疫 反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带或胶乳颜色，多余的未结合的物 质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果;若血清样品 中不含有抗NNE抗体，标记蛋白A到达检测线时，不与包被在检测线上的NNE抗原蛋白发生免 疫反应，