因此在检测线处没有出现显色带，而金标/胶乳兔IgG继续泳动向前与包被于质控 线处羊抗兔IgG发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带或胶 乳颜色，因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。
[0030] 本实用新型首次将免疫层析技术应用于抗NNE抗体检测，实现了高特异性、高灵敏 度的检测性能。与目前市面出现的商品化间接免疫荧光试剂盒相比，本实用新型优点主要 包括:检测时间短(5-20min);不需要任何特殊仪器，可实现床边检测和门诊即时检测;操作 简便，只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低;对温度无特殊要求，无需冷冻，储存 运输方便，室温可保存24个月。
【附图说明】
[0031] 图1本实用新型的侧面结构示意图1。
[0032] 图2本实用新型的侧面结构示意图2。
[0033]图3本实用新型阳性和阴性结果示意图3。其中3a是条带示意图；3b为阳性结果;3c 为阴性结果;3d和3e表示试纸条失效。
【具体实施方式】
[0034] 本实用新型所述的抗NNE抗体免疫层析试纸，如图1所示，该试纸是在底板(7)上由 一端向另一端顺次相互搭接地粘贴分析膜(3)、结合垫(2)、样品垫（1)、吸水垫(6)。分析膜 (3)材质为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜;结合垫(2)的材质为玻璃纤维膜或聚酯膜。
[0035] 第一组优选例中，结合垫（2)上包被有纳米金或彩色胶乳标记NNE抗原蛋白，检测 带上包被抗人IgG，质控带包被NNE的单抗或多抗。
[0036] 第二组优选例中，结合垫(2)上包被有纳米金或彩色胶乳标记蛋白a和标记蛋白b， 标记蛋白a层为NNE抗原蛋白，标记蛋白b层为任何能与质控带包被物形成免疫复合物的蛋 白。分析膜(3)上设置有检测带T线(4)和质控带C线(5)，检测带T线(4)包被有抗人IgG单克 隆抗体、抗人IgG多克隆抗体、SPA和链球菌G蛋白的一种或多种，质控带C线（5)包被有能与 结合垫标记蛋白b形成免疫复合物的蛋白c。
[0037] 在另一组优选例中，结合垫(2)上包被有纳米金或彩色胶乳标记蛋白a和标记蛋白 b，标记蛋白a层的蛋白为羊抗人IgG、鼠抗人IgG、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白的一种 或多种，标记蛋白b层为任何能与质控带包被物形成免疫复合物的蛋白。分析膜(3)上设置 有检测带T线(4)和质控带C线(5)，检测带T线(4)包被有NNE抗原蛋白，质控带C线(5)包被有 能与结合垫标记蛋白b形成免疫复合物的蛋白蛋白c。
[0038] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本实用新型。
[0039]实施例1 NNE抗原蛋白的制备
[0040] 应用于本试纸的NNE抗原蛋白是通过基因克隆技术构建重组基因，然后采用原核 表达载体或真核表达载体，本实用新型所用的原核表达载体为pET28a( + )，表达菌为BL21大 肠杆菌;真核表达载体为pcDNA3.1 ( + )，表达菌为酵母菌。两种表达技术均能成功表达出全 部为人源的NNE抗原蛋白，操作方法见《分子克隆实验指南》。其中，NNE抗原蛋白来源于亲和 纯化以及脱盐工艺所获得的基因工程抗原蛋白。
[0041] 实施例2抗体、葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白的制备
[0042] 本实用新型包被在结合垫a层的标记蛋白a主要包括NNE重组蛋白和抗人IgG单抗 或多抗，抗人IgG单抗和多抗的制备技术已经很成熟，用人免疫球蛋白IgG作为免疫原，分别 参照《免疫学常用实验方法》中单克隆抗制备和多克隆抗体制备章节，在动物上经多次皮下 或腹膜内注射纯化的人IgG和佐剂而产生。
[0043]葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白的制备方法可参照《分子克隆实验指南》中重组蛋 白相关章节，用大肠杆菌原核表达克隆化基因来制备葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白。这两 种蛋白是生物学领域常见的工程蛋白，也可通过购买市售产品获得。
[0044]实施例3胶体金层析各组分制备 [0045] (1)胶体金溶液制备
[0046]用去离子水配制0.01 % (w/v)的氯金酸溶液和1 % (w/v)的柠檬酸三钠溶液。取 O. OI %的氯金酸水溶液IOOmL，放入水浴锅内加热至沸腾，磁力搅拌下迅速加入I %柠檬酸 钠2.8 mL。再保持沸腾，至溶液呈酒红色，得粒径在25-30nm胶体金溶液，所用玻璃仪器均经 过酸洗。
[0047] (2)金标蛋白的制备
[0048] a、金标鼠或兔抗人IgG制备：用0.1 M碳酸钠调节胶体金pH 7.3~7.5，按每毫升胶 体金溶液缓慢加入5~25yg鼠/兔抗人IgG，混匀，静置IOmin，然后加入BSA至终浓度1 %，混 勾，静置5min，3000rpm离心5min，去沉淀，将上层溶液转至新管，9000rpm离心30min，去上 清，加入重悬液至原量，将溶液移至新管，9000rpm再次离心30min，加入用十分之一初始体 积的保存液将沉淀重悬，置4°C备用；
[0049] b、金标羊或兔IgA制备：用0.IM碳酸钠调节胶体金pH 7.5~8.0,按每毫升胶体金 溶液缓慢加入6~25yg羊/兔IgA，混匀，静置IOmin，然后加入BSA至终浓度1 %，混匀，静置 5min，3000rpm离心5min，去沉淀，将上层溶液转至新管，9000rpm离心30min，去上清，加入重 悬液至原量，将溶液移至新管，9000rpm再次离心30min，加入用十分之一初始体积的保存液 将沉淀重悬，置4°C备用；
[0050] C、金标NNE抗原蛋白制备：用0 . IM碳酸钾调节制备的胶体金Ph7.4，按每毫升胶体 金溶液缓慢加入12yG NNE抗原蛋白，搅拌10~30min，然后加入BSA至终浓度0.5%，搅拌10 ~30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉 淀重悬，置4°C备用
[0051] (3)分析膜的制备 [0052] A.分析膜1
[0053]检测带T线:将纯化的NNE抗原蛋白与pH为7.5的IOmM PB缓冲溶液混合配制成为浓 度为0.5mG/mL的混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为lyL/cm。
[0054]质控带C线：将羊抗鼠 I gG与pH为7.2的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为 0.2mG/mL混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为lyL/cm。
[0055] B ·分析膜2
[0056]检测带T线:将纯化的NNE抗原蛋白与pH为7.0~9.0的IOmM I3B缓冲溶液混合配制 成为浓度为〇. 5mg/ml的混合溶液，喷在醋酸纤维膜上，涂布量为12yL/cm2。
[0057]质控带C线：将鼠抗羊IgA与pH为7.0~9.0的IOmM I3B缓冲溶液混合配制成为浓度 为0. lmg/ml混合溶液，喷在醋酸纤维膜上，涂布量为12yL/cm2。
[0058] C ·分析膜3
[0059]检测带T线:将鼠抗人IgG蛋白与pH为7.5的IOmM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为 0.5mg/mL的混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为lyL/cm。
[0060] 质控带C线:Protein G与pH为7.1的IOmM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为0.1 mg/ mL混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为lyL/cm。
[0061] D ·分析膜4
[0062]检测带T线:将羊抗人IgG多克隆抗体与pH为7.6的IOmM I3B缓冲溶液混合配制成为 浓度为〇. 5mg/mL的混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为lyL/cm。
[0063] 质控带C线:将兔抗NNE多克隆抗体IgG与pH为7.0~9.0的IOmM PB缓冲溶液混合配 制成为浓度为〇. 2mg/mL混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为lyL/cm。
[0064] (4)结合垫的制备
[0065]结合垫的处理：结合垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的结合垫处理液浸 泡结合垫，结合垫处理液的量为100uL/cm2,然后在37 °C下Ih烘干后，将抗体或者蛋白以 80uL/cm2的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，37°C干燥Ih后得结合垫，结合垫置于2~8°C的 环境下备用;结合垫处理液的组成为:pH为7.0~9.0的IOmM PB缓冲溶液，含I%BSA，10%蔗 糖，0 · 1 % Tween-20 〇
[0066] A.结合垫1单层，标记蛋白为鼠抗人IgG。
[0067] B.结合垫2双层，标记蛋白a层为兔抗人IgG，标记蛋白b层为羊IgA。
[0068] C.结合垫3双层，标记蛋白a层为NNE，标记蛋白b层为兔IgA。
[0069] D.结合垫4单层，结合蛋白均为NNE。
[0070] (5)样品垫的制备
[0071] 样品垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，样品 处理液的量为100uL/cm2，然后在37°C下Ih烘干，样品垫缓冲液的组成为:pH为7.0~9.0的 IOMm PB缓冲溶液，含 1%BSA，10%蔗糖，0.1%Tween-20。
[0072] 实施例4胶体金NNE抗体检测试纸1组装
[0073] 如图1所示的抗NNE抗体检测试纸，其中结合垫(2)为实施例3制备的结合垫1，分析 膜(3)为实施例3制备的分析膜1，其余组分制备步骤同实施例3,各组分烘干后根据底板的 大小剪切成条，按图1所示组装。
[0074] 实施例5胶体金NNE抗体检测试纸2组装
[0075] 如图2所示的抗NNE抗体检测试纸，其中结合垫(2)为实施例3制备的结合垫2，分析 膜(3)为实施例3制备的膜条2,其余组分制备步骤同实施例3。各组分烘