猪传染性胸膜肺炎放线杆菌elisa检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的器具，特别是涉及一种定量检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELI SA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contag1us pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(ActinobaciI Ius pleuropneumoniae，App)引起的以胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为主要特征的猪的呼吸道传染病，本病是国际上公认的危害现代养猪业的五大疾病之一，给各国的养猪业造成了巨大的经济亏损失。近年来该病在我国的发病率呈逐年上升的趋势，越来越受到人们的重视。
[0003]本病由于可引起败血症且呼吸高度困难，表现典型症状的急性死亡猪可见到两侧对称性肺炎，胸膜粘连，肺炎部位质度较硬，切面脆弱，气管内充满泡沫状血样粘性渗出物，慢性病例易继发其他疾病，导致生长迟缓，料肉比增高，给养猪业造成巨大的危害。
[0004]App感染可造成急性死亡，生长缓慢，导致养猪行业的重大损失。对于该病的诊断，除非出现特征性胸膜肺炎变化，否则确诊还需要借助实验室诊断技术，目前，用于App检测的方法主要有细菌分离鉴定、协同凝集试验、琼脂扩散试验、莹光抗体技术、补反试验、补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、单克隆抗体、聚合酶链式反应(PCR)扩增毒素APX基因和外膜蛋白OMIA基因来进行分型。这些方法中，细菌的分离鉴定虽然较为准确，但由于App培养条件要求较高，并且该方法消耗时间过长，临床诊断难以推广。血清学方法操作繁锁，且很难判断疫苗抗体和自然感染。分子生物学诊断技术中，PCR方法易出现假阳性结果，且在一般猪场难以推广应用。另外，App血清型的多样性限制了针对所有血清型App诊断方法的建立。所以迫切需要建立一种省时省力并能检测所有血清型的检测方法。寻找能在所有血清型App中都存在的菌体结构成分或其它组分，并用来建立种特异性诊断方法是该领域研究科学家的目标。
[0005]鞭毛是细菌的一种特殊结构，约半数的杆菌、极少数球菌和所有的螺旋菌及弧菌都有鞭毛，鞭毛不但与细菌的运动有关，而且在细菌的感染与免疫及细菌分类鉴定等方面发挥重要作用。由于研究技术的限制，人们最早研究鞭毛是从它的染色方法开始的，随着现代分子生物学技术的飞速发展，人们开始从基因水平来研究鞭毛作为运动器官的分子机制及其毒力相关基因，这方面研究较多的是鞭毛蛋白的中央区段和flic基因。Maynarelli等根据莱姆病疏螺旋体鞭毛蛋白氨基酸序列同其它菌株鞭毛蛋白有很高的同源性，尤其是N端和C端(但在其中央区，氨基酸序列及长度差别很大)，构建了重组鞭毛蛋白中央区，并以此为抗原诊断莱姆病，其敏感性及特异性均优于全细胞抗原诊断方法。吕冰等对中国莱姆病螺旋体(Borrilia garinii)基因种参考菌株PD91的鞭毛蛋白中央区编码基因进行克隆表达，证明重组蛋白具有抗原性，为我国莱姆病的血清学诊断提供了帮助。Wei等曾经报导，沙门氏菌的鞭毛蛋白基因的末端区域有很高的保守性，对鞭毛的运动起调节作用，而中央区的保守性很低，一般认为它与鞭毛蛋白抗原的可变性有关。【实用新型内容】
[0006]本实用新型的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0007]本实用新型还有一个目的是提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂合
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[0008]为此，本实用新型提供的技术方案为:
[0009]—种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒，包括:
[0010]板体，其具有多个检测孔，所述检测孔内容纳有待检测样品；
[0011 ]第一结合层，其包被于所述板体的每个检测孔的内壁上，且位于所述检测孔内壁与所述待检测样品之间，所述第一结合层结合待检测样品，并于其上形成样品层；以及，
[0012]第二结合层，其与所述样品层结合，并且位于所述样品层的上方。
[0013]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，所述板体为酶标板。
[0014]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，所述板体上还设置有阴性对照孔和阳性对照孔，所述阴性对照孔内容纳有胸膜肺炎放线杆菌培养基，所述阳性对照孔内容纳有胸膜肺炎放线杆菌，所述阴性对照孔和所述阳性对照孔的内壁上也均设置有所述第一结合层；
[0015]所述阴性对照孔、所述阳性对照孔和所述检测孔构成加样孔。
[0016]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，所述第一结合层为第一抗体层，所述第一抗体为胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体；
[0017]所述第二结合层为第二抗体层，所述第二抗体为所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，且所述第一抗体和第二抗体与所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白结合的位点不同。
[0018]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，所述第一抗体为所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的多克隆抗体，所述第二抗体为所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体。
[0019]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的多克隆抗体的浓度为1.45yg/ml，所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体的浓度为3.12yg/ml。
[0020]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，所述第二抗体为酶标抗体。
[0021]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒，还包括:
[0022]封闭层，其位于所述第一结合层和所述样品层之间。
[0023]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，所述封闭层由BSA形成。
[0024]优选的是，所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒中，还包括稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。
[0025]本实用新型至少包括以下有益效果:
[0026](I)本装置根据双抗体夹心ELISA的基本原理，首先对App鞭毛蛋白flic基因进行了克隆及序列分析，并实现了在大肠杆菌BL21中表达，利用纯化后的表达蛋白分别免疫家兔和小鼠，获得兔抗f I ic多抗和鼠抗f I ic单抗，抗体经提纯后，将兔抗f Iic多抗IgG用作一抗包被酶标板，鼠抗f Iic单抗IgG用作二抗，采用双抗体夹心酶联免疫吸附方法对App进行定量检测。
[0027](2)本装置检测特异性强，敏感性高。与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌等菌株等无非特异性反应。对培养的App从1:10开始依次进行5倍稀释，并分别用三批不同时间包被兔血清的酶标板按前述进行检测，本装置能检出稀释度为1:101()的菌液，即低至5X101()CFU/mL的细菌，说明本装置具有较好的敏感性。
[0028](3)该方法稳定性强。按照本文中确定的兔血清包被浓度，按不同时间分三批包被酶标板，再用同样的方法对其敏感性和特异性进行检测，结果显示，在敏感性方面，当App从1:10开始依次进行5倍稀释时，三批中每批的OD值均有明显的降低梯度，而且当App稀释度〉1:6250时，三批的OD值均低于0.4。在特异性方面，5种对照细菌和培养基细胞对照的三批检测结果OD值均相差不大。应用SPSS分析软件对该ELISA检测方法的敏感性和稳定性进行统计分析，结果表明，批间变异系数为10.7%，低于15%，批内变异系数为6.0%，小于10%，表明该装置具有较好的重复性和稳定性。
[0029](4)减少投资和检测成本。使用该检测方法，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，节省检测成本，检测费用低。
[0030](5)应用范围广，便于普遍推广应用。用本研究建立的双抗体夹心ELISA方法对90份被检病料进行检测，结果有40份的0D63Q>0.4，且P/N>2，阳性率为44.4%，说明许多猪场普遍存在App感染。在45份被检母猪鼻拭子中有33份呈阳性，占总阳性猪的82.5 %，被检母