清即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5min消毒。将消毒好的小鼠仰卧固定于解剖板上，两前肢分别用一支针头固定，后肢交叉(左后肢在上)固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连的脂肪组织，剪破脾脏外膜，放入灭菌的匀浆器中。加3mL无血清1640于匀浆器中研磨(不要太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加7mL1640基础液，静置2min，吸取上层细胞悬液于另一无菌的50mL离心管，再补加10mL1640液于匀浆器中，同上重复2次。1000r/min离心1min去上清，细胞重悬后计数。
[0073]e饲养细胞的制备
[0074]取未免疫的Balb/C鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。四肢固定后，先撕开皮，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管3mL1640液注入小鼠腹腔，吸打几次，取出腹水离心，获得巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并与腹腔巨噬细胞混合。lOOOr/m离心1min去上清，细胞重悬后计数。并提前放于37°C温箱温育。
[0075]f细胞融合
[0076]将I X 17?2 X 17个SP2/0骨髓瘤细胞与18个免疫脾细胞(1: 10?1: 5)于50mL离心管中混匀，1500r/min，离心1min。于37 °C除去上清液。将PEG融合剂(Sigma)及HAT培养基提前放于37 0C预温。轻拍装有细胞混合物的离心管，使沉淀松动，在Imin内慢慢滴入预温至37°C的50%PEG0.8mL(Sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌管底的沉淀，加完后再缓慢搅动30s，然后静置，让其反应lmin。然后慢慢加入37°C预温的1640基础液1mL终止反应。具体方法为:第Imin内逐滴滴入lmL。第2min加ImL，第3min加I.5mL，第4min加I.5mL,第5min加5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后缓慢加入30mL1640液。1000r/m离心5min，去上清后于37 °C放置5min?8min。用1mL含HAT的1640培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，吸取细胞悬液加入每孔中，每孔约含14左右个杂交瘤细胞，96孔培养板中，约250yL/孔。一次融合可接种4?8块96孔板。于37 °C，5 % CO2培养箱中培养。融合后逐日观察细胞状态及有无污染，于第5d补加50μLHAT培养基，第8d?I Od吸去I OOyL培养基换HT培养基10yL。待融合细胞集落长至培养孔I /4，培养基略变黄时，进行抗体检测。对检测后阳性值较高的孔进行克隆，同时若阳性孔内杂交瘤细胞为单个集落，可直接转入24孔板或6孔板扩大培养，转移时需加饲养细胞。
[0077]g分泌单抗的杂交瘤细胞的筛选
[0078]采用间接ELISA方法检测。用确定好包被浓度的App包被96孔酶联板，并用0.5%的BSA 37°C封闭lh，用洗涤液洗三次，然后加入杂交瘤细胞的培养上清100yL，同时设阴、阳性血清对照，于37°C温育Ih，取出后洗涤三次，加入1: 5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，370C反应Ih，取出后洗涤三次，加入底物显色，用0.25 %HF终止反应之后，在630nm的波长下检测OD值。同时设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，OD63q大于阴性对照3倍的样品为阳性。
[0079]h杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)
[0080]克隆前一天，按3.2.3.5方法制备小鼠饲养细胞，加到96孔板，37°C温育。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板计数活细胞数。将细胞用含血清的1640培养基稀释，细胞含量分别为5、10、50个细胞/mL。将ΙΟΟμΙ上述三个浓度的细胞悬液分别加入到含有饲养细胞的96孔培养板的各孔中，每孔分别含0.5、I和5个细胞。培养第4d换液一次，第5d?6d仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。
[0081]i特异性抗体的检测
[0082]在克隆后第7d?9d，待细胞克隆长到每孔的1/3?1/2时，采用间接免疫荧光法和间接血凝试验或琼脂扩散试验检测细胞培养上清，如检出细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续进行二次克隆或扩大培养。
[0083]间接免疫荧光试验:将确定好浓度的flic蛋白包被酶标板，加入待检的单抗样品(杂交瘤培养上清用原液，腹水按1:100)，同时做阳性(1:50鼠抗App血清)和阴性(SP2/0细胞制备的腹水)对照。37 °C温育30min，PBS洗三次，加入异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisocyanate，FITC)标记的羊抗鼠IgG( 1:100)，37°C温育30min，PBS洗涤三次，在荧光显微镜下观察。如阴、阳性对照孔的结果均成立，记录各个单抗的检测结果。
[0084]琼脂扩散试验:称取琼脂糖Ig，氯化钠0.85g放于100mLpH7.6的0.0lmol/LPBS液中，置沸水中煮熔化，趁热倒入平皿中，厚度3mm?4mm。待琼脂冷却凝固后，用打孔器打成中央一孔周围六孔的梅花形孔，中央孔和周围孔的孔距为3mm?4mm，中央孔加已知的flic蛋白抗原，周围孔加不同稀释度的待检杂交瘤细胞培养上清和阴、阳性对照血清。将其移入湿盒后置37°C温箱自由扩散3d?5d，出现沉淀线判为阳性，反之，则判为阴性。
[0085]j单克隆抗体的抗原表位鉴定
[0086]采用Western-blot方法对细胞培养上清进行特异性鉴定，操作方法如下:首先对原核表达的App flic蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后用刀片切下凝胶，不经染色，按《分子克隆实验指南》上的方法，直接用半干转印仪将蛋白带转至0.45nm的硝酸纤维素膜(NC)上，电压为0.65mA?1.0mA/cm2，时间1.5h?2h。转印结束后，将NC膜于TBST中漂洗一下，再放入封闭液中，室温平缓摇动2h。然后将膜取出，与TBST稀释的一抗(杂交瘤细胞培养上清)室温反应Ih，TBST洗涤6次，每次5min，加入二抗(HRP标记的羊抗鼠IgGl: 5000)，室温摇床温育0.5h?1.0h，TBST洗3次，每次5min?lOmin，再用TBS洗3次，每次5min?lOmin，加入底物液显色，一旦出现蛋白带，立即用ddH20终止，即可观察。
[0087]k单克隆抗体的生产和效价测定
[0088]建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液，用间接ELISA测定效价。杂交鼠(20g左右)腹腔注射灭菌液体石蜡(0.5mL/只)，1d后腹腔接种PBS液悬浮的生长状态良好的杂交瘤细胞(I X 16?3X 16)，8d左右可见小鼠腹腔明显扩大，用针头采集腹水，离心取上清，间接ELISA法测定效价，并冻存离心后的细胞。将制备的单抗小量分装，-80°C保存。
[0089](4)本发明检测方法的操作过程
[0090 ] a以最佳包被浓度的多抗I gG包被酶标板，3 7 °C I h后转入4 °C冰箱过夜。次日取出洗涤酶标板3次，每次3min?4min。用0.5 %BSA封闭酶标板，37 °C Ih，同上洗板。加入用0.1 %BSA从1:10开始5倍稀释的待检抗原和阴阳性对照抗原，37°C30min，同上洗板。加入最适工作浓度的单克隆抗体，37 °C 30min，同上洗板。加入TMB底物，室温避光1min。加入0.25 % HF溶液终止反应，测定OD630值。
[0091]b结果判断取App培养基作为阴性抗原对照，然后按双抗体夹心ELISA程序测其OD63q值，以OD63q值加3个标准差为阴、阳性抗原的判定临界值，待检抗原OD63q值高于此值则判为阳性。否则为阴性。
[0092]实施例2:多抗最佳包被浓度的确定
[0093]将制备的兔血清进一步用饱和(NH4)2SO4沉淀，再经Sephadex G200柱纯化，获得纯化的兔抗App flic IgG，其浓度测定方法按照以下公式进行计算:蛋白浓度(mg/ml) =1.45A28Q-0.74A26Q。用碳酸盐缓冲液(pH9.6)先将兔抗App IgG作1:10稀释，随后作2倍连续倍比稀释，直至1:204，80，包被ELI SA板;提纯App flic蛋白固定1: