猪鼻拭子中有4是采自患呼吸道疾病的濒死母猪，虽然各猪场送检病例数量不足以说明整个猪场母猪的感染水平，但在繁殖种猪群中母猪是App的主要贮存宿主，也是App的主要传染源。本发明操作简单，方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
[0031]本实用新型的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本实用新型的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0032]图1为本实用新型所述的板体的结构示意图；
[0033]图2为本实用新型所述的加样孔的结构示意图之一；
[0034]图3为本实用新型所述的加样孔的结构示意图之二；
[0035]图4为本实用新型所述的加样孔的结构示意图之三；
[0036]图5为本实用新型所述的加样孔的结构示意图之四。
【具体实施方式】
[0037]下面结合附图对本实用新型做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0038]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0039]如图1?图5所示，本实用新型提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ELISA检测试剂盒，包括:
[0040]板体I，其具有多个检测孔110，所述检测孔110内容纳有待检测样品；
[0041]第一结合层200，其包被于所述板体I的每个检测孔110的孔底，且位于所述检测孔110内壁与所述待检测样品之间，所述第一结合层200结合待检测样品，并于其上形成样品层300;以及，
[0042]第二结合层400，其与所述样品层300结合，并且位于所述样品层300的上方。
[0043 ]本实用新型的试剂盒准确、快速、能够定量检测App，与其他检测试剂盒相比，该试剂盒特异性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低廉。
[0044]在上述方案中，作为优选，所述板体I为酶标板。
[0045]在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，所述板体I上还设置有阴性对照孔120和阳性对照孔130，所述阴性对照孔120内容纳有胸膜肺炎放线杆菌培养基，所述阳性对照孔130内容纳有胸膜肺炎放线杆菌，所述阴性对照孔120和所述阳性对照孔130的孔底也均设置有所述第一结合层200;
[0046]所述阴性对照孔120、所述阳性对照孔130和所述检测孔110构成加样孔100。
[0047]在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，
[0048]所述第一结合层200为第一抗体层，所述第一抗体为胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体；
[0049]所述第二结合层400为第二抗体层，所述第二抗体为所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，且所述第一抗体和第二抗体与所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白结合的位点不同。
[0050]在上述方案中，作为优选，所述第一抗体为所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的多克隆抗体，所述第二抗体为所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体。
[0051]在上述方案中，作为优选，所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的多克隆抗体的浓度为1.45yg/ml，所述胸膜肺炎放线杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体的浓度为3.12yg/ml。
[0052]在上述方案中，作为优选，所述第二抗体为酶标抗体。
[0053]在上述方案中，作为优选，还包括:
[0054]封闭层，其位于所述第一结合层200和所述样品层300之间。
[0055]在上述方案中，作为优选，所述封闭层由BSA形成。
[0056]在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，
[0057]还包括稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。
[0058]实施例1:以最佳包被浓度的兔抗Appflic IgG包被酶标板，37°Clh后转入4°C冰箱过夜。次日取出洗涤酶标板3次，每次3min?4min。用0.5 % BSA封闭酶标板，37 °C Ih，同上洗板。加入用0.1 % BSA从1:10开始5倍稀释的待检抗原和阴阳性对照抗原，37°C30min，同上洗板。加入最适工作浓度的鼠抗App flic单克隆抗体，37°C30min，同上洗板。加入TMB底物，室温避光I Omin。加入0.25 % HF溶液终止反应，测定OD630值。
[0059]用于本方法中的Appflic蛋白、兔抗flic IgG抗体以及鼠抗flic单克隆抗体的制备方法如下:
[0060](I)App flic蛋白的表达
[0061]以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型菌株(AppI)基因组为模板，根据其鞭毛区与其它细菌高度同源性设计引物，利用PCR方法扩增鞭毛蛋白基因片段，将其亚克隆到pMD-18T载体中并进行PCR和酶切鉴定，再将其亚克隆与载体pGEX-kG分别双酶切和连接，构建重组表达载体pGEX-fl ic，并将其转化大肠杆菌工程菌BL21进行原核表达。结果，阳性克隆经酶切鉴定，目的基因片段长度为528bp。本研究成功克隆出猪传染性胸膜肺炎鞭毛蛋白flic基因，构建获得pGEX-flic重组质粒，可在大肠杆菌BL21中表达特异性蛋白。
[0062](2)兔抗App flic蛋白高免血清的制备与效价测定
[0063]用纯化后的flic蛋白作为抗原免疫SPF兔，免疫程序如下:取重约1.5Kg的日本大耳白实验兔5只(其中I只为阴性对照)，首免前采血检测无App特异性抗体，首免Smg/只，加佛氏完全佐剂充分乳化后皮下多点注射，每隔2周后，分别进行第2、3和第4次免疫，剂量均为32mg/只，经肌肉多点注射(不加佐剂)；最后一次免疫后1d采血，按常规方法制备血清，采用ELISA方法检测血清效价，选择ELISA反应呈强阳性的SPF兔，心脏采血，将装有血液的瓶子放于37°C温箱Ih左右，然后置4°C过夜，以1500r/min离心30min，无菌收集上部清亮的血清，将上清分装于灭菌的EP管，加0.1 %的叠氮钠后，贮存于_80°C冰箱。
[0064](3)小鼠抗App flic蛋白单克隆抗体的制备
[0065]a动物的免疫
[0066]取纯化过的flic蛋白抗原与等体积的佛氏完全佐剂乳化，免疫15g左右Balb/C小鼠，首免加佛氏完全佐剂充分乳化后皮下多点注射，10yg/只。4周后，同样的抗原与等体积的佛氏不完全佐剂乳化，皮下多点及腹腔注射进行二免;4周后(融合前3d)，于皮下、尾静脉和腹腔同时注射强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。3d?4d采血检测血清抗体，达到要求后，取小鼠脾脏用于融合。
[0067]b SP2/0骨髓瘤细胞的活化
[0068]从液氮罐中取出冻存SP2/0细胞，将其迅速放入37°C水浴中，快速溶解后，立即移入1mL无血清1640培养液中，10001'/1]1；
[1151]1；[11，弃去上清加入含15%小牛血清1640培养液，轻轻将细胞吹散，加入细胞瓶中，放于37 °C5%CO2温箱中培养。待细胞瓶中培养的SP2/0细胞长满单层后，收集细胞，用0.5mL1640基础液悬浮(0.5 X 16-1 X 16)后注射Balb/C小鼠背部皮下。待9d?10d，视肿瘤大小选择取瘤细胞的时间。
[0069]c SP2/0瘤细胞的制备
[0070]本试验采用从小鼠体内制备SP2/0瘤细胞的方法:小鼠经摘除眼球，放血完毕后拉颈处死，75%酒精浸泡5min，于超净台无菌状态摘取瘤组织，于匀浆器中研碎，加入5mL?6mL无血清培养基，静置片刻，吸出上清于尖底离心管中，之后向匀浆器中加入无血清培养基清洗3次，将上清转移至尖底离心管内中，在另一无菌尖底离心管内加入20mL淋巴细胞分离液，将骨髓瘤细胞悬液按等体积缓缓转入其中，1700r/min离心1min，吸去上部分细胞悬液，将淋巴细胞分离液以上的20mL?30mL(中间层)转移到一无菌尖底离心管，1200r/min离心8min，去上清后用1640液悬浮，计数后备用。
[0071]d免疫脾细胞的制备
[0072]取免疫好的Balb/C小鼠一只，用小镊子摘除眼球，眼眶放血处死(收集血