生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒，包括试剂存放区和对照品存放区，所述试剂存放区内存放有装有MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的试剂瓶、装有溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液的试剂瓶、和装有甲瓒溶解液的试剂瓶，或者试剂存放区内存放有装有MTT或XTT无菌溶液的试剂瓶和装有甲瓒溶解液的试剂瓶；所述对照品存放区存放有具明显细胞毒性材料的阳性对照品或其独立包装、无细胞毒性或轻微细胞毒性材料的阴性对照品或其独立包装、和空白对照瓶。本实用新型的试剂盒使用非常方便，可以避免试验过程中可能存在污染的风险，大大提高细胞毒性检测的准确性和重复性。
【专利说明】
生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒
技术领域
[0001] 本实用新型涉及生物学领域，特别是涉及生物材料及其制品的体外细胞毒性分级 定量测定试剂盒。
【背景技术】
[0002] 细胞毒性试验是利用体外细胞培养的方法评价生物材料和医疗器械或浸提液潜 在的细胞毒性，是生物材料生物学评价体系中重要的测定指标之一，也是几乎各种用途的 医疗器械和生物材料必须进行检测的项目。细胞毒性试验能在短期内测试生物材料对细胞 代谢功能的影响，可以快速筛选材料是否具有潜在的细胞毒性。
[0003] 细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段，具有简便、敏感性高、成本低、试验 周期短等优点，广泛用于生物材料和医疗器械产品的生物相容性检测和评价手段。对生物 材料细胞毒性的评价方法从观察细胞的形态和数量变化，发展到对细胞的粘附、增殖、代谢 等方面的评价，以有活力的细胞数和细胞增殖能力作为评价生物材料细胞生物相容性的评 价方法。具体的试验有中性红摄取试验、克隆形成试验、MTT细胞毒性试验和XTT细胞毒性试 验等方法，其中以MTT和XTT细胞毒性试验方法，由于可以定量测定材料的细胞毒性，因此更 为被大家接受并且应用也更为广泛。
[0004] MTT和XTT细胞毒性试验检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT (3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide);或XTT(2，3-bis [2-methoxy-4-nitr0-5-sulfophenyI]-2H-tetrazolium-5-carboxyaniIine inner salt)]还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功 能。二甲基亚砜(DMSO)或异丙醇或吩嗪硫酸甲酯(PMS)能溶解细胞中的甲臢结晶，用酶标仪 在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，结晶形成的量与细胞数成正比。根 据测得的吸光度值(0D值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强，毒性越小。通过计 算细胞的增殖率，可以定量分级评价医用材料及其制品的细胞毒性。也可以通过浸提液的 不同浓度稀释情况下细胞的存活度计算IC 5Q(细胞活度抑制50%的浓度），评价生物材料及 其制品的细胞毒性。
[0005] 目前细胞毒性试验采用的试剂都是有试验人员自己分别进行配制，没有配备阳性 和阴性对照品，因此使用不方便，并且试验误差较大，同一材料在不同实验室间测定也会有 不同的结果。因此，需要规范统一的试剂盒可以大大提高检测的准确性和重复性，并且使用 非常方便。
【发明内容】
[0006] 针对上述技术领域中的不足，本实用新型提供生物材料及其制品的体外细胞毒性 分级定量测定试剂盒。
[0007] 生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒，其特征在于:包括试剂 存放区和对照品存放区，所述试剂存放区内存放有装有MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的试剂 瓶、装有溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液的试剂瓶、和装有甲瓒溶解液的试剂瓶，或 者试剂存放区内存放有装有MTT或XTT无菌溶液的试剂瓶和装有甲瓒溶解液的试剂瓶;所述 对照品存放区存放有具明显细胞毒性材料的阳性对照品或其独立包装、无细胞毒性或轻微 细胞毒性材料的阴性对照品或其独立包装、和空白对照瓶。
[0008] 所述试剂盒还包括样品存放区，所述样品存放区存放有用于浸提需检测样品的样 品空瓶。
[0009] 所述试剂盒还包括移液管或带刻度的注射器及其存放区。
[0010] 所述注射器为Iml-IOml-次性使用无菌注射器。
[0011] 所述阳性对照品区存放有至少一块含有有机锡的聚氨酯或聚氯乙烯材料或者盛 装有具有细胞毒性的无菌二甲基亚砜或无菌苯酚溶液的阳性对照试剂瓶，所述阴性对照品 为至少一块无菌高密度聚乙烯材料。
[0012] 所述溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液为PH7.4的无菌磷酸盐缓冲液、无菌 生理盐水或不含酚红的MEM细胞培养液，所述溶液的浓度为lmg/ml或5mg/ml，所述甲瓒溶解 液为二甲基亚砜(DMSO)或异丙醇或吩嗪硫酸甲酯(PMS)。
[0013] 所述ΡΗ7·4的无菌磷酸盐缓冲液的配方为8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HP〇4、 0.24g KH2PO4;调pH 7.4，定容1匕
[0014] 所述装有MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的试剂瓶有两瓶，每瓶中MTT无菌粉末或XTT 无菌粉末的质量为5mg;所述装有溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末溶液的试剂瓶有两瓶，每 瓶中溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液的体积为Iml或5ml，所述装有甲瓒溶解液的试 剂瓶有两瓶，每瓶中甲瓒溶解液的体积为5ml异丙醇或7.5ml二甲基亚砜。
[0015] 所述空白对照瓶和样品空瓶为容量为5ml-50ml的无菌玻璃瓶。
[0016]所述空白对照瓶一个，样品空瓶5个。
[0017] 本实用新型的试剂盒设置有试剂及其存放区，对照品及其存放区，使将生物材料 及其制品的体外细胞毒性分级定量测定一致化并标准化，并且根据细胞毒性试验过程需要 无菌的要求，采用了灭菌包装的方式，使用非常方便，也可以避免试验过程中可能存在污染 的风险，大大提高细胞毒性检测的准确性和重复性。
【附图说明】
[0018] 图1本实用新型试剂盒平面布置图，
[0019] 图2本实用新型试剂盒立体图，
[0020] 1 一试剂存放区，2-对照品存放区，3-样品存放区，4 一试剂瓶A，5-试剂瓶B，6- 试剂瓶C，7-阳性对照品，8-阴性对照品，9 一空白对照瓶，10-样品空瓶。
【具体实施方式】
[0021 ]下面结合附图对本实用新型做进一步的详细说明。
[0022]如图所示，生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒，包括试剂存 放区1、对照品存放区2和样品存放区3。对于分区的大小和格式，可以不按附图中的形式来 设计，只要能满足存放区内存放空间需要就可以。
[0023]所述试剂存放区1内存放有装有MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的试剂瓶A4、装有溶 解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液的试剂瓶B5、和装有甲瓒溶解液的试剂瓶C6;所述试 剂瓶A4有两瓶，每瓶中MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的质量为5mg;所述试剂瓶B有两瓶，每瓶 中溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液的体积为5ml或Iml，所述试剂瓶C有两瓶，每瓶中 甲瓒溶解液的体积为5ml异丙醇或7.5ml二甲基亚砜。所述溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末 的溶液为PH7.4的无菌磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水或不含酚红的MEM细胞培养液，其浓度 为lmg/ml或5mg/ml;所述甲瓒溶解液为二甲基亚砜(DMSO)或异丙醇或吩嗪硫酸甲酯(PMS); 所述PH7.4的无菌磷酸盐缓冲液的配方为NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP〇4 1.44g、KH2P〇4 0.248;调口!17.4，定容1匕
[0024]将试剂瓶A中的无菌粉末与试剂瓶B瓶中的溶液配制成无菌溶液装在试剂瓶中也 可以，为防止配制时间过长，溶液变质，优选将无菌粉末和溶解无菌粉末的溶液分别装在两 个试剂瓶中。
[0025]所述对照品存放区2存放有具明显细胞毒性材料的阳性对照品7或其独立包装、无 细胞毒性或轻微细胞毒性材料的阴性对照品8或其独立包装、和空白对照瓶9。所述阳性对 照品7为至少一块含有有机锡的聚氨酯或聚氯乙烯材料，或者盛装在阳性对照试剂瓶内具 有细胞毒性的无菌二甲基亚砜或无菌苯酚溶液，或者带包装的至少一块含有有机锡的聚氨 酯或聚氯乙烯材料，此后两者为阳性对照品的独立包装;所述阴性对照品8为至少一块无菌 高密度聚乙烯材料，或者带包装的至少一块无菌高密度聚乙烯材料。
[0026] 所述样品存放区3存放有用于浸提需检测样品的样品空瓶10。所述空白对照瓶9和 样品空瓶10为容量为5ml-50ml的无菌玻璃瓶。所述空白对照瓶9为一个，样品空瓶10为五 个。
[0027] 样品存放区3和样品空瓶10可以设置，也可以不设置，样品空瓶可以利用实验室中 的任意无菌空瓶即可。
[0028] 所述试剂盒还包括移液管或带刻度的注射器及其存放区。（未示出）
[0029] 所述注射器为Iml-IOml-次性使用无菌注射器。
[0030] 本实用新型的试剂盒设置有试剂及其存放区，对照品及其存放区，使将生物材料 及其制品的体外细胞毒性分级定量测定一致化并标准化，并且根据细胞毒性试验过程需要 无菌的要求，采用了灭菌包装的方式，使用非常方便，也可以避免试验过程中可能存在污染 的风险，大大提高细胞毒性检测的准确性和重复性。
[0031] 实施例1.
[0032] MTT 粉末：5mg
[0033] MTT 溶剂：5ml
[0034] 甲瓒溶解液(异丙醇）：5ml
[0035] 阳性对照:6cm2含有有机锡的聚氨酯。
[0036] 阴性对照:6cm2高密度聚乙烯。
[0037] 空白瓶：5ml-个。
[0038]浸提瓶：10ml 5个。
[0039] 5ml注射器：一个。
[0040] 实施例2.
[0041 ] MTT 粉末：5mg
[0042] MTT 溶剂：5ml
[0043] 甲瓒溶解液(异丙醇）：5ml
[0044] 阳性对照:6cm2含有有机锡的聚氯乙烯。
[0045] 阴性对照:6cm2高密度聚乙烯。
[0046] 空白瓶：5ml-个。
[0047] 浸提瓶：10ml 5个。
[0048] 5ml注射器：一个。
[0049] 实施例3.
[0050] MTT粉末：IOmg
[0051] MTT 溶剂：10ml
[0052] 甲瓒溶解液(异丙醇）：IOml
[0053]阳性对照A: 6cm2含有有机锡的聚氨酯。
[0054]阳性对照B: 12cm2含有低含量有机锡的聚氨酯。
[0055] 阴性对照:6cm2高密度聚乙烯。
[0056] 空白瓶：5ml-个。
[0057] 浸提瓶：10ml 10 个。
[0058] IOml 注射器：一个。
[0059] 实施例4.
[0060] MTT 溶液：5mg/5ml
[0061 ]甲瓒溶解液(DMSO) :7.5ml
[0062]阳性对照:6cm2含有有机锡的聚氨酯。
[0063] 阴性对照:6cm2高密度聚乙烯。
[0064] 空白瓶：5ml-个。
[0065] 浸提瓶:10ml 5个。
[0066] 实施例5.
[0067] XTT 粉末：5mg
[0068] XTT 溶剂：5ml
[0069] 甲瓒溶解液(吩嗪硫酸甲酯）：5ml
[0070] 阳性对照：DMSO 0.1ml。
[0071] 阴性对照:6cm2高密度聚乙烯。
[0072] 空白瓶：5ml-个。
[0073]浸提瓶：10ml 5个。
[0074] 5ml注射器：一个。
[0075]实验例:效果评价
[0076]以实施例1为例应用情况如下；
[0077] 1、阴性、阳性对照和空白瓶:分别用注射器或移液管注入Iml和样品浸提相同浸提 介质(含有牛血清的MEM培养基)并在相同温度条件下(37°C，24小时)浸提，制成阴性对照浸 提液、阳性对照浸提液和空白对照液。样品1:硅橡胶;样品2:聚氨酯;样品3:聚甲基丙烯酸 甲酯;样品4:聚乙烯;样品5:纳米银。样品按照0.2克/ml比例，在37°C，24小时浸提。
[0078] 2、MTT溶液的配制：用注射器抽取MTT溶剂(5ml)溶解MTT粉末(5mg)，配制成lmg/ml 的MTT溶液。配制后即可使用。
[0079] 3将配制好的I X IO5AiL细胞悬液(可采用L929成纤维细胞)接种于96孔培养板，设 空白对照、阴性对照、阳性对照和供试材料组，每组各设至少6孔，每孔接种100μΙ细胞悬液。 [0080] 4、置⑶2培养箱(含体积分数5%的二氧化碳气体，湿度大于90%，下同）37°C培养 24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提 液，阳性对照组加入阳性对照品浸提液，供试材料组加入试验样品浸提液，每孔100μΙ，置 CO2培养箱继续培养24h。
[0081 ] 于更换培养液后的24h，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入50μ1质量浓度为lmg/ mL的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入100μΙ甲瓒溶解液，置振荡器上振荡30min.
[0082] 5、在酶标仪测试波长570nm和参比630nm波长下测定吸光度，计算相对增殖率：
[0083]
[0084] XV1+1:
[0085] RGR--相对增殖率，％ ;
[0086] A--供试品组（阴性、阳性组)吸光度平均值；
[0087] Ao--空白对照组吸光度平均值。
[0088] 6、细胞毒性分级
[0089] 根据RGR按分级标准判定，阴性对照的反应应不大于1级，阳性对照组至少为3级反 应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。
[0090]细胞毒性反应分级 L〇〇92」7、试验结采
[0093]阳性对照:相对增殖度9.5%，细胞毒性4级。
[0094]阴性对照:相对增殖度95%，细胞毒性1级。
[0095]样品1:相对增殖度90.5%，细胞毒性1级。
[0096]样品2:相对增殖度98%，细胞毒性1级。
[0097]样品3:相对增殖度97%，细胞毒性1级。
[0098]样品4:相对增殖度87%，细胞毒性1级。
[0099]样品5:相对增殖度11%，细胞毒性4级。
[0100]以实施例3为例应用情况如下；
[0101] 1、阴性、阳性对照和空白瓶:分别注入Iml(阳性对照B加入2ml)和样品浸提相同浸 提介质(含有牛血清的MEM培养基)并在相同温度条件下(37°C，24小时)浸提，制成阴性对照 浸提液、阳性对照浸提液和空白对照液。样品1:硅橡胶;样品2:纳米银。样品按照0.2克/ml 比例，在37°C，24小时浸提。阳性对照A用培养基稀释成6%、3 %、1.5%和0.75 %，阳性对照B 稀释成100 %、75 %、50 %和25 %的浓度。
[0102] 2、MTT溶液的配制：用注射器抽取MTT溶剂(5ml)溶解MTT粉末(5mg)，配制成lmg/ml 的MTT溶液。配制后即可使用。
[0103] 3、将配制好的IX IO5AiL细胞悬液接种于96孔培养板，设空白对照、阴性对照、阳 性对照和供试材料组，每组各设至少3孔，每孔接种100μΙ细胞悬液。
[0104] 4、置⑶2培养箱(含体积分数5%的二氧化碳气体，湿度大于90%，下同）37°C培养 24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提 液，阳性对照组加入阳性对照品浸提液，供试材料组加入试验样品浸提液，每孔100μΙ，置 CO2培养箱继续培养24h。
[0105] 于更换培养液后的24h，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入50μ1质量浓度为lmg/ mL的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入100μΙ甲瓒溶解液，置振荡器上振荡30min.
[0106] 5、在酶标仪测试波长570nm和参比630nm波长下测定吸光度，计算存活率：
[0107]
[0108] 式中：
[0109] A5TOe--供试品组（阴性、阳性组)吸光度平均值；
[0110] A57Ob--空白对照组吸光度平均值。
[0111] 6、细胞毒性分级 LUl丨。」 （、讯诞拓禾
[0114]根据浓度一细胞存活率的关系曲线计算出检验样品的IC5Q值。
[0115] 阳性对照A的IC5Q为3 %。
[0116] 阳性对照B的IC5Q为45%。
[0117] 样品1的IC5q为425%，无细胞毒性。
[0118] 样品2的IC5q为4%，重度细胞毒性。
【主权项】
1. 生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒，其特征在于:包括试剂存 放区和对照品存放区，所述试剂存放区内存放有装有MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的试剂 瓶、装有溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液的试剂瓶、和装有甲瓒溶解液的试剂瓶，或 者试剂存放区内存放有装有MTT或XTT无菌溶液的试剂瓶和装有甲瓒溶解液的试剂瓶;所述 对照品存放区存放有具明显细胞毒性材料的阳性对照品或其独立包装、无细胞毒性或轻微 细胞毒性材料的阴性对照品或其独立包装、和空白对照瓶。2. 根据权利要求1所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒，其 特征在于:所述试剂盒还包括样品存放区，所述样品存放区存放有用于浸提需检测样品的 样品空瓶。3. 根据权利要求1或2所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒， 其特征在于:所述试剂盒还包括移液管或带刻度的注射器及其存放区。4. 根据权利要求3所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒，其 特征在于:所述注射器为-次性使用无菌注射器。5. 根据权利要求1或2所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒， 其特征在于:所述阳性对照品区存放有至少一块含有有机锡的聚氨酯或聚氯乙烯材料或者 盛装有具有细胞毒性的无菌二甲基亚砜或无菌苯酚溶液的阳性对照试剂瓶，所述阴性对照 品为至少一块无菌高密度聚乙烯材料。6. 根据权利要求1或2所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒， 其特征在于:所述溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液为pH7.4的无菌磷酸盐缓冲液、无 菌生理盐水或不含酚红的MEM细胞培养液，所述溶液的浓度为lmg/ml或5mg/ml，所述甲瓒溶 解液为二甲基亚砜或异丙醇或吩嗪硫酸甲酯。7. 根据权利要求1或2所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒， 其特征在于:所述装有MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的试剂瓶有两瓶，每瓶中MTT无菌粉末或 XTT无菌粉末的质量为5mg;所述装有溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末溶液的试剂瓶有两 瓶，每瓶中溶解MTT无菌粉末或XTT无菌粉末的溶液的体积为lml或5ml，所述装有甲瓒溶解 液的试剂瓶有两瓶，每瓶中甲瓒溶解液的体积为5ml异丙醇或7.5ml二甲基亚砜。8. 根据权利要求1或2所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒， 其特征在于:所述空白对照瓶和样品空瓶为容量为5ml-50ml的无菌玻璃瓶。9. 根据权利要求1或2所述的生物材料及其制品的体外细胞毒性分级定量测定试剂盒， 其特征在于:所述空白对照瓶一个，样品空瓶5个。
【文档编号】G01N33/52GK205426918SQ201620135601
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年2月23日
【发明人】张清
【申请人】张清