一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，包括盒体、位于盒体内的盖膜、衬垫。其中，盒盖与盒体通过盒盖卡头与盒体卡槽密封。盒体内的衬垫上具有若干个固定模具形成的下凹瓶位和酶标板卡槽。所述的下凹瓶位用于放置装有溶液的试剂瓶；所述的酶标板卡槽的大小与酶标板的尺寸相匹配，酶标板为48孔或者96孔聚苯乙烯试剂板。所述的盖膜位于酶标板的上方。该方法具有快速、准确、灵敏、便捷的优点，可以满足口岸实验室对该病菌快速检测的需求，适合在口岸植物检疫实验室推广使用。
【专利说明】
一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于植物病原物检测技术领域，具体涉及一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]紫花苜蓿属豆科、苜蓿属多年生草本植物，是我国乃至世界上种植数量最大的牧草品种。由于其适应性广、产量高、品质好等优点，素有“牧草之王”的美称。苜蓿根腐病是导致紫花苜蓿产量损失的主要病害之一。紫花苜蓿感病品种最多导致产量损失68%。此病病原为苜蓿疫霉根腐病菌(Phytophthora medicaginis)。随着我国畜牧业的快速发展，每年天津口岸都进口多批次苜蓿干草及苜蓿种子，该病菌一旦传入，为害非常严重，而检疫是防止该病菌在我国定植、传播最经济、最有效的方法。准确、快速、有效的检测方法是实现有效检疫的技术基础。
[0003]目前，针对苜蓿疫霉根腐病菌的快速检测方法有普通PCR方法和实时荧光PCR方法。但是，这两种PCR方法对仪器设备都有着较高的要求，需要使用昂贵的PCR仪，使用成本较高，不利于基层实验室推广使用。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的不足，本实用新型提供一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，是一种新型的检测方法，利用生物素和亲和素均可偶联抗原、抗体等生物大分子，同时也可偶联酶、荧光素、胶体金、乳胶等示踪物质，同时生物素、亲和素之间具有高度亲和力和放大作用的特点，能够在免疫反应中起到信号放大作用，能够提高反应的灵敏度和特异性而被广泛应用于检测产品的试剂盒开发。
[0005]该方法具有快速、准确、灵敏、便捷的优点，可以满足口岸实验室对该病菌快速检测的需求，适合在口岸植物检疫实验室推广使用。
[0006]为了实现上述目的，本实用新型提供一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，包括盒体、位于盒体内的盖膜、衬垫。其中，盒盖与盒体通过盒盖卡头与盒体卡槽密封。盒体内的衬垫上具有若干个固定模具形成的下凹瓶位和酶标板卡槽。所述的下凹瓶位用于放置装有溶液的试剂瓶;所述的酶标板卡槽的大小与酶标板的尺寸相匹配，酶标板为48孔或者96孔聚苯乙烯试剂板。所述的盖膜位于酶标板的上方。优选地，所述的酶标板真空密封于铝箔袋内。
[0007]所述盒体内的衬垫还设有分隔试剂槽，所述分隔试剂槽分隔各试剂瓶。
[0008]试剂盒包括有I瓶装有苜蓿疫霉根腐病菌单克隆抗体工作液的试剂瓶，I瓶装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液的试剂瓶，1-4瓶装有苜蓿疫霉根腐病菌标准液的试剂瓶，1-3瓶装有底物显色液的试剂瓶，1-2瓶装有终止液的试剂瓶，1-2瓶装有洗涤液的试剂瓶，1-2瓶装有缓冲液的试剂瓶。
[0009]试剂盒的试剂瓶内的具体成分如下:
[0010](I)苜蓿疫霉根腐病菌单克隆抗体工作液I瓶/7ml;
[0011](2)苜蓿疫霉根腐病菌标准品溶液lml/瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5yg/L、13.5yg/L、40.5yg/L；
[0012](3)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液7ml /瓶；
[O 013 ] (4)底物显色液，分别为底物显色A液，底物显色B液，底物显色液A液为过氧化脲7ml/瓶，底物显色液B液为四甲基联苯胺7ml/瓶；
[0014](5)终止液 7ml/瓶；
[0015](6)缓冲液50ml /瓶，为含有I %甲醇、0.01-0.05mo 1/L磷酸盐缓冲液。使用时2倍稀释。
[0016](7)洗涤液40ml/瓶，为含有0.8 % -1.2 %吐温-20,0.5%叠氮化钠、0.0 lmol/L磷酸盐缓冲液。使用时20倍稀释。
[0017]优选地，利用不同颜色或者大小的试剂瓶对装有不同试剂的试剂瓶进行区分，例如，所述装有苜蓿疫霉根腐病菌单克隆抗体工作液的试剂瓶为黄色瓶帽的棕色塑料瓶，装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液的试剂瓶为粉色瓶帽的棕色塑料瓶，所述装有苜蓿疫霉根腐病菌标准液的试剂瓶为绿色瓶帽的白色塑料瓶，所述装有底物显色液的试剂瓶为白色瓶帽的棕色玻璃瓶，所述装有终止液的试剂瓶为蓝色瓶帽的半透明塑料瓶，所述装有洗涤液的试剂瓶为透明瓶帽的半透明塑料瓶，所述装有缓冲液的试剂瓶为红色瓶帽的黑色塑料瓶。这样，所需试剂用不同颜色的试剂瓶封装在盒体内，易于快速区分。
[0018]本实用新型的有益效果是:提供一种苜蓿疫霉特异性检测试剂盒，提高产品灵敏度和反应特异性，该方法具有快速、准确、灵敏、便捷的优点，可以满足口岸实验室对该病菌快速检测的需求，适合在口岸植物检疫实验室推广使用。
【附图说明】
[0019]图1为本实用新型的俯视图；
[0020]图2为本实用新型酶标板的俯视图；
[0021 ]图3为本实用新型衬垫的俯视图；
[0022]图中:1、盒盖;2、盒体;3、酶标板;4、盖膜;5、衬垫;6、试剂瓶;7、分隔试剂槽
[0023]101、盒盖卡头；201、盒体卡槽；301、酶标板外框支架；302、酶标反应微孔；501?504、下凹瓶位;505、酶标板卡槽。
【具体实施方式】
[0024]以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步的详细描述。
[0025]图1所示苜蓿疫霉特异性检测试剂盒，包括盒体和包被有抗原的酶标板。盒体内的衬垫上具有若干个固定模具形成的下凹瓶位和酶标板卡槽。所述的下凹瓶位用于放置装有溶液的试剂瓶;所述试剂瓶包括:装有苜蓿疫霉根腐病菌标准液的试剂瓶，装有底物显色液的试剂瓶，装有终止液的试剂瓶，装有洗涤液的试剂瓶，装有缓冲液的试剂瓶。
[0026]所述的酶标板卡槽的大小与酶标板的尺寸相匹配，酶标板为48孔或者96孔聚苯乙烯试剂板。
[0027]所述的盖膜位于酶标板的上方。
[0028]所述的酶标板真空密封于铝箔袋内。
[0029]所述盒体内的衬垫还设有分隔试剂槽，所述分隔试剂槽分隔各试剂瓶。
[0030]如图2所示酶标板2为设置有96个反应孔的可拆卸微孔板。
[0031 ]试剂盒的试剂瓶内的具体成分如下:
[0032](I)苜蓿疫霉根腐病菌单克隆抗体工作液I瓶/7ml;
[0033](2)苜蓿疫霉根腐病菌标准品溶液lml/瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5yg/L、13.5yg/L、40.5yg/L；
[0034](3)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液7ml/瓶；
[0035](4)底物显色液，分别为底物显色A液，底物显色B液，底物显色液A液为过氧化脲7ml/瓶，底物显色液B液为四甲基联苯胺7ml/瓶；
[0036](5)终止液 7ml/瓶；
[0037](6)缓冲液50ml /瓶，为含有I %甲醇、0.01-0.05mo 1/L磷酸盐缓冲液。使用时2倍稀释。
[0038](7)洗涤液40ml/瓶，为含有0.8 % -1.2 %吐温-20,0.5%叠氮化钠、0.0 lmol/L磷酸盐缓冲液。使用时20倍稀释。
[0039]本实用新型的检测过程:
[0040]I)样品前处理:样本要求如下:
[0041 ]操作时应按照微生物和生物医学实验室生物安全通则进行。
[0042]如果不能立即检测，3天以内的样本可以4度保存，如果放置-20度至少保存3个月。
[0043]测试前将冷冻保存的样本慢慢恢复至室温后混匀使用，避免样本反复冻融。
[0044]2)标准曲线建立:向酶标板中每孔先加入10yL试剂盒所提供8个系列的苜蓿疫霉根腐病菌标准溶液，再加入50yL稀释后的酶标抗体，酶标抗体的稀释度1:80K，在25°C温育15分钟，加入300μ!7孔的洗涤液，静置2分钟后拍干，重复用洗涤液洗涤5次后，每孔加入发光液ISOyL，5分钟后在化学发光检测仪上检测。以所得标准溶液的发光值，除以最低浓度对应的发光值再乘以100，得到抑制率，以抑制率为纵坐标，以苜蓿疫霉根腐病菌浓度的对数为横坐标作标准曲线。
[0045]3)待测样品的检测分析:向酶标板中每孔先加入处理好的待测样品，再加入50yL稀释后的酶标抗体，酶标抗体的稀释度1:80K，在25°C下温育15分钟，用洗涤液洗涤5次后，每孔加入发光液180yL，5分钟后在化学发光检测仪上检测。以加入待测样品的发光值从标准曲线上计算待测样品中苜蓿疫霉根腐病菌的含量。
[0046]本实用新型的有益效果在于:本实用新型将具有高度灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，操作简便，用时短，无需长时间显色及终止，且灵敏度高，特异性好，能快速、简便、灵敏地用于苜蓿疫霉根腐病菌的检测。该试剂盒可检出的最低检测限为0.0125ng/mL，可一次性进行多个样本的测定，减少检测样本所需要的时间。本实用新型具有节约成本、操作简便快速、可在非实验室条件下进行、便于携带和运输的特点。
【主权项】
1.一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体、位于盒体内的盖膜、衬垫;其中，盒盖与盒体通过盒盖卡头与盒体卡槽密封;盒体内的衬垫上具有若干个固定模具形成的下凹瓶位和酶标板卡槽;所述的下凹瓶位用于放置装有溶液的试剂瓶;所述的酶标板卡槽的大小与酶标板的尺寸相匹配，酶标板为48孔或者96孔聚苯乙烯试剂板;所述的盖膜位于酶标板的上方。2.如权利要求1所述的一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，所述的酶标板真空密封于铝箔袋内。3.如权利要求1所述的一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，所述盒体内的衬垫还设有分隔试剂槽，所述分隔试剂槽分隔各试剂瓶。4.如权利要求1所述的一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，所述试剂瓶包括:I瓶装有苜蓿疫霉根腐病菌单克隆抗体工作液的试剂瓶，I瓶装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液的试剂瓶，1-4瓶装有苜蓿疫霉根腐病菌标准液的试剂瓶，1-3瓶装有底物显色液的试剂瓶，1-2瓶装有终止液的试剂瓶，1-2瓶装有洗涤液的试剂瓶，1-2瓶装有缓冲液的试剂瓶。5.如权利要求4所述的一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，所述装有苜蓿疫霉根腐病菌单克隆抗体工作液的试剂瓶为黄色瓶帽的棕色塑料瓶，装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液的试剂瓶为粉色瓶帽的棕色塑料瓶，所述装有苜蓿疫霉根腐病菌标准液的试剂瓶为绿色瓶帽的白色塑料瓶，所述装有底物显色液的试剂瓶为白色瓶帽的棕色玻璃瓶，所述装有终止液的试剂瓶为蓝色瓶帽的半透明塑料瓶，所述装有洗涤液的试剂瓶为透明瓶帽的半透明塑料瓶，所述装有缓冲液的试剂瓶为红色瓶帽的黑色塑料瓶。6.如权利要求4所述的一种苜蓿腐霉根腐病菌特异性检测试剂盒，所述装有苜蓿疫霉根腐病菌单克隆抗体工作液的试剂瓶的规格为7ml/瓶，装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液的试剂瓶的规格为7ml /瓶，装有苜蓿疫霉根腐病菌标准液的试剂瓶的规格为Iml/瓶，浓度分别为0yg/L、0.5yg/L、1.5yg/L、4.5yg/L、13.5yg/L、40.5yg/L;装有底物显色液的试剂瓶的规格为7ml/瓶，装有终止液的试剂瓶的规格为7ml/瓶，装有洗涤液的试剂瓶的规格为40ml/瓶，装有缓冲液的试剂瓶的规格为50ml/瓶。
【文档编号】G01N21/76GK205484362SQ201620179836
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月9日
【发明人】郑春生, 高文娜, 边勇
【申请人】中华人民共和国北京出入境检验检疫局