一种防控连作草莓根腐病的拮抗放线菌及其生防制剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种防控连作草莓根腐病的拮抗放线菌及其生防制剂的制备方法，该菌株B04属于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，其菌种保藏号为CGMCC NO.9918。本发明提供的生防菌株B04，分离自健康草莓根际，对引起草莓土传根部病害的病原菌镰刀菌、大丽轮枝菌，丝核菌及疫霉菌等有强烈的抑制作用。以蚯蚓粪和麦麸作为发酵培养基的主要原料制备放线菌生防制剂，可完全满足生防放线菌固体发酵生产的营养需求。且生产成本较常规发酵下降30％～50％，有利于放线菌生防制剂的推广应用。在连作草莓的土壤上施用该放线菌生防制剂后，生物防治率达70％以上，对防控草莓土传病害，提高农产品品质，保护环境有重要意义。CGMCC No991820141102
【专利说明】一种防控连作草莓根腐病的拮抗放线菌及其生防制剂的制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种防控连作草莓根腐病的拮抗放线菌及用蚯蚓粪及麦麸固体发酵 生产生防活菌制剂的方法，属于农业集约化【技术领域】，生防活菌制剂专用于防控连作草莓 土传病害问题。
【背景技术】
[0002] 草莓（Fragaria ananassa)是多年生草本植物，果实柔软多汁，营养丰富，富含多 种维生素，被誉为"水果皇后"。因其适应性强，生育期短，结果早，经济效益高等特点而备受 欢迎。草莓是设施连作栽培，草莓连作从零星发生到大面积发病只需2?3年的时间，且连 作重茬严重地块发病率达80%，严重制约了设施草莓产业的发展。研究表明，草莓连作土 传病害是由多种病原菌引起的综合性土传根部病害，主要有镰刀菌（Fusarium oxysporun) 引起的枯萎病、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)引起的黄萎病，丝核菌（Rhizoctonia solani)引起的立枯病、疫霉菌（Phytophthora fragariae)引起的根腐病等。目前没有防 治草莓连作土传病害的有效手段，利用土壤微生物防治病害是综合防治土传病害的重要措 施之一。生物防治技术满足了现代农业对环境保护、食品安全等的要求，是实现农业可持续 的有效方法之一。
[0003] 目前放线菌活菌制剂的常规生产多以黄豆粉、玉米粉、酵母粉等价格较高的农副 产品为原料，生产成本较高，限制了放线菌活菌制剂的进一步推广应用，据报道放线菌活菌 制剂生产原料占整个生产成本的30?40%，因此，选择低成本的原料是放线菌活菌制剂商 业化生产及推广的关键。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种防除连作草莓根腐病的拮抗放线菌。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种放线菌生防制剂。该生防制剂防控连作草莓土传 病害效率达到70%以上，确保集约化农业的顺利发展。
[0006] 本发明的又一目的在于提供一种利用菌株B04制备放线菌生防制剂的方法。现有 技术中的放线菌生防制剂固体发酵生产多用黄豆粉、玉米粉、酵母粉等农副产品作原料，成 本较高。蚯蚓粪含有丰富的有机质、氮、磷、钾及多种氨基酸，麦麸含有丰富的蛋白质、淀粉、 脂肪、无机盐、生物素及维生素是放线菌生长发育的良好基质，用于发酵生产放线菌生防制 剂成本低廉，防效可靠，利于放线菌生防制剂大范围推广应用。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008] -种防控连作草莓根腐病的拮抗放线菌，该菌株B04属于吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)，其菌种保藏号为 CGMCC NO. 9918。该菌株于 2014 年 11 月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号)，其主要生物学特性为在PDA培养基上最佳的生长温度28°C，培养5?7 天，形成直径2?4mm的菌落，菌落早期呈白色，后期呈灰色，分生孢子丰富，有吸水现象。
[0009] 上述的菌株B04在制备放线菌生防制剂中的应用。
[0010] 一种放线菌生防制剂，是将所述的菌株B04扩大培养后接种到以蚯蚓粪和麦麸为 主要原料的发酵培养基中进行发酵培养得到孢子总数> IOltl个/g的放线菌生防制剂。所 述发酵培养基的制备方法为：将蚯蚓粪和麦麸混合均匀后调节含水率至50 %?60 %、pH至 8. 5?9. 0,每Kg基质中添加5g CaCO3，混匀后，灭菌。所述蚯蚓粪和麦麸的质量比优选为 1:1 ?1. 5。
[0011] 利用所述菌株B04制备放线菌生防制剂的方法，包括以下步骤：
[0012] (1)放线菌液体种子扩大培养：取菌株B04的分生孢子，接种到液体种子培养基 中，摇床培养得到放线菌液体种子；
[0013] (2)制备放线菌生防制剂：将蚯蚓粪和麦麸混合均匀后调节含水率至50%? 60%、pH至8. 5?9. 0,每Kg基质中添加5g CaCO3，混勻后，装入固体发酵罐中灭菌后，按 10%?15% (w/w)的比例接入步骤（1)制备的放线菌液体种子，发酵培养制得放线菌生防 制剂。
[0014] 步骤（2)中所述蚯蝴粪和麦麸的质量比优选为1:1?1. 5。
[0015] 上述蚯蚓粪中有机质的质量百分含量为25 %?38%。
[0016] 步骤（2)中所述发酵的条件为：控制罐温28?30°C、通气量1?3m3/h和罐压 0· 01?0· 05Mpa，每隔8h搅拌一次，转速50?70rpm，搅拌20?30min。
[0017] 上述的放线菌生防制剂中菌株B04孢子总数彡101°个/g。
[0018] 步骤（1)中所述液体种子培养基的配方为：黄豆粉30. Og/L，葡萄糖45. Og/L，酵母 膏5. Og/L，CaC033. Og/L，pH7. 5?8. 0 ;所述摇床培养的条件为在温度28?30°C下，转速 180r/min的条件下摇床培养48h。
[0019] 上述的放线菌生防制剂在防控连作草莓根腐病中的应用。
[0020] 蚯蚓粪含有丰富的有机质、氮、磷、钾及多种氨基酸，麦麸含有丰富的蛋白质、淀 粉、脂肪、无机盐、生物素及维生素是放线菌生长发育的良好基质，用蚯蚓粪及麦麸混合物 固体发酵放线菌孢子数量达到10 1°个/g，并且成本仅及常规发酵的1/2?1/3。因此，用 蚯蚓粪及麦麸生产生防放线菌活菌制剂是一种低成本高效的生产方法。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明提供的生防放线菌菌株B04及其利用蚯蚓粪及麦麸固体发酵生产活菌制 剂的方法，具有以下有益效果：
[0023] 1、本发明提供的生防菌株B04,分离自健康草莓根际，对引起草莓土传根部病害 的病原菌镰刀菌（Fusarium oxysporun)、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)，丝核菌 (Rhizoctonia solani)及疫霉菌（Phytophthora fragariae)等有强烈的抑制作用。
[0024] 2、本发明提供的生产原料之一蚯蚓粪，营养丰富，成本低廉；原料之二是农副产品 麦麸，量大价廉易得。两者按一定比例配合，可完全满足生防放线菌固体发酵生产的营养需 求。且生产成本较常规发酵下降30?50%，有利于放线菌生防制剂的推广应用。
[0025] 3、利用生防菌株B04将蚯蚓粪及麦麸开发成更高附加值的生防制剂，试验结果表 明，在连作草莓的土壤上施用本产品后，生物防治率达70%以上，对防控草莓土传病害，提 高农产品品质，保护环境有重要意义。
[0026] 4、放线菌B04是生物制剂，没有因为化学农药的使用所带来的一系列问题，因而 有利于草莓的无公害生产，农民可以减少其它防治土传病害化学农药的使用量，这不仅可 为农民节省开支，而且有利于提高农产品的质量，从而增加农民的收入。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为利用蚯蚓粪和麸皮混合物固体发酵生产抗放线菌生防制剂的方法流程图。
【具体实施方式】
[0028] 1、菌株的分离和鉴定
[0029] 采集南京麒麟镇后村发生连作障碍严重，健康草莓植株根际的土壤分离放线菌， 利用PDA培养基采用对峙法筛选对草莓土传根部病害的病原菌镰刀菌（F. oxysporun)、大 丽轮枝菌（V. dahliae)，丝核菌（R. solani)、疫霉菌（P. fragariae)等有强烈抑制作用的拮 抗放线菌。再通过盆栽试验复筛，最终获得高效拮抗放线菌B04菌株，并进行菌种生物学鉴 定，菌种保存于4冰1：箱。
[0030] 生防菌株B04属于吸水链霉菌（S. hygroscopicus)，主要生物学特性为：在PDA培 养基上最佳的生长温度28, °C培养5?7天，形成直径2?4mm的菌落，菌落早期呈白色， 后期呈灰色，有吸水现象，孢子丝呈紧密螺旋状，分生孢子柱形。
[0031] 2、生防制剂生产
[0032] (I) S. hygroscopicus菌株B04液体种子培养：从斜面上取3环菌株B04的分生孢 子，接种到IOOmL灭菌的液体种子培养基中，进行液体种子培养，其培养条件为：培养液初 始pH = 7. 5,培养温度范围28°C，摇床转速为180rpm，发酵时间48h，3000rpm离心10min， 菌丝体含量15 %?20%。
[0033] 所用种子培养液配制方法为（以配制IL培养基为例）：黄豆粉30. 0g，葡萄糖 45. 0g，酵母膏 5. 0g，CaC033. 0g，pH 7. 5 ;用水定容至 1L，pH 调至 7. 5,121°C灭菌 20min。
[0034] (2)以蚯蝴粪及麦麸为原料发酵生产生防放线菌制剂：用含有机质为25%?38% 的蚯蚓粪及麦麸按质量比1:1混合作为固体发酵生防放线菌的原料，将蚯蚓粪及麦麸均匀 混合，调节含水率50 %?60%，采用稀酸（HCl)或稀碱（NaOH)调节pH至8. 5?9.0,在 每Kg基质中添加5g CaCO3，混匀后，装入50升不锈钢固体发酵罐中，经121 °C，30min灭菌 后，冷却至30°C，按10%?15% (w/w)的比例接入放线菌B04的液体种子，控制罐温28? 30°C，通气量1?3m3/h，罐压0. 01?0. 05Mpa，每隔8h搅拌一次，转速50?70rpm，搅拌 20?30min，发酵5?6天后结束，生产出的放线菌B04活菌制剂的孢子总数达IO ltl个/g 以上。如图1所示。3、温室防效试验
[0035] 考察拮抗菌株B04生物制剂防控草莓土传病害的能力。试验土壤为连作土壤，根 腐病发病严重。草莓品种采用种植面积较大的"红颊"，试验设计如下：
[0036] CK :对照，草莓连作土壤；
[0037] 处理1 :草莓连作土壤+B04生物制剂处理；
[0038] 处理2 :草莓连作土壤+蚯蚓粪处理；
[0039] I. 5Kg连作土 /盆钵，每处理30盆，1棵苗/盆。处理1 :每盆施用B04生物制剂 (IOg);处理2 :每盆施蚯蚓粪（5g)，采用移苗前穴施；对照：每颗补施与5g蚯蚓粪营养成分 相当的N、P、K化学肥料，所有处理均为等养分。草莓品种"红颊"，扦插育苗，于2013年9月 15日移栽到1. 5公斤的盆钵中，在盆钵中生长至60天取样统计发病程度，计算病情指数，测 定植株总鲜重，根鲜重及单株产量考察促生效果。
[0040] 施加 B04生物制剂处理，施加蚯蚓粪处理均能降低根腐病发病率，其中施加 B04 生物制剂处理表现出较好的防治效果，其发病率防治效果71. 6%，施加蚯蚓粪防治效果 6. 1%。施加 B04生物制剂处理及蚯蚓粪处理的草莓茎叶鲜重分别增加了 32. 5%和10. 6%， 根鲜重增加了 18. 1%和5. 6%，单株产量分别增加了 30. 3%和7. 3%。结果表明施加 B04 生物制剂及蚯蚓粪处理均能可促进草莓生长发育，其中B04生物制剂对草莓营养生长促进 效果显著（见表1)。
[0041] 表1温室盆栽实验各处理对草莓根腐病防治效果、草莓生长及产量的影响
【权利要求】
1. 一种防控连作草莓根腐病的拮抗放线菌，该菌株B04属于吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)，其菌种保藏号为 CGMCC N0.9918。
2. 权利要求1所述的菌株B04在制备放线菌生防制剂中的应用。
3. -种放线菌生防制剂，其特征在于是将权利要求1所述的菌株B04扩大培养后接种 到以蚯蚓粪和麦麸为主要原料的发酵培养基中进行发酵培养得到孢子总数> 101°个/g的 放线菌生防制剂。
4. 利用权利要求1所述菌株B04制备放线菌生防制剂的方法，其特征在于包括以下步 骤： (1) 放线菌液体种子扩大培养：取菌株B04的分生孢子，接种到液体种子培养基中，摇 床培养得到放线菌液体种子； (2) 制备放线菌生防制剂：将蚯蚓粪和麦麸混合均匀后调节含水率至50 %?60%、pH 至8. 5?9. 0,每Kg基质中添加5g CaC03，混勻后，装入固体发酵罐中灭菌后，按10%?15% (w/w)的比例接入步骤（1)制备的放线菌液体种子，发酵培养制得放线菌生防制剂。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤⑵中所述蚯蝴粪和麦麸的质量比为 1:1 ?1. 5。
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤（2)中所述蚯蚓粪中有机质的质 量百分含量为25 %?38%。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（2)中所述发酵的条件为：控制罐温 28?30°C、通气量1?3m3/h和罐压0? 01?0? 05Mpa，每隔8h搅拌一次，转速50?70rpm， 搅拌20?30min。
8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的放线菌生防制剂中菌株B04孢子总 数彡101°个/g。
9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（1)中所述液体种子培养基的配方为： 黄豆粉30. Og/L，葡萄糖45. Og/L，酵母膏5. Og/L，CaC033. Og/L，pH 7. 5?8. 0 ;所述摇床培 养的条件为在温度28?30°C下，转速180r/min的条件下摇床培养48h。
10. 权利要求2、3或4中所述的放线菌生防制剂在防控连作草莓根腐病中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104403976SQ201410749393
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】王世梅, 沈婷, 王辰, 徐阳春, 沈标, 韦中, 沈其荣 申请人:南京农业大学