专利名称：一种虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源 的方法。适用于调查亲本物种变异类型较多的各种异源多倍体物种的起源。
背景技术：
多倍体物种广泛存在于高等植物中，根据染色体组是否来源于相同物种，可分为 同源多倍体和异源多倍体。很多重要作物比如甘蓝型油菜、陆地棉和普通栽培小麦都是异 源多倍体物种，其染色体组来自于至少两个不同的亲本物种。尽管很多异源多倍体物种的染色体组组成已被揭示，但是由于亲本种的变异类型 众多，遗传变异广泛，人们对于异源多倍体物种各亚基因组的供体亲本类型并不是很清楚， 由此也引起了对其起源和进化上的争论。调查异源多倍体亲缘关系和起源可通过种间杂交、细胞学和分子生物学方法等方 法进行，其中一种重要的方法是利用亲本物种合成并重演异源多倍体物种的形成。该方 法主要包括以下过程利用亲本物种进行种间杂交，人工合成异源多倍体，再与现有的自然 异源多倍体进行分子生物学等方面的比较，最后根据来源于不同类型的亲本物种的人工合 成种与自然异源多倍体的相似程度来推测该异源多倍体的原始祖先种类型。该方法能较大 程度地模拟异源多倍体遗传物质的起源，是一种较为直接的方法。但该法存在以下主要缺 点人工合成异源多倍体过程繁琐，涉及远缘杂交，胚挽救，染色体加倍等程序，工作量大， 且难以成功获得源于所有亲本物种类型的人工合成种。另一种方法是，对亲本物种不同类型和自然异源多倍体进行比较，根据亲本种各 变异类型与自然异源多倍体遗传差异程度，推测该异源多倍体的亲本种类型。该法虽然简 单易行，但异源多倍体包含了来源于两个或更多物种的不同基因组，在分析某一种亲本物 种与异源多倍体关系的过程中，异源多倍体中源于另一(其它)亲本物种的基因组会对分析 造成干扰。现代分子生物学的快速发展为研究异源多倍体的起源提供新的途径，如通过测序 比较亲本物种和自然异源多倍体某些基因的DNA序列差异，通过细胞质DNA的分子标记，比 较亲本物种和自然异源多倍体细胞质遗传物质的差异等，但以上该方法均需事前获得某特 异基因的序列和开放出特异的引物，并且其揭示的信息量在基因组水平上非常有限。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法，该 方法结合现代分子生物学方法模拟人工合成异源多倍体物种的分子特征，为研究异源多倍 体的起源提供了新的途径，本发明的主要特点是采用了人工合成异源多倍体的原理，但避 免了人工合成的繁琐过程，可同时对待测亲本物种的所有变异类型进行分析，亦能扣除另 一(其它)亲本种基因组对分析结果的影响，方法简单，时间周期短，耗资少，节省人力物力。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施
3本发明的原理是很多重要作物都是异源多倍体物种，其起源和进化上一直存在着争 论。研究异源多倍体起源物种起源的多种方法中，利用亲本种合成并重演物种的形成是研 究其起源最直接和重要的方法，但是该法过程复杂，且难以将亲本种的所有变异类型都囊 括在内。基于该法，本发明阐述了一种利用虚拟合成物种研究异源多倍体起源的方法，其基 本原理是在合成异源多倍体物种的过程中，亲本物种的遗传物质传递给后代，亲本物种具 有的分子特征能在合成后代中得到体现，因此对待测亲本不同变异类型和另一亲本物种进 行全基因组的分子扫描，继而模拟出不同来源的异源多倍体的分子特征(即虚拟合成异源 多倍体)，并与自然异源多倍体材料的分子特征进行比较，根据遗传差异的大小推导自然异 源多倍体物种的亲本类型。基于虚拟合成物种的策略研究异源多倍体物种起源的优点是， 该法能扣除另一(其它)亲本物种基因组对分析结果的影响；能对亲本种的任何变异类型进 行异源多倍体的虚拟合成，可在尽可能大的范围内寻找异源多倍体原始亲本供体类型；无 需经历杂交、胚挽救、染色体加倍等过程，省时省力。本发明提出的虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法步骤如下
1)将亲本物种及自然异源多倍体全基因组分子扫描采用SSR、AFLP等常规PCR技术 对自然异源多倍体及其亲本物种进行全基因组水平分子标记特征扫描；
2)虚拟合成异源多倍体根据合成异源多倍体过程中，亲本具有的分子特征能在合成 后代中得到体现的原则，双亲或亲本之一中标记为“1”的则在虚拟合成异源多倍体中记为 “1”，在双亲中都为“0”的则在虚拟合成异源多倍体中记为“0”，据此利用双亲的分子标记 数据模拟出合成种的分子标记数据；
3)亲缘关系分析利用NTSYS软件计算各亲本与自然异源多倍体，以及各虚拟合成异 源多倍体与自然异源多倍体间的遗传距离，并对分子标记数据进行UPGMA聚类分析和主成 分分析(PCA)；用STRUCTURE软件分析二倍体亲本的不同变异类型与自然异源多倍体之间 的血缘关系；用ARLEQUIN软件，按亲本物种进行分子标记方差分析(AMOVA)，检验各亲本物 种对虚拟合成异源多倍体遗传差异的贡献率；用SAS软件对来源于同一亲本物种内不同个 体的虚拟合成异源多倍体之间的遗传距离进行方差分析(AN0VA)，并对亲本与自然异源多 倍体、虚拟合成异源多倍体与自然异源多倍体间的遗传距离进行方差分析及多重比较。通 过以上分析揭示不同亲本种类型模拟合成的虚拟异源多倍体与自然异源多倍体相互间遗 传差异的大小，根据遗传差异越小，该亲本类型与异源多倍体越为接近，则该类型越可能是 异源多倍体中亚基因组的来源的原则，推导异源多倍体中亚基因组的来源。本发明的特征在于上述步骤的2) -3)。步骤2)根据合成异源多倍体过程中，亲 本具有的分子特征能在合成后代中得到体现的原则，利用双亲的分子标记数据模拟出合成 种的分子标记数据。该步骤避免了传统的人工合成异源多倍体的繁琐过程，能模拟出所有 亲本物种变异类型所产生的异源多倍体的标记特征，从而做到在更广的范围里寻找异源多 倍体种亚基因组的来源；克服了直接利用亲本种与自然异源多倍体进行遗传差异分析的不 足，在分析待测亲本物种与异源多倍体的关系时，通过虚拟合成多倍体物种将另一亲本种 基因组的分子特征纳入其中，再经步骤3)与自然异源多倍体进行比较，从而扣除另一亲本 种基因组对遗传差异的影响。本发明针对的多倍体为异源多倍体，即染色体来源于至少两种不同物种的多倍 体。本发明适用于亲本物种变异类型较多的异源多倍体物种的祖先种类型推测，是一种适
4用范围广，简单高效的调查异源多倍体起源的方法。本发明涉及的分子标记可以是基于PCR技术的全基因组水平分子标记种的任意 一种或多种，如AFLP，SSR, RAPD, ISSR等；所采用的数据分析软件可以是SAS、SPSS等软 件及其他具有类似功能的软件；所采用的遗传关系分析软件可以选择NT-SYS、STRUCTURE 等软件，其它具有相应功能的软件均可采用。本发明所涉及的实验方法如基于PCR的全基 因组水平分子标记，遗传关系的分析均为分子生物学常规技术手段，为已有技术；各类分析 软件可通过相应网站获得；各类试剂均可从商业途径获得。本发明优点在于可同时对待测亲本物种的所有变异类型进行分析，能扣除另一 亲本种基因组对遗传差异的影响，简单高效，省时省力。
图1为利用虚拟合成物种研究异源多倍体物种起源的原理示意图。通过比较虚拟 合成多倍体和自然异源多倍体的全基因组水平分特征，揭示两者间的遗传差异，从而推导 该自然异源多倍体的亲本种类型。双箭头表示两者之间的标记特征可相互推导，直线表示 两者之间进行遗传差异比较。图2为虚拟异源多倍体的合成原理示意图。箭头左边部分为合成异源多倍体物 种中双亲染色体的传递行为不同物种合成异源多倍体时，双亲的遗传物质均传递给后代， 亲本种具有的分子特征能在合成后代中体现。其中，P1和P2分别代表亲本1和亲本2，竖立 长方条代表染色体，两侧的阿拉伯数字表示标记位点，相同的数字代表位点相同，长方条中 出现横线代表某位点上的标记类型为“1”(如亲本ι中的位点1和位点2，以及亲本2中的 位点1和位点3)，没有横线则代表该位点标记类型为“0”(如亲本1和亲本2中的位点4)。 箭头右边部分为根据双亲标记类型模拟合成异源多倍体标记类型的过程对于虚拟合成异 源多倍体，在双亲中同时存在(如位点1)或在双亲之一中存在(如位点2和位点3)的标记 类型记为“1”，在双亲中都没有(如位点4)的标记类型记为“0”。图3为甘蓝、白菜型油菜和自然甘蓝型油菜基于SSR和AFLP标记的聚类关系图。 三个物种材料分别各自成群，其中甘蓝的十七种变异类型可划分为三个主要类群甘蓝类 群I，甘蓝类群II和甘蓝类群III。图4为甘蓝、白菜型油菜和自然甘蓝型油菜间的血缘关系示意图。横坐标的阿拉 伯数字为材料编号(与图3相同)，横线下的罗马数字I V分别代表甘蓝类群I、甘蓝类群 II、甘蓝类群III、白菜型油菜和自然甘蓝型油菜，纵坐标代表血缘所占比例；图中不同的 颜色代表不同的血缘。结果显示，按照血缘所分类群与聚类分析中所划分类群(图3)相符， 三个甘蓝类群间存在三种截然不同的血缘组成，自然甘蓝型油菜具有部分与甘蓝类群I中 甘蓝相同的血缘(浅灰色)。图5为甘蓝、白菜型油菜、虚拟甘蓝型油菜和自然甘蓝型油菜基于SSR和AFLP标 记的主成分分析图(PCA)。横坐标表示第一主成分，纵坐标表示第二主成分；正方形代表白 菜型油菜，四角星代表自然甘蓝型油菜，三角形代表甘蓝(其中白色、浅灰色和深灰色三角 形分别代表甘蓝类群I、II和III中的甘蓝)，圆形代表虚拟合成甘蓝型油菜(其中白色、浅 灰色和深灰色圆分别代表由甘蓝类群I、II和III中的甘蓝与白菜型油菜虚拟合成的甘 蓝型油菜)。PCA结果表明，第一主成分解释的变异度为48. 3%，第二主成分解释的变异度为27. 0%;虚拟合成甘蓝型油菜比其亲本物种更接近于自然甘蓝型油菜，其中来源于甘蓝类群 I的虚拟合成甘蓝型油菜与自然甘蓝型油菜的遗传特征最接近。
具体实施例方式本发明突出的实质性特点可从下述实施例得以体现，但并不对本发明作任何限 制。本实施例选择的异源多倍体物种为甘蓝型油菜(基因组为AACC)，其亲本物种为甘 蓝(基因组为CC)和白菜型油菜(基因组为AA)，待测亲本物种为甘蓝。针对涉及十七种不同 变异类型的39份甘蓝材料，利用4份不同遗传背景的白菜型油菜与其合成了 156份虚拟甘 蓝型油菜，通过与6份不同遗传背景的甘蓝型油菜进行遗传差异分析，发现甘蓝型油菜中C 亚基因组很可能来源于栽培甘蓝及部分与其遗传关系较近的野生甘蓝，与前人研究结果相 符。该实例证明了本发明方法(一种虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法)具有可 行性。实施例1
虚拟合成甘蓝型油菜调查甘蓝型油菜中C亚基因组来源的方法，其步骤如下 甘蓝和白菜型油菜(亲本物种)及甘蓝型油菜全基因组水平分子特征扫描采用SSR和 AFLP标记技术，对甘蓝的十七种变异类型、不同遗传背景的白菜型油菜，以及不同遗传背景 的自然甘蓝型油菜进行全基因组水平分子标记分析；
虚拟合成甘蓝型油菜根据甘蓝和白菜型油菜的标记类型，按照图2所示原则模拟出 合成甘蓝型油菜的分子标记数据；
亲缘关系分析利用 NTSYS-PC (http://www. exetersoftware. com/cat/ntsyspc/ ntsyspc. html 下载)、STRUCTURE (http:// pritch. bsd. uchicago. edu/ structure. Html 下载)、ARLEQUIN (http://cmpg. unibe. ch/software/arlequin3 下载)等遗传关系 分析软件和SAS数据统计分析软件(http://www. sas. com/下载)，分析来源于甘蓝不同变 异类型的虚拟合成甘蓝型油菜与自然甘蓝型油菜的遗传差异，推导甘蓝型油菜中C亚基因 组可能的来源。本实施例中所用甘蓝材料是从IPK (the Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research in Germany)> UPM (the Universidad Politecnica de Madrid in Spain)禾口 CGN (the Centre for Genetic Resources in the Netherlands)征集而来，白 菜型油菜来源于西南大学种质资源库，甘蓝型油菜中的冬性材料和春性材料来自德国NPZ 公司(Norddeutsche Pflanzenzucht Hans-Georg Lembke KG)，半冬性材料来源于西南大学 种质资源库。分子标记和遗传差异分析是本领域中所常采用的方法；总DNA提取、基于PCR 的分子标记都有成熟的技术体系，其所涉及的试剂均可通过商业途径获得；使用的分析软 件均是网站公开供免费使用的。实施例2 亲本物种及自然甘蓝型油菜全基因组水平分子特征扫描 1)材料准备
收集待测亲本的多种变异类型，具有不同遗传背景的另一亲本材料数份，以及具有不 同遗传背景的自然异源多倍体数份。本实施例中的待测亲本物种为甘蓝，共39份，涉及 十七种不同的变异类型；另一亲本物种为白菜型油菜，共4份，其中欧洲白菜和中国白菜各2份；自然甘蓝型油菜6份，其中冬性、春性和半冬性材料各2份。2)提取材料全基因组DNA，具体步骤如下
将2-3g幼叶用液氮磨成粉末，迅速转入15 mL离心管中；向管中加入4 mL 65 °C预热 的 CTAB 抽提液(2% CTAB, 1. 4M NaCl, 0. 02M EDTA，0. IM Tris-HCl)及 80 μ L 的 β-巯基乙 醇，盖严后迅速摇勻，于65 °C水浴60 min，每隔15min轻摇一次；室温下冷却后，向管中加 入4 mL氯仿/异戊醇(ν :v = 24 :1)，轻柔颠倒混勻，乳化20 min ；之后12000 rpm离心10 min;转移上清至另一干净的离心管中，加入3 mL异丙醇，颠倒混勻，约1至2分钟后出现白 色絮状沉淀，然后置于冰上静置20 min； 10000 rpm离心Imin之后，倒掉管中液体，留下管 底的DNA ；向其中加入1 mL 75%乙醇，并全部转入1. 5 mL离心管中；在75 %乙醇中漂洗沉 淀DNA 5 min，然后于5000 rpm离心lmin，倒弃乙醇，再重复本步骤一次；无水乙醇漂洗一 次，5 min，弃乙醇，沉淀于37 °C恒温箱中干燥2 h ；之后用500 μ L TE溶解DNA，并向其中 加入10 yL RNAase，轻柔混勻后于37 °C水浴锅中水浴1 h;之后向管中加入500 μ L酚、 氯仿、异戊醇的混合液(V :V氯仿V异戊e = 25 24 :1)，轻轻颠倒混勻使乳化20 min ；12000 rpm离心20 min，吸取上清至一新的1. 5mL离心管中，向上清中加入300 μ L已在-20 ！下 预冷20 min的异丙醇，冰浴沉淀30 min ； 12000 rpm,4 °C条件下离心10 min后，倒弃液体； 沉淀用500 μ L的75%乙醇漂洗二次，每次5分钟；无水乙醇漂洗5分钟，弃乙醇，沉淀于 37 °C恒温箱中干燥1 h;之后向管中加入200 μ L灭菌重蒸水，溶解DNA;完全溶解后检测 浓度，并将浓度调至100 ng/ μ L03) AFLP 标记
将DNA调整到100 ng/ μ L后，首先用Mse I (Trul I)和PST I对总DNA进行酶切，按 Vos等(1995)的报道设计接头和引物，由上海生工合成。接头退火后与酶切后的DNA进行 连接，10倍稀释连接产物后，利用预扩增引物进行预扩增，10倍稀释预扩产物(Pre-AMt 为选择性扩增的底物。选择性扩增的反应体系如下
成分体积(PL)ddH2010. 210 X Taq Buffer2. 0MgCl2 (25 mM)1. 5P-primer (50 ng/μ L)0. 6M-primer (50 ng/μ L)0. 1dNTPs (10 mM)0. 4Taqase (5 U/μ L)0. 2DNA (Pre-A)5. 0总体积20. 0
PCR程序为
94 "C 30 s, [94 "C 30 s，65 °C(_0. 7 "C /cycle)30 s，72 "C 1 min] X13 cycles, [94 "C 30 s, 56 "C 30 s，72 "C 1 min] X 23 cycles, 72 "C 10 min
反应结束后加入10 μ L反应终止液(98%去离子甲酰胺，IOmM EDTA(pH8. 0)，0. 025% 二 甲苯氰，0.025%溴酚兰)于94 °C变性3min后迅速于0°C冰水混合物中冷击，之后即用于电 泳检测。电泳结束后进行数据统计，同一位点上，有带记为“ 1 ”，无带记为“0”。
4) SSR 标记 PCR反应体系如下
权利要求
一种虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法，其步骤如下1)亲本物种及自然异源多倍体全基因组水平分子扫描采用PCR技术对自然异源多倍体及其亲本物种进行全基因组水平的分子标记分析；2)虚拟合成异源多倍体根据合成异源多倍体过程中，亲本具有的分子特征能在合成后代中得到体现的原则，利用亲本物种的分子标记数据，模拟合成种的分子标记数据；3)亲缘关系分析利用NTSYS软件计算各亲本与自然异源多倍体，以及各虚拟合成异源多倍体与自然异源多倍体间的遗传距离，并对分子标记数据进行UPGMA聚类分析和主成分分析(PCA)；用STRUCTURE软件分析二倍体亲本的不同变异类型与自然异源多倍体之间的血缘关系；用ARLEQUIN软件，按亲本物种进行分子标记方差分析(AMOVA)，检验各亲本物种对虚拟合成异源多倍体遗传差异的贡献率；用SAS软件对来源于同一亲本物种内不同个体的虚拟合成异源多倍体之间的遗传距离进行方差分析(ANOVA)，并对亲本与自然异源多倍体、虚拟合成异源多倍体与自然异源多倍体间的遗传距离进行方差分析及多重比较；通过以上分析揭示不同亲本种类型模拟合成的虚拟异源多倍体与自然异源多倍体相互间遗传差异的大小，根据遗传差异越小，该亲本类型与异源多倍体越为接近，则该类型越可能是异源多倍体中亚基因组的来源的原则，推导异源多倍体中亚基因组的来源。
2.根据权利要求1所述的虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法，其特征在 于所述其中步骤2)中，根据双亲或亲本之一中标记为“1”的则在虚拟合成异源多倍体中 记为“1”，在双亲中都为“0”的则在虚拟合成异源多倍体中记为“0”的原则，据此利用双亲 的分子标记数据模拟出合成种的分子标记数据。
3.根据权利要求1或2所述的虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法，其特 征在于步骤1)用于分子标记的PCR技术采用全基因组水平分子标记AFLP，SSR, RAPD, ISSR中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法，其特 征在于步骤3)采用的数据分析软件是SAS、SPSS软件；所采用的遗传关系分析软件选择 NT-SYS、STRUCTURE 软件。
全文摘要
本发明涉及一种虚拟合成物种调查异源多倍体物种起源的方法，其包括1)采用PCR技术对自然异源多倍体及其亲本物种进行全基因组水平的分子标记分析；2)根据合成异源多倍体过程中，亲本具有的分子特征能在合成后代中得到体现的原则，利用亲本物种的分子标记数据，模拟合成种的分子标记数据；3)利用遗传关系分析软件和数据统计分析软件，分析由不同亲本种类型模拟合成的虚拟异源多倍体与自然异源多倍体的亲缘关系，根据遗传差异大小，推导异源多倍体中亚基因组的来源。本发明避免了人工合成的繁琐过程，可同时对待测亲本物种的所有变异类型进行分析，亦能扣除另一(其它)亲本种基因组对分析结果的影响，方法简单，时间周期短，耗资少，节省人力物力。
文档编号G06F19/00GK101974629SQ20101051982
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者傅鹰, 李加纳, 李勤菲, 梅家琴, 钱伟, 钱论文 申请人:西南大学