一种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法
【专利摘要】本发明公开了一种菘蓝?甘蓝远缘杂交四倍体育种方法，包括以下步骤：对种子低温萌芽；将幼芽在微重力条件光照培养，长成幼苗，将两种幼苗移栽到大田，直至开花；以菘蓝为母本，甘蓝为父本，进行远缘杂交，得到菘蓝?甘蓝杂交体植株，收获种子；将种子萌发生芽，使用秋水仙碱和α射线辐照协同诱导染色体加倍；筛选出四倍体幼芽，继续生长，将得到的四倍体植株移至大田中栽培，自花授粉，得到菘蓝?甘蓝远缘杂交四倍体种子，连续播种5代～8代，得到性状稳定的菘蓝?甘蓝远缘杂交四倍体种子，即得。本发明通过以菘蓝为母本甘蓝为父本进行远缘杂交方法育种，形成各种性状优良的后代杂种，使物种性状更加丰富多样。
【专利说明】
一种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法
技术领域
[0001] 本发明涉及菘蓝的育种领域，具体涉及一种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法。
【背景技术】
[0002] 菘蓝是一种十字花科菘蓝属二年生草本植物，物种起源于中国，具有很强的耐寒 耐旱适应能力，广泛生长分布于我国各地。菘蓝根部晒干处理后可以作为中药板蓝根，其叶 子经处理后则为中药大青叶。这两味药材具有清热解毒、凉血止痛的功用。菘蓝种子可以作 为榨油，作为工业油的原料来源，而且菘蓝叶子部位还可以提取靛青染料，供人们使用。可 见菘蓝具有优秀的使用价值和经济价值。
[0003] 甘蓝是一种十字花科芸薹属二年生草本植物，物种起源于地中海沿线，具有较好 的耐寒性能，适应力强，早在4000年前人们就已经开始种植。在我国广泛种植于北方及华南 等地，是一种重要蔬菜作物。甘蓝还具有一定的养胃健肾的药理功用，能够保护并修复胃黏 膜，是钾元素的良好来源。此外，甘蓝还表现出一定的观赏价值。
[0004] 远缘杂交指的是不同种属的物种之间进行的杂交，可以把不同种属间物种性状进 行结合重建，产生新的变异性状，从而构造出新的物种。一般而言，远缘杂交育种易出现后 代早夭及不育的问题，而远缘杂交的两个物种之间的亲缘关系越近，杂交成功率越高，杂交 后代生存繁育能力越强。并且通过染色体加倍技术，产生的多倍体使不能正常减数分裂的 异源染色体能恢复正常繁育。
[0005] 中国专利CN200810301666.5公开了一种远源百合杂交植株的培育方法，将子房和 花药进行离体培养，然后采用以将子房切断的非常规授粉方式进行离体授粉，此后进行胚 培养即可得杂交植株。但是该专利的杂交种存在父本母本杂交过程中染色体不匹配，无法 成对的现象，致使杂交得到的种子高度不育，不能持续稳定获得同一性状的种子，社会价值 和经济价值低。
[0006] 中国专利CN201410175221.2公开了一种通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的 方法及培养基，该发明以栽培草莓品种久香、甜查理、丰香为母本或父本，野生黄毛草莓为 父本或母本进行杂交，正交与反交同时进行，通过对杂交授粉后的未成熟胚进行离体培养， 在胚败育前将其取出进行挽救培养，获得远缘杂交后代。但是该专利所需亲本数量极大，需 要耗费大量人力物力，且仅进行胚挽救手段难以克服远缘杂交成功率低的问题，同时存在 杂交后代高度不育的问题。
[0007]通过分析可以看出，芸薹属植物与菘蓝属菘蓝之间可能形成性状较好的远缘杂交 品种，而关于芸薹属甘蓝与菘蓝属菘蓝杂交育种则报道很少，因此本发明旨在通过远缘杂 交、四倍体育种技术提供菘蓝与甘蓝的杂交育种方法。
【发明内容】
[0008] 本发明针对上述问题，提供一种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法。
[0009] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是：
[0010] -种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤一，低温萌芽:选择种粒饱满的菘蓝种子和甘蓝种子，在福尔马林溶液中浸泡 30min~50min，揉搓去除种子表皮，然后将处理后的种子用湿布包裹，在3°C~8°C的温度条 件下进行催芽处理48h~72h，直至长出3mm~8mm的務蓝幼芽和甘蓝幼芽；
[0012] 步骤二，光照培养:将菘蓝幼芽和甘蓝幼芽分别移种到液体培养基中，使培养基在 微重力条件下勾速旋转，使用氣灯模拟光照培养2天~3天，直至长成株长为10cm~15cm的 菘蓝幼苗和甘蓝幼苗，分别将两种幼苗移栽到大田中，给予正常的光照、水分及肥料条件， 进行必要的田间作业维护，直至两种植物开花；
[0013] 步骤三，远缘杂交：以步骤二中得到的菘蓝为母本，甘蓝为父本，使用细毛刷小心 收集甘蓝雄花花粉，加水制成花粉悬浮液，使用小软毛刷将花粉悬浮液涂抹在菘蓝雌花花 柱柱头上，之后再在菘蓝雌花花柱柱头上涂抹丙酮-乙醇溶液，促进异花授粉过程，授粉完 成后进行套袋处理，扎紧袋口，防止外源花粉干扰，然后继续培育，得到菘蓝-甘蓝杂交体植 株，收获种子，备用；
[0014] 步骤四，四倍体育种:将步骤三得到的种子进行萌发培养，生出幼芽，使用浓度为 2%~20%的秋水仙碱每4h均匀涂抹在幼芽上，持续100h~160h;之后使用α射线辐照20h~ 40h，将处理过的幼芽使用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出四倍体幼芽，将筛选出的四倍 体幼芽移栽至B5培养基中继续生长，直至长成株长为5cm~8cm的四倍体植株；
[0015] 步骤五，制种:将步骤四得到的四倍体植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体种子，连续播种5代~8代，得到性状稳定的菘蓝-甘 蓝远缘杂交四倍体种子，即得。
[0016] 进一步地，步骤一中，福尔马林溶液的浓度为2%~10%。
[0017] 进一步地，步骤二中，液体培养基的成分及其重量份为：硝酸铵100份~300份，氯 化钾150份~250份，碳酸氢铵80份~150份，磷酸二氢钾150份~280份，碘化钾30份~80份， 碘化钠30份~60份，氯化钙20份~50份，偏硼酸镁50份~100份，硫酸亚铁30份~80份，氯化 亚铁30份~80份，硫酸锰20份~50份，葡萄糖酸锌20份~60份，葡萄糖酸钙20份~50份，酒 石酸钾钠20份~40份，天冬氨酸20份~50份，甘氨酸20份~60份，苯丙氨酸20份~40份，烟 酰胺20份~60份，L-抗坏血酸20份~50份，半乳糖3000份~5000份，葡萄糖3000份~5000 份，琼脂2000份~4000份，水5000份~10000份。
[0018]进一步地，步骤二中，微重力的场强为〇.〇lg~〇.15g。
[0019] 进一步地，步骤二中，勾速旋转的转速为35r/min~70r/min。
[0020] 进一步地，步骤三中，丙酮-乙醇溶液中丙酮与乙醇的体积比为1:20~30。
[0021] 进一步地，步骤四中，α射线源的剂量率为3500伦琴/小时~9000伦琴/小时。
[0022]本发明的优点是：
[0023] 1.通过以菘蓝为母本甘蓝为父本进行远缘杂交方法育种，通过引入外源性基因的 方法使原有基因组型进行重新构建，容易形成各种性状优良的后代杂种，使物种性状更加 丰富多样；
[0024] 2.使用四倍体育种方法使杂交种染色体加倍的技术改良和恢复了后代杂种植株 的生存能力及繁育水平，使突变的优秀性状得以继续遗传，并且通过加倍形成的多倍染色 体，其植株具有枝叶巨大、根茎茁壮等良好特征，使各种有效药用成分含量得到了提高；
[0025] 3.使用甘蓝作为杂交父本，具有原料来源广泛，廉价易得等成本优势，且甘蓝种植 范围大、物种性状多，容易给后代杂交品种带来丰富的变化潜力。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] -种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法 [0028] 包括以下步骤：
[0029]步骤一，低温萌芽:选择种粒饱满的菘蓝种子和甘蓝种子，在浓度为2%的福尔马 林溶液中浸泡30min，揉搓去除种子表皮，然后将处理后的种子用湿布包裹，在:TC的温度条 件下进行催芽处理48h，直至长出3mm的菘蓝幼芽和甘蓝幼芽。
[0030]步骤二，光照培养:将菘蓝幼芽和甘蓝幼芽分别移种到液体培养基中，使培养基在 微重力场强为0. 〇lg，转速为35r/min的条件下勾速旋转，使用氣灯模拟光照培养2天，直至 长成株长为l〇cm的菘蓝幼苗和甘蓝幼苗，分别将两种幼苗移栽到大田中，给予正常的光照、 水分及肥料条件，进行必要的田间作业维护，直至两种植物开花。其中液体培养基的成分及 其重量份为:硝酸铵100份，氯化钾150份，碳酸氢铵80份，磷酸二氢钾150份，碘化钾30份，碘 化钠30份，氯化钙20份，偏硼酸镁50份，硫酸亚铁30份，氯化亚铁30份，硫酸锰20份，葡萄糖 酸锌20份，葡萄糖酸钙20份，酒石酸钾钠20份，天冬氨酸20份，甘氨酸20份，苯丙氨酸20份， 烟酰胺20份，L-抗坏血酸20份，半乳糖3000份，葡萄糖3000份，琼脂2000份，水5000份。
[0031]步骤三，远缘杂交：以步骤二中得到的菘蓝为母本，甘蓝为父本，使用细毛刷小心 收集甘蓝雄花花粉，加水制成花粉悬浮液，使用小软毛刷将花粉悬浮液涂抹在菘蓝雌花花 柱柱头上，之后再在菘蓝雌花花柱柱头上涂抹丙酮-乙醇溶液，促进异花授粉过程，授粉完 成后进行套袋处理，扎紧袋口，防止外源花粉干扰，然后继续培育，得到菘蓝-甘蓝杂交体植 株，收获种子，备用。其中丙酮-乙醇溶液中丙酮与乙醇的体积比为1:20。
[0032] 步骤四，四倍体育种:将步骤三得到的种子进行萌发培养，生出幼芽，使用浓度为 2%的秋水仙碱每4h均匀涂抹在幼芽上，持续100h;之后使用剂量率为3500伦琴/小时的α射 线辐照20h，将处理过的幼芽使用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出四倍体幼芽，将筛选出 的四倍体幼芽移栽至B5培养基中继续生长，直至长成株长为5cm的四倍体植株。
[0033] 步骤五，制种:将步骤四得到的四倍体植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体种子，连续播种5代，得到性状稳定的菘蓝-甘蓝远缘 杂交四倍体种子，即得。
[0034] 实施例2
[0035] -种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法 [0036] 包括以下步骤：
[0037] 步骤一，低温萌芽:选择种粒饱满的菘蓝种子和甘蓝种子，在浓度为10%的福尔马 林溶液中浸泡50min，揉搓去除种子表皮，然后将处理后的种子用湿布包裹，在8°C的温度条 件下进行催芽处理72h，直至长出8_的菘蓝幼芽和甘蓝幼芽。
[0038] 步骤二，光照培养:将菘蓝幼芽和甘蓝幼芽分别移种到液体培养基中，使培养基在 微重力场强为0.15g，转速为70r/min的条件下勾速旋转，使用氣灯模拟光照培养3天，直至 长成株长为15cm的菘蓝幼苗和甘蓝幼苗，分别将两种幼苗移栽到大田中，给予正常的光照、 水分及肥料条件，进行必要的田间作业维护，直至两种植物开花。其中液体培养基的成分及 其重量份为:硝酸铵300份，氯化钾250份，碳酸氢铵150份，磷酸二氢钾280份，碘化钾80份， 碘化钠60份，氯化钙50份，偏硼酸镁100份，硫酸亚铁80份，氯化亚铁80份，硫酸锰50份，葡萄 糖酸锌60份，葡萄糖酸钙50份，酒石酸钾钠40份，天冬氨酸50份，甘氨酸60份，苯丙氨酸40 份，烟酰胺60份，L-抗坏血酸50份，半乳糖5000份，葡萄糖5000份，琼脂4000份，水10000份。 [0039]步骤三，远缘杂交：以步骤二中得到的菘蓝为母本，甘蓝为父本，使用细毛刷小心 收集甘蓝雄花花粉，加水制成花粉悬浮液，使用小软毛刷将花粉悬浮液涂抹在菘蓝雌花花 柱柱头上，之后再在菘蓝雌花花柱柱头上涂抹丙酮-乙醇溶液，促进异花授粉过程，授粉完 成后进行套袋处理，扎紧袋口，防止外源花粉干扰，然后继续培育，得到菘蓝-甘蓝杂交体植 株，收获种子，备用。其中丙酮-乙醇溶液中丙酮与乙醇的体积比为1:30。
[0040]步骤四，四倍体育种:将步骤三得到的种子进行萌发培养，生出幼芽，使用浓度为 20%的秋水仙碱每4h均匀涂抹在幼芽上，持续160h;之后使用剂量率为9000伦琴/小时的α 射线辐照40h，将处理过的幼芽使用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出四倍体幼芽，将筛选 出的四倍体幼芽移栽至B5培养基中继续生长，直至长成株长为8cm的四倍体植株。
[0041]步骤五，制种:将步骤四得到的四倍体植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体种子，连续播种8代，得到性状稳定的菘蓝-甘蓝远缘 杂交四倍体种子，即得。
[0042] 实施例3
[0043] -种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法
[0044] 包括以下步骤：
[0045] 步骤一，低温萌芽:选择种粒饱满的菘蓝种子和甘蓝种子，在浓度为6%的福尔马 林溶液中浸泡40min，揉搓去除种子表皮，然后将处理后的种子用湿布包裹，在6°C的温度条 件下进行催芽处理60h，直至长出6_的菘蓝幼芽和甘蓝幼芽。
[0046] 步骤二，光照培养:将菘蓝幼芽和甘蓝幼芽分别移种到液体培养基中，使培养基在 微重力场强为0.08g，转速为57r/min的条件下勾速旋转，使用氣灯模拟光照培养3天，直至 长成株长为13cm的菘蓝幼苗和甘蓝幼苗，分别将两种幼苗移栽到大田中，给予正常的光照、 水分及肥料条件，进行必要的田间作业维护，直至两种植物开花。其中液体培养基的成分及 其重量份为:硝酸铵200份，氯化钾200份，碳酸氢铵115份，磷酸二氢钾215份，碘化钾55份， 碘化钠45份，氯化钙35份，偏硼酸镁75份，硫酸亚铁55份，氯化亚铁55份，硫酸锰35份，葡萄 糖酸锌40份，葡萄糖酸钙35份，酒石酸钾钠30份，天冬氨酸35份，甘氨酸40份，苯丙氨酸30 份，烟酰胺40份，L-抗坏血酸35份，半乳糖4000份，葡萄糖4000份，琼脂3000份，水7500份。 [0047]步骤三，远缘杂交：以步骤二中得到的菘蓝为母本，甘蓝为父本，使用细毛刷小心 收集甘蓝雄花花粉，加水制成花粉悬浮液，使用小软毛刷将花粉悬浮液涂抹在菘蓝雌花花 柱柱头上，之后再在菘蓝雌花花柱柱头上涂抹丙酮-乙醇溶液，促进异花授粉过程，授粉完 成后进行套袋处理，扎紧袋口，防止外源花粉干扰，然后继续培育，得到菘蓝-甘蓝杂交体植 株，收获种子，备用。其中丙酮-乙醇溶液中丙酮与乙醇的体积比为1:25。
[0048]步骤四，四倍体育种:将步骤三得到的种子进行萌发培养，生出幼芽，使用浓度为 11 %的秋水仙碱每4h均匀涂抹在幼芽上，持续130h;之后使用剂量率为6300伦琴/小时的α 射线辐照30h，将处理过的幼芽使用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出四倍体幼芽，将筛选 出的四倍体幼芽移栽至B5培养基中继续生长，直至长成株长为7cm的四倍体植株。
[0049] 步骤五，制种:将步骤四得到的四倍体植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体种子，连续播种7代，得到性状稳定的菘蓝-甘蓝远缘 杂交四倍体种子，即得。
[0050] 实验例
[0051] 对分别根据实施例1~3的育种方法制备的杂交型菘蓝，标号为Y1、Y2、Y3，作为实 验组;对普通生长的菘蓝，标记为Υ0,作为对照组。通过实验对实验组和对照组的育种效果 进行测试，测试结果见表1所示。
[0052]表1育种效果测试结果 [0053]
[0054] 注：7"表示未杂交。
[0055]结论：由对比结果可知，实施例1~3所得的远缘杂交四倍体菘蓝的育种成功率较 高，并且通过菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法获得的杂种植株，大幅提升了菘蓝的药效 成分，具有很高的药用价值和经济价值。
[0056]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体育种方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一，低温萌芽：选择种粒饱满的菘蓝种子和甘蓝种子，在福尔马林溶液中浸泡 30min~50min，揉搓去除种子表皮，然后将处理后的种子用湿布包裹，在3°C~8°C的温度条 件下进行催芽处理48h~72h，直至长出3mm~8mm的務蓝幼芽和甘蓝幼芽； 步骤二，光照培养:将菘蓝幼芽和甘蓝幼芽分别移种到液体培养基中，使培养基在微重 力条件下勾速旋转，使用氣灯模拟光照培养2天~3天，直至长成株长为IOcm~15cm的務蓝 幼苗和甘蓝幼苗，分别将两种幼苗移栽到大田中，给予正常的光照、水分及肥料条件，进行 必要的田间作业维护，直至两种植物开花； 步骤三，远缘杂交：以步骤二中得到的菘蓝为母本，甘蓝为父本，使用细毛刷小心收集 甘蓝雄花花粉，加水制成花粉悬浮液，使用小软毛刷将花粉悬浮液涂抹在菘蓝雌花花柱柱 头上，之后再在菘蓝雌花花柱柱头上涂抹丙酮-乙醇溶液，促进异花授粉过程，授粉完成后 进行套袋处理，扎紧袋口，防止外源花粉干扰，然后继续培育，得到菘蓝-甘蓝杂交体植株， 收获种子，备用； 步骤四，四倍体育种:将步骤三得到的种子进行萌发培养，生出幼芽，使用浓度为2%~ 20%的秋水仙碱每4h均匀涂抹在幼芽上，持续IOOh~160h;之后使用α射线辐照20h~40h， 将处理过的幼芽使用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出四倍体幼芽，将筛选出的四倍体幼 芽移栽至B5培养基中继续生长，直至长成株长为5cm~8cm的四倍体植株； 步骤五，制种:将步骤四得到的四倍体植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟后收 集得到菘蓝-甘蓝远缘杂交四倍体种子，连续播种5代~8代，得到性状稳定的菘蓝-甘蓝远 缘杂交四倍体种子，即得。2. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤一中，所述福尔马林溶液的浓度 为2%~10%〇3. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤二中，所述液体培养基的成分及 其重量份为:硝酸铵100份~300份，氯化钾150份~250份，碳酸氢铵80份~150份，磷酸二氢 钾150份~280份，碘化钾30份~80份，碘化钠30份~60份，氯化钙20份~50份，偏硼酸镁50 份~100份，硫酸亚铁30份~80份，氯化亚铁30份~80份，硫酸锰20份~50份，葡萄糖酸锌20 份~60份，葡萄糖酸钙20份~50份，酒石酸钾钠20份~40份，天冬氨酸20份~50份，甘氨酸 20份~60份，苯丙氨酸20份~40份，烟酰胺20份~60份，L-抗坏血酸20份~50份，半乳糖 3000份~5000份，葡萄糖3000份~5000份，琼脂2000份~4000份，水5000份~10000份。4. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤二中，所述微重力的场强为0.Olg ~0·15g〇5. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤二中，所述匀速旋转的转速为 35r/min~70r/min〇6. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤三中，所述丙酮-乙醇溶液中丙酮 与乙醇的体积比为1:20~30。7. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤四中，所述α射线源的剂量率为 3500伦琴/小时~9000伦琴/小时。
【文档编号】A01H1/08GK105900828SQ201610236279
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】周常
【申请人】周常