用于简化光学校准的方法

用于简化光学校准的方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于校准生物仪器的方法。该方法包括以下步骤：获取至少一个生物样本阵列的图像；在该图像中确定第一关注区域，其中第一关注区域包括位于至少一个生物阵列上的多个第一位置；以及在第一关注区域中识别位于至少一个生物阵列上的与多个第一位置中的每一个相关的多个图像元素。
【专利说明】用于简化光学校准的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年9月30日提交的第61/541453号美国临时申请、2012年6月 15日提交的第61/660569号美国临时申请、2012年6月15日提交的第61/660343号美国 临时申请的优先权的权益，所有以上申请通过整体引用并入本文。

【背景技术】
[0003] 通常，生物分析和研究仪器（例如qPCR系统）的光学校准是非常复杂的并需要几 个不适于用户或顾客执行的步骤。仪器的初始光学校准通常是在制造环境中进行的，而定 期的重新校准是由现场服务工程师在用户的位置频繁进行的。这增加了相当大的仪器保养 成本。
[0004] 随着设计的进步增加单一仪器（例如qPCR仪器）的多功能性可支持多样本形式， 例如96和384孔微量滴定板、TLDA缩微卡和通孔微阵列。例如，在微阵列中，通孔的数量 可根据用户和实验的需求变化。微阵列的实例可以为耗材，该耗材可具有3072个用于运行 生物实现的通孔。在另一个实例中，微阵列可具有至少10000个用于运行生物实验的通孔。 这允许用户在仪器的使用寿命期间的任何时间扩展先前购置的仪器的功能。在这些情况 下，提供光学校准现有仪器的方法以适应新的样本格式变得有利。此外，向用户提供光学校 准功能允许现有仪器安装的成本有效率的扩张。


【发明内容】

[0005] 在本发明的实施方式中，提供了一种用于校准生物仪器的方法。该方法包括以下 步骤：获取至少一个生物样本阵列的图像；在该图像中确定第一关注区域，其中第一关注 区域包括位于至少一个生物阵列上的多个第一位置；以及在第一关注区域中识别位于至少 一个生物阵列上与多个第一位置中的每一个相关的多个图像元素。
[0006] 在另一实施方式中，多个第一位置可包括多个样本位置。
[0007] 在另一实施方式中，多个图像元素与多个样本孔位置中的每一个相关。
[0008] 在另一实施方式中，多个图像元素与多个样本孔位置之间的多个第二位置相关。
[0009] 在另一实施方式中，在包括至少一个生物样本阵列的图像内确定第二关注区域。
[0010] 在另一实施方式中，可将算法应用于与包括至少一个生物样本阵列的关注区域结 合的多个图像元素上。该算法将生成多个样本孔位置的量化图像。
[0011] 在另一实施方式中，与至少一个生物样本阵列相关的至少一个背景荧光图像可与 多个样本孔位置之间的多个第二位置结合以生成至少一个整体背景荧光图像。
[0012] 在另一实施方式中，可将第二算法应用于多个样本孔位置的量化图像和至少一个 整体背景荧光图像上以生成多个样本孔位置的背景校正量化图像。
[0013] 在另一实施方式中，可将至少一个荧光均匀性图像与样本孔位置的背景校正量化 图像相关。
[0014] 在另一实施方式中，可将第三算法应用于多个样本孔位置的背景校正量化图像和 至少一个荧光均匀性图像上以生成背景校正量化图像的均匀性校正图像。
[0015] 在另一实施方式中，可将多个纯染料荧光图像与背景校正量化图像的均匀性校正 图像相关。
[0016] 在另一实施方式中，可将第四算法应用于背景校正量化图像的均匀性校正图像和 多个纯染料图像上以生成样本孔位置的多个染料强度图像。
[0017] 在另一实施方式中，图像可以是包含多个子图像的光学图像。子图像可以是矩形 的或圆形的形状。
[0018] 在另一实施方式中，图像可以是背景图像、均匀性图像、或纯染料图像，该图像中 的每一个可以是反射光图像或荧光图像。
[0019] 在另一实施方式中，图像元素可包括多个像素。
[0020] 在另一实施方式中，像素可以是矩形的。
[0021] 在另一实施方式中，像素可以是圆形的。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1是示出了可实现本公开的实施方式的校准策略的实施方式的流程图。
[0023] 图2是示出了可实现本公开的实施方式的被称为预扫描的校准策略的部分的实 施方式的流程图。
[0024] 图3是示出了可实现本公开的实施方式的被称为纯染料校准的校准策略的部分 的实施方式的流程图。
[0025] 图4是根据各实施方式示出了可用于实施处理功能的计算机系统的框图。

【具体实施方式】
[0026] 与本文所述的各实施方式有关的方法的示例性系统包括以下申请中描述的系 统：第61/541,453号美国临时专利申请号（案卷号：LT00578PR0)、第61/541,342号美 国临时专利申请（案卷号：LT00581PR0)、第29/403,049号美国临时专利申请（案卷号： LT00582DES)、第 61/541，495 号美国临时专利申请（案卷号：LT00583PR0)、第 61/541，366 号美国临时专利申请（案卷号：LT00584. 1PR0)、以及第61/541，371号美国临时专利申请 (案卷号：LT00594PR0)，以上所有申请都是在2011年9月30日提交的，并且以上所有申请 都通过引用整体地并入本文。
[0027] 为了更全面地理解本发明，下面将描述大量具体细节，如具体结构、参数、示例等。 但是，应当理解这些描述并不用于限制本发明的范围，而是用于对更好地描述示例性实施 方式。
[0028] 本申请涉及对于生物分析和研究仪器中（如qPCR系统）的耗材，简化用户的光学 校准工作流程。
[0029] 根据本文所述的各实施方式，提供了使用需要各种定制工具的多步骤处理的仪器 的光学校准。例如，根据各实施方式，光学校准的步骤可例如包括如图1所示的预扫描校 准、背景校准、孔间（Between-well)荧光测量、均匀性校准和纯染料校准。下面将讨论这些 校准和其他校准。
[0030] 下面描述的校准是灵活，并且例如可以在现场或在制造工厂由服务工程师在安装 仪器时实现或者在仪器安装之后由用户实现。根据本文所述的实施方式，用户可定期地 (例如，每月、每年、每周、每天等）重新校准。每个校准的简化（包括在不需要填充阵列、孔 或任何其他种类的样本体积保持装置的情况下校准仪器的能力）使得用户能够自己校准 系统。应当理解，本文所述的方法的各实施方式可通过连接至存储器的处理系统实现。图 4示出了示例性处理系统，该系统将在后面进行讨论。
[0031] 根据各实施方式，所有校准步骤的输入和输出均可以为子图像的形式，每个子图 像对应于阵列设置的位置。与在一个文件中校正所有阵列而生成的文件大小相比，校正可 应用于单个阵列上以减小总文件大小。
[0032] 校准工作流也可用于改善自端点运行的数据和可在每次运行中收集两次的其他 非实时数据（例如，R0X信号）。校准工作流也可以改善在系统上运行的所有应用的数据质 量。这些应用将在下文中描述。
[0033] 在各实施方式中，本文所述的设备、仪器、系统和方法可用于检测相关的一种或多 种类型的生物成分。这些相关的生物成分可以是任何合适的生物目标，该生物目标包括但 不限于DNA序列（包括无细胞DNA)、RNA序列、基因、寡核苷酸、分子、蛋白质、生物标记物、 细胞（例如，循环肿瘤细胞）或其他任何合适的目标生物分子。
[0034] 在各实施方式中，该生物成分可以在应用中与各种PCR、qPCR和/或dPCR方法和 系统一起使用，这些应用例如是胎儿诊断、多重dPCR、病毒检测和量化标准、基因分型、测序 验证、突变检测、转基因生物检测、稀有等位基因检测和拷贝数变异。本公开的实施方式通 常涉及用于监测或测量大量小体积样本的生物反应的设备、仪器、系统和方法。例如，如本 文中所使用的，样本可称为样本体积或反应体积。
[0035] 根据本文所述的各实施方式，校准、样本位置和噪音去除方法可在图像数据上实 施，该图像数据包括但不限于反射光与荧光图像。在其他实施方式中，校准、样本位置和噪 音去除方法可使用例如正负离子检测、PH值检测、电压检测或电流检测的任意一种组合或 任何组合来实现。此外还应当理解，本文所述的校准、样本定位和噪音去除方法可应用于各 种样本基底形式，该样本基底形式例如包括芯片、阵列和板。此外，例如，根据本文所述的各 实施方式，样本体积可包括（但不限于此）在孔、通孔、凹陷、点、腔、样本保持区以及反应室 中。
[0036] 虽然通常地定量聚合酶链反应（qPCR)适用于处理大量样本，但是应当理解根据 本文所述的各实施方式可以使用任何合适的PCR方法。例如，合适的PCR方法包括但不限 于：数字PCR、等位基因特异性PCR、不对称PCR、连接介导PCR、多重PCR、巢式PCR、qPCR、基 因组步移以及桥式PCR。
[0037] 校准/校正顺序/有效性
[0038] 校准/校正处理的步骤可以被分成步骤组，这些步骤组可以根据运行实验时它们 之间的关系而彼此区分开。
[0039] 参照图1，第一组步骤122可包括在运行实验之前执行的那些步骤。第二组步骤 121可包括在运行实验时执行的那些步骤。第二组步骤121还可分成多个子组。例如，这些 子组可包括校准步骤子组123和数据处理步骤子组124。
[0040] 此外，在图1所示的实施方式中，校准步骤可以是互相关联的或依赖于其他步骤 并且在图1中以箭头示出。这些依赖性可导致正在执行的步骤作为执行另一步骤的先决条 件。例如，先决步骤可以是因为处理中另一步骤的校准数据文件的优先阶段或校准的优先 顺序。
[0041] 例如，在一个实施方式中，背景校准111的结果可以被使用，以便以周期间隔来执 行均匀性校准112。相同的背景校准111也可与孔间荧光116相结合以在数据处理124期 间支持背景和孔间校正117。
[0042] 在另一实施方式中，例如可在芯片查找校准115之前执行预扫描校准110。然后芯 片查找校准115和预扫描校准110的结果可被使用，以执行点查找或关注区域（R0I)校准 114。例如，当在被校准的仪器上使用的形式是通孔或阵列板时，这可是有用的。
[0043] 此外，完成后的关注区域校准114可有助于确定量化荧光图像120。
[0044] 在另一实施方式中，执行均匀性校准112时可能需要首先执行背景校准111，随后 执行纯染料校准113以及均匀性校正118和多成分化119,以维持系统校准。
[0045] 下面将描述各校准模块。
[0046] 预扫描
[0047] 预扫描校准是可以在运行实验时执行的功能。它可用于通过一组定义的过滤器配 置来使反射图像或荧光图像的目标成像。这些图像可用于确定例如适当的曝光时间和工作 周期以在不饱和的情况下提供强信号。曝光时间是指目标可暴露于激励源多长时间。工作 周期是指在设置的曝光时间中激励源打开多长时间与激励源关闭多长时间的比较关系。适 当的曝光时间和工作周期对形成良好的信噪比是很重要的。如果图像是饱和的，则数据变 得不可用，因此预扫描能得到良好的信噪比而不使检测器饱和。在预扫描校准的某些实施 方式中，可具有曝光时间和工作周期的上限。例如，可在制造仪器的过程中确定这些上限， 并且这些上限依赖于发射图像中的噪声。发射图像中的噪声将在下面更详细地讨论。
[0048] 在一个实施方式中，可在标准数据收集开始之前在实验运行期间执行预扫描。如 图2所示，预扫描处理可在用于点查找114的反射光过滤器组合20上执行。点查找114是 指用于确定在阵列、基底或类似样本保持器上的样本位置的算法。例如，可使用点查找算法 在微阵列的图像中确定通孔的位置。例如，预扫描允许用户根据反射光图像解释仪器到仪 器和阵列到阵列的信号变异性。在图2所示的实施方式中，系统可通过获取第一图像21来 被启动，然后使用该图像评估荧光水平22。在本领域中已知的是，用荧光单元（FU)测量荧 光水平。例如，如果荧光水平处于曝光时间和工作周期的可接受范围内，该图像被报告为良 好28。例如，曝光时间的可接受范围可以在2秒到16秒之间，而工作周期的可接受范围可 以在0%到100%之间。例如，如果信号水平是饱和的26,系统将采用具有减少的曝光时间 或工作周期23的另一图像。相反地，例如如果信号水平过低27,系统将采用具有更高的曝 光时间或工作周期24的另一图像。对于饱和的26或过低的27信号水平，可再次评估22 所采用的下一图像的充分性。
[0049] 在一个实施方式中，曝光时间和工作周期的确定可分为两个过程。首先，可调整曝 光时间，同时保持工作周期不变。可利用调整后的曝光时间来评估图像的可接受荧光水平 直到达到曝光范围的上限或下限或直到获得充足的荧光水平。当达到曝光极限时如果图像 被确定为不可接受，可调整工作周期并且可再次调整曝光时间。对于图2所示的实施方式， 可重复该处理，直到为所有定义的过滤器组合29提供了理想的曝光时间和工作周期。例 如，该处理可在安装时、在制造过程中以及在由顾客执行的任何后续的验证阵列运行过程 中被执行。每次执行该处理时，系统可使用曝光时间和工作周期的一组默认参数来启动搜 索。可在但不限于在制造或系统开发过程中确定默认参数。
[0050] 在另一实施方式中，曝光时间和工作周期的确定可在一次处理中完成。在一个不 例中，曝光时间和工作周期都可在获得新图像之前在相同的方向进行调整。每次在评估图 像的荧光水平之后重复该处理时可向更高水平或更低水平进行调整。在另一示例中，曝光 时间和工作周期可在获得新图像之前在相反方向进行调整。
[0051] 在另一实施方式中，可使用预测算法来确定曝光时间和工作周期。该算法可使用 增加的或减少的曝光时间和工作周期的增量，以预测获得充足的荧光所需的曝光时间和工 作周期。
[0052] 在一些情况中，即使通过最低的可允许曝光时间和工作周期，信号水平也可以足 够强以致饱和。在另一些情况下，信号水平可以是弱的。即使通过最高的可允许曝光时间 和工作周期，这些弱荧光水平也不足以获得充足的荧光水平。在这些情况下，进行校准的该 系统可指示发生错误。如果没有发生错误，用户可能收到关于预扫描校准状态的报警或仪 器在预扫描校准完成时不提供任何反馈。
[0053] 背景校准
[0054] 背景校准可为从系统收集的数据确定每个孔的背景荧光成分。该校准可为每个通 道生成背景图像。通道可以是一个发射过滤器和一个激励过滤器的组合。每个通道可为需 要的图像类型配置适当的过滤器。
[0055] 例如，背景校准的校准器可以是具有与阵列载体相同的X和y维度的黑色塑料目 标。目标可被注入物质以吸收光。例如，目标可被注入石墨。这对于非荧光目标也是有利 的。例如，该校准可在仪器安装期间、在定期预防性维护期间、以推荐的时间间隔或在顾客 /用户选择任何时间被执行。例如，用户可在从光学器件去除灰尘之后执行背景校准。
[0056] 每次执行背景校准时，对于由仪器的当前应用使用的荧光过滤器组合中的每个收 集复制图像/多个图像，该收集持续至少两个曝光时间。采用的复制图像的数量可以变化， 以使多个图像的数量可足以由系统平均化图像。图像平均化可用于增加信噪比。
[0057] 已发现两个曝光时间足以定义目标的背景特征。例如，在两个曝光时间得到的图 像可用于用直线表示荧光与曝光时间的关系。两个曝光时间也可用于计算荧光相对曝光时 间的斜率和偏移量。斜率和偏移量的计算可通过应用直线等式的一般形式实现，该直线等 式为 y = mx+b，其中m是直线的斜率，b是偏移量。在每次运行期间，可根据上面计算的斜 率和偏移量来为每个过滤器通道的每个阵列生成一组背景密度值。例如，背景值的计算可 在每次运行时完成一次或多次（如果需要）。例如，系统可通过从第一周期获取点位置以及 使用这些点位置量化背景图像来生成背景值。而且，每个阵列或每个运行图像中的每个量 化后的孔可减去各自的背景密度值，因此在运行中校正每个孔的图像密度。
[0058] 孔间荧光校正
[0059] 参照图1，孔间荧光校正116可提供在阵列的孔之间检测到的荧光的表示。如图1 中的示例所示，孔间荧光116可与背景值111结合以在数据处理124期间提供量化数据120 的背景和孔间校正117。孔间荧光116可用于补偿阵列保持器的可变光学特征。已发现阵 列保持器的盖无法从盖到盖显示相同水平的荧光。从样本阵列图像减去孔间荧光116图像 可允许用户比较使用不同阵列保持器和盖的所有阵列的数据。
[0060] 在一个实施方式中，孔间荧光116测量可使用单独的校准器以获得孔间图像。单 独的校准器可以是阵列和保持器，该阵列和保持器与可用于运行样本的阵列和保持器相同 或相似。此外，单独的校准器可用于在样本运行之前而不是运行期间获得孔间图像。
[0061] 在另一实施方式中，孔间荧光116图像可在样本运行期间得到。在样本运行期间 成像可避免需要单独校准。每次运行可使用运行中的阵列以捕获图像。使用运行中的阵列 是可能的，因为孔间荧光116图像可从样本图像中提取。例如，在运行的量化步骤期间在每 个荧光图像中可以进行校准。提取的孔间图像可用于为阵列形成整体背景。校正的图像可 通过从各自通孔量化值减去阵列的整体背景和背景校准111形成。
[0062] 均匀性
[0063] 参照图1，可通过为每个过滤器通道成像高信号荧光目标来执行均匀性校准112。 例如，使用的目标是塑料膜，该塑料膜可以制成发射特定波长的荧光。相关波长可对应于系 统中的发射过滤器。已发现薄的目标能够保证与阵列信号模式的最佳光学匹配。例如，薄 的目标可以小于〇. 5_。在运行过程中，该图像可用于校正仪器的系统化光学不均匀性。系 统化不均匀性可由包括一个或多个激励源的光学组件的累积公差组成。
[0064] 例如，可在安装系统期间、在定期预防维护期间、系统制造期间或由用户在实验室 里执行均匀性校准112。
[0065] 可为安装在系统中的过滤器组合中的每一个收集复制图像。可通过减去背景校准 111来平均、调整每个通道的图像，并且生成图像可表示系统的均匀性校准。然后该均匀性 校准可应用于量化120以及在多成分化119之前的背景和孔间校正117图像。
[0066] 在每次运行期间，可为每个过滤器通道的每个阵列生成一组均匀性标准化因子。 例如，可通过在上面预扫描讨论中所讨论的从第一点查找调用获取点位置并使用它们量化 均匀性图像，来创建该因子。图像的量化可通过使用平均算法实现。平均算法可为特定的 光学系统以及可得到的图像的格式和质量而开发。可通过实质上由背景减除图像除以均匀 性图像将量化值转换为均匀性校正因子。可为各个孔或图像确定均匀性校正因子。每个阵 列中的每个量化的孔也可被标准化为其各自均匀性校正因子。
[0067] 纯染料
[0068] 图3示出纯染料校准和多成分校正的方法。纯染料校准步骤将为可由系统检测的 每种荧光染料生成纯染料图像（35)。例如，可检测的染料由用户的试验和探头选择确定。 例如，可检测的染料也与系统中安装的发射过滤器的波长匹配。
[0069] 在一个实施方式中，系统可用于检测三种染料。在一个示例中，三种染料可以是 FAM、VIV和R0X。已知的是，VIC和R0X燃料具有与其他染料（如FAM)重叠的最小光谱。在 该实施方式中，由于与其他染料（FAM)重叠的最小光谱，VIC和R0X的纯染料校准可通过使 用固定的染料矩阵应用于所有仪器上。
[0070] 在另一实施方式中，可为特定仪器校准系统所使用的所有染料。例如，示出强光谱 重叠的一组染料可受益于系统的仪器特定纯染料校准以在运行期间区分荧光染料信号。
[0071] 图3示出了纯染料校准的实施方式。如下所述，可在运行期间使用标准化纯染料 图像35以计算纯染料矩阵37。在该实施方式中，阵列载体容纳四个阵列容器并可由200nM 的FAM染料填充并被密封。在该实施方式中，没有阵列插入容器中。
[0072] 继续参考图3,可为荧光过滤器组合31的每一个收集复制图像30。每个过滤器组 合的图像被平均，生成的平均图像可以被分别背景-减除33 (使用一个或多个背景校准文 件32)和均匀性-标准化34 (使用一个或多个均匀性校准文件40)。均匀性校准文件40也 在图1通过参考数字112示出，并出现上面预扫描的讨论中。实质上可由背景减除图像除 以均匀性图像来产生均匀性-标准化染料图像35。
[0073] 图3还示出了多成分化的过程。在多成分化期间，点位置36可用于量化每个各自 的纯染料校准图像35。（参考上面讨论的用于确定点位置的预扫描。图像的量化出现在上 面的均匀性讨论中。）量化值可转换为FAM染料37的标准化光谱矩阵（例如，每个孔的四 个过滤值中的每一个可标准化为该孔的最亮的过滤器）。例如，使用来自每个周期中的所有 通道的标准化光谱矩阵37和均匀性校正量化值39,与图示的校准工作流相关的算法允许 为每个周期确定染料强度值38。
[0074] 例如，可在系统安装期间、在定期预防维护期间或由用户在实验室环境中执行该 校准，以保证板均匀性是有效的。
[0075] 样本位置查找和背景去除
[0076] 在某些实施方式中，上文所述的校准方法可能足以通过生物仪器执行期望的分 析。在另一些实施方式中，可使用其他方法获得可以表示关注区域的位置的数据并去除检 测到的发射数据中的畸变和其他不需要的背景噪音。背景噪音可指固有的系统噪音和其他 不期望的信号。例如，数据中的某些背景噪音可能由于基底上的物理源，如灰尘粒子或划 痕。可提供背景噪音的物理源的另一个示例是保存或密封基底的保持器或容器。数据中的 其他背景噪音可能由于仪器中的表面的自然辐射。例如反射和自然荧光。例如，其他背景 噪音也可能是光学系统检测发射数据或光源的结果。
[0077] 生物系统可检测几百个到几千个样本，所有这些样本可能具有非常小的体积。例 如，微阵列中的样本尺寸可以是30纳升或更小。因此，根据各实施方式，其他背景噪音去除 方法可单独使用或与本文所述的校准方法结合使用以确定和分析来自样本体积的发射数 据。在一些实施方式中，样本体积的位置可在基底中更精确地确定以执行更精确的分析。例 如，在数字PCR分析中，具有更精确地区分样本体积中的反应和非反应的能力可产生更精 确的结果。而且，根据本文所述的各实施方式，空孔或通孔可从不进行反应的孔或通孔中的 样本体积区分出来，空孔或通孔也可从进行反应的孔或通孔中的样本体积区分出来。
[0078] 根据本文所述的各实施方式，背景噪音去除可包括图像数据分析和处理。该方法 可包括分析图像数据的强度值以内插可从基底的图像去除的背景噪音。用这种方式，也可 以确定图像内关注区域的位置。背景噪音去除也可包括内插已知图像区域的数据以包括关 注区域。在确定了图像中的背景噪音之后，可从图像中减去背景噪音。
[0079] 本领域技术人员将认识到，各实施方式的操作可使用硬件、软件、固件或其组合 (视情况而定）来实施。例如，一些处理可使用处理器或软件、固件或硬连线逻辑控制下的 其他数字电路来执行。（术语"逻辑"在本文中是指如由本领域技术人员所认识到的能够执 行上述功能的固定的硬件，可编程逻辑和/或其适当的组合）。软件和固件可存储在计算机 可读介质上。一些其他处理可使用模拟电路来实现，这对本领域普通技术人员来说是众所 周知的。此外，存储器或其他存储装置，以及通信部件也可使用在本发明的实施方式中。
[0080] 图4是示出了根据各实施方式的可用于执行处理功能的计算机系统100的框图。 计算系统100可包括一个或多个处理器（如处理器104)。例如，处理器104可使用通用或 专用处理引擎（如微处理器、控制器或其他控制逻辑）实施。在该示例中，处理器104与总 线102或其他通信介质连接。
[0081] 此外，应当理解，图4的计算系统000可以任何形式实施，如对于给定应用或环境 可能是期望的或恰当的机架式计算机、大型机、超级计算机、服务器、客户机、台式计算机、 笔记本电脑、平板计算机、手持式计算设备（例如，PDA、蜂窝电话、智能电话、掌上电脑等）， 集群网格（cluster grid)，上网本，嵌入式系统，或任何其他类型的专用或通用计算设备）。 此外，计算系统1〇〇可包括传统网络系统或与LIS/LIMS设施的集成，其中传统网络系统包 括客户机/服务器环境和一个或多个数据库服务器。大量传统网络系统在本领域是已知 的，包括局域网（LAN)、广域网（WAN)和云计算结构，并且包括无线和/或有线部件。此外， 客户机/服务器环境、数据库服务器和网络在本领域被充分记载。
[0082] 计算系统100可包括总线102或用于传送信息的其他通信机构，并且处理器104 与总线102联接以处理信息。
[0083] 计算系统100还包括与总线102联接用于存储将由处理器104执行的指令的存储 器106,该存储器可以是随机访问存储器（RAM)或其他动态存储器。存储器106还可用于在 执行将由处理器104执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。计算系统100还包括 与总线102联接用于存储处理器104的静态信息和指令的只读存储器（ROM) 108或其他静 态存储设备。
[0084] 计算系统100还可包括存储设备110,如磁盘、光盘、或固态驱动器（SSD)，其被提 供并联接至总线102用于存储信息和指令。存储设备110可包括介质驱动器和可移动存储 接口。介质驱动器可包括支持固定的或可移动的存储介质的驱动器或其他机构，如硬盘驱 动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器（R或RW)、闪盘驱动器或其他 可移动的或固定的介质驱动器。如这些示例所示，存储介质可包括计算机可读存储介质，该 存储介质中存储有具体的计算机软件、指令或数据。
[0085] 在可替代性实施方式中，存储设备110可包括其他类似的媒介用于允许计算机程 序或其他指令或数据加载到计算机系统100中。这种媒介可包括例如允许将软件和数据从 存储设备110传送至计算机系统100的可移动存储单元和接口，如程序盒式存储器和盒式 存储器接口，可移动存储器（例如，闪速存储器或其他可移动存储模块）和存储器插槽，以 及其他可移动存储单元和接口。
[0086] 计算系统100还可包括通信接口 118。通信接口 118可用于允许软件和数据在 计算机系统1〇〇和外部设备之间传送。通信接口 118的示例可包括调制解调器、网络接口 (如以太网或其他NIC卡）、通信端口（例如，USB端口、RS-232C串行端口）、PCMCIA插槽 和PCMCIA卡、蓝牙等。通过通信接口 118传送的软件和数据可以是能够由通信接口 118接 收的电子的、电磁的、光学的和其他信号的形式。这些信号可由通信接口 118通过诸如无线 介质、导线或电缆、光纤、或其他通信介质的通道发送和接收。通道的一些示例包括电话线、 蜂窝电话链路、RF链路、网络接口、局域网或广域网、以及其他通信通道。
[0087] 计算系统100可通过总线102联接至显示器112 (如阴极射线管（CRT)或液晶显 示器（IXD))，其中显示器112用于为计算机用户显示信息。例如，包括字母数字键和其他键 的输入设备114与总线102联接，以为处理器104传递信息和命令选择。输入设备还可以 是配置有触摸屏输入能力的显示器（如IXD显示器）。另一种用户输入设备是光标控制装 置116，如用于为处理器104传递方向信息和命令选择以及用于控制光标在显示器112上移 动的鼠标、轨迹球或光标方向键。该输入设备通常具有在两个轴线上的两个自由度（第一 轴线（例如，X)和第二轴线（例如，y))从而允许设备指定面中的位置。计算系统100提 供数据处理并提供该数据的置信水平。与本教导的实施方式的某些实施符合的，数据处理 和置信度由计算系统100提供以响应处理器104执行包含在存储器106中的一个或多个指 令的一个或多个序列。该指令可从另一个计算机可读介质（如存储设备110)读入存储器 106。执行包含在存储器106中的指令序列导致处理器104进行本文中描述的过程。可替 代地，硬连线电路可用于代替软件指令或与软件指令组合，以实施本教导的实施方式。因此 本教导的实施方式的实施不限于硬件电路和软件的任何具体组合。
[0088] 本文中使用的术语"计算机可读介质"和"计算机程序产品"通常是指涉及向处理 器106提供用于执行的一个或多个序列或一个或多个指令的任何介质。当执行时，通常被 称为"计算机程序代码"的该指令（其可以以计算机程序的形式或其他分组的形式分组）使 计算机系统能够执行本发明的实施方式的特征和功能。计算机可读介质的这些和其他形式 可包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质包括例如固态盘、光 盘或磁盘，如存储设备110。易失性介质包括动态存储器，如存储器106。传输介质包括同 轴线缆、铜线、及光纤，包括包含总线102的电线。
[0089] 计算机可读介质的常见形式包括例如软盘（floppy disk)、软盘（flexible disk)、硬盘、磁带、或任何其他磁性介质、CD-ROM、任何其他光学介质，穿孔卡、纸带、任何其 他具有孔图案的物理介质、RAM、PR0M、和EPROM、FLASH-EPR0M、或任何其他存储器芯片或盒 式存储器、如下所述的载波、或者计算机可读取的任何其他介质。
[0090] 各种形式的计算机可读介质可涉及向处理器104运送用于执行的一个或多个指 令的一个或多个序列。例如，该指令最初可携带在远程计算机的磁盘上。远程计算机可将 该指令加载到其动态存储器中并使用调制解调器通过电话线路发送该指令。计算系统100 的本地调制解调器可接收电话线路上的数据并使用红外发射器将信号转换为红外信号。与 总线102联接的红外探测器可接收红外信号中携带的数据并将该数据放置在总线102上。 总线102将该数据运送至存储器106,处理器104从存储器106获取指令并执行指令。由存 储器106接收的指令可选地在由处理器104执行之前或执行之后存储在存储设备110上。
[0091] 应当理解的是，为了清楚起见，以上描述参考不同的功能单元和处理器对本发明 的实施方式进行描述。然而，显而易见的是，可使用不同的功能单元、处理器或域之间的任 何合适的功能分布而不偏离本发明。例如，上述的将由单独的处理器或控制器执行的功能 可由同一处理器或控制器执行。因此，参考具体的功能单元仅应视为参考合适的装置，以提 供所描述的功能性，而不是指示严格的逻辑或物理结构或组织。
[0092] 本发明的其他方面也可描述如下：
[0093] 在可选的实施方式1中，提供了用于校准生物仪器的方法，该方法包括：获取至少 一个生物样本阵列的图像；在图像中确定第一关注区域，其中第一关注区域包括位于该至 少一个生物阵列上的多个第一位置；以及在第一关注区域中识别位于至少一个生物阵列上 的与多个第一位置中的每一个相关的多个图像元素。
[0094] 在可选的实施方式2中，提供了实施方式1所述的用于校准生物仪器的方法，其中 多个第一位置包括多个样本孔位置。
[0095] 在可选的实施方式3中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物仪 器的方法，其中多个图像元素与多个样本孔位置中的每一个相关。
[0096] 在可选的实施方式4中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物仪 器的方法，其中多个图像元素与多个样本孔位置之间的多个第二位置相关。
[0097] 在可选的实施方式5中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物仪 器的方法，该方法还包括在图像中确定第二关注区域，其中第二关注区域包括至少一个生 物样本阵列。
[0098] 在可选的实施方式6中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物仪 器的方法，该方法还包括在图像中确定第二关注区域，其中第二关注区域包括至少一个生 物样本阵列。
[0099] 在可选的实施方式7中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物仪 器的方法，该方法还包括在图像中确定第二关注区域，其中第二关注区域包括至少一个生 物样本阵列。
[0100] 在可选的实施方式8中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物仪 器的方法，该方法还包括在图像中确定第二关注区域，其中第二关注区域包括至少一个生 物样本阵列。
[0101] 在可选的实施方式9中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物仪 器的方法，该方法还包括将第一算法应用于与多个样本孔位置中的每一个和至少一个生物 样本阵列相关的多个图像元素上以生成该多个样本孔位置的量化图像。
[0102] 在可选的实施方式10中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，该方法还包括将与至少一个生物样本阵列相关的至少一个背景荧光图像与多 个样本孔位置之间的多个第二位置结合以生成至少一个整体背景荧光图像。
[0103] 在可选的实施方式11中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，该方法还包括将第二算法应用于多个样本孔位置的量化图像和至少一个整体 背景荧光图像上以生成多个样本孔位置的背景校正量化图像。
[0104] 在可选的实施方式12中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，该方法还包括将至少一个荧光均匀性图像与样本孔位置的背景校正量化图像 相关。
[0105] 在可选的实施方式13中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，该方法还包括将第三算法应用于多个样本孔位置的背景校正量化图像和至少 一个荧光均匀性图像上以生成背景校正量化图像的均匀性校正图像。
[0106] 在可选的实施方式14中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，该方法还包括将多个纯染料荧光图像与背景校正量化图像的均匀性校正图像 相关。
[0107] 在可选的实施方式15中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，该方法还包括将第四算法应用于背景校正量化图像的均匀性校正图像和盖多 个纯染料图像上以生成样本孔位置的多个染料强度图像。
[0108] 在可选的实施方式16中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像包括光学图像。
[0109] 在可选的实施方式17中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中光学图像还包括多个子图像。
[0110] 在可选的实施方式18中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中多个子图像中的每一个是矩形的。
[0111] 在可选的实施方式19中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中多个子图像中的每一个是圆形的。
[0112] 在可选的实施方式20中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像还包括多个子图像。
[0113] 在可选的实施方式21中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中多个子图像中的每一个是矩形的。
[0114] 在可选的实施方式22中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中多个子图像中的每一个是圆形的。
[0115] 在可选的实施方式23中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像包括反射光图像。
[0116] 在可选的实施方式24中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中反射光图像还包括多个反射光子图像。
[0117] 在可选的实施方式25中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像包括荧光图像。
[0118] 在可选的实施方式26中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中荧光图像还包括多个荧光子图像。
[0119] 在可选的实施方式27中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像包括背景图像。
[0120] 在可选的实施方式28中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中背景图像还包括反射光图像。
[0121] 在可选的实施方式29中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中背景图像还包括荧光图像。
[0122] 在可选的实施方式30中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中背景图像还包括至少一个反射图像和至少一个荧光图像的组合。
[0123] 在可选的实施方式31中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中反射光图像还包括多个反射光子图像。
[0124] 在可选的实施方式32中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中荧光图像还包括多个荧光子图像。
[0125] 在可选的实施方式33中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中背景图像还包括至少一个反射光子图像和至少一个荧光子图像的组合。
[0126] 在可选的实施方式34中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像包括均匀性图像。
[0127] 在可选的实施方式35中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中均匀性图像还包括至少一个均匀性子图像。
[0128] 在可选的实施方式36中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中均匀性图像还包括荧光图像。
[0129] 在可选的实施方式37中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中荧光图像还包括至少一个荧光子图像。
[0130] 在可选的实施方式38中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像还包括纯染料图像。
[0131] 在可选的实施方式39中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中纯染料图像还包括荧光图像。
[0132] 在可选的实施方式40中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中荧光图像还包括至少一个荧光子图像。
[0133] 在可选的实施方式41中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中图像元素包括多个像素。
[0134] 在可选的实施方式42中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中多个像素包括圆形像素。
[0135] 在可选的实施方式43中，提供了上述实施方式中的任一个所述的用于校准生物 仪器的方法，其中多个像素包括矩形像素。
【权利要求】
1. 一种用于校准生物仪器的方法，包括： 获取至少一个生物样本阵列的图像； 在所述图像中确定第一关注区域，其中所述第一关注区域包括位于所述至少一个生物 阵列上的多个第一位置；以及 在所述第一关注区域中识别位于所述至少一个生物阵列上的与所述多个第一位置中 的每一个相关的多个图像元素。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述多个第一位置包括多个样本孔位置。
3. 如权利要求2所述的方法，其中所述多个图像元素与所述多个样本孔位置中的每一 个相关。
4. 如权利要求2所述的方法，其中所述多个图像元素与所述多个样本孔位置之间的多 个第二位置相关。
5. 如权利要求1所述的方法，还包括：在所述图像中确定第二关注区域，其中所述第二 关注区域包括所述至少一个生物样本阵列。
6. 如权利要求4所述的方法，还包括：在所述图像中确定第二关注区域，其中所述第二 关注区域包括所述至少一个生物样本阵列。
7. 如权利要求3所述的方法，还包括：在所述图像中确定第二关注区域，其中所述第二 关注区域包括所述至少一个生物样本阵列。
8. 如权利要求2所述的方法，还包括：在所述图像中确定第二关注区域，其中所述第二 关注区域包括所述至少一个生物样本阵列。
9. 如权利要求7所述的方法，还包括：将第一算法应用于与所述多个样本孔位置中的 每一个和所述至少一个生物样本阵列相关的所述多个图像元素上，以生成所述多个样本孔 位置的量化图像。
10. 如权利要求4所述的方法，还包括：将与所述至少一个生物样本阵列相关的至少一 个背景荧光图像与所述多个样本孔位置之间的多个第二位置结合，以生成至少一个整体背 景荧光图像。
11. 如权利要求9和10所述的方法，还包括：将第二算法应用于所述多个样本孔位置 的量化图像和所述至少一个整体背景荧光图像上以生成所述多个样本孔位置的背景校正 量化图像。
12. 如权利要求11所述的方法，还包括：将至少一个荧光均匀性图像与所述样本孔位 置的背景校正量化图像相关。
13. 如权利要求12所述的方法，还包括：将第三算法应用于所述多个样本孔位置的背 景校正量化图像和所述至少一个荧光均匀性图像上，以生成所述背景校正量化图像的均匀 性校正图像。
14. 如权利要求13所述的方法，还包括：将多个纯染料荧光图像与所述背景校正量化 图像的均匀性校正图像相关。
15. 如权利要求14所述的方法，还包括：将第四算法应用于所述背景校正量化图像的 均匀性校正图像和所述多个纯染料图像上，以生成所述样本孔位置的多个染料强度图像。
16. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像包括光学图像。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所述光学图像还包括多个子图像。
18. 如权利要求17所述的方法，其中所述多个子图像中的每一个是矩形的。
19. 如权利要求17所述的方法，其中所述多个子图像中的每一个是圆形的。
20. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像包括多个子图像。
21. 如权利要求20所述的方法，其中所述多个子图像中的每一个是矩形的。
22. 如权利要求20所述的方法，其中所述多个子图像中的每一个是圆形的。
23. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像包括反射光图像。
24. 如权利要求23所述的方法，其中所述反射光图像还包括多个反射光子图像。
25. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像包括荧光图像。
26. 如权利要求25所述的方法，其中所述荧光图像还包括多个荧光子图像。
27. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像包括背景图像。
28. 如权利要求27所述的方法，其中所述背景图像还包括反射光图像。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述背景图像还包括荧光图像。
30. 如权利要求27所述的方法，其中所述背景图像还包括至少一个反射光图像和至少 一个荧光图像的组合。
31. 如权利要求28所述的方法，其中所述反射光图像还包括多个反射光子图像。
32. 如权利要求29所述的方法，其中所述荧光图像还包括多个荧光子图像。
33. 如权利要求27所述的方法，其中所述背景图像还包括至少一个反射光子图像和至 少一个荧光子图像的组合。
34. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像包括均匀性图像。
35. 如权利要求34所述的方法，其中所述均匀性图像还包括至少一个均匀性子图像。
36. 如权利要求34所述的方法，其中所述均匀性图像还包括荧光图像。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述荧光图像还包括至少一个荧光子图像。
38. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像还包括纯染料图像。
39. 如权利要求38所述的方法，其中所述纯染料图像还包括荧光图像。
40. 如权利要求39所述的方法，其中所述荧光图像还包括至少一个荧光子图像。
41. 如权利要求1所述的方法，其中所述图像元素包括多个像素。
42. 如权利要求41所述的方法，其中所述多个像素包括圆形像素。
43. 如权利要求41所述的方法，其中该多个像素包括矩形像素。
【文档编号】G06T5/00GK104145293SQ201280058573
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2012年9月30日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】雅各布·K·弗洛伊登豪尔, 杰弗里·A·马克斯, 弗朗西斯·T·程, 托马斯·维塞尔 申请人:生命技术公司