本申请要求于2014年3月25日提交的美国临时申请号61/969,897的优先权和权益，其公开内容在此通过参照整体并入。
技术领域：
本技术主要涉及检测基因失调，例如由基因易位和/或融合导致的，可能与多种疾病相关的基因失调。在具体方面，本技术涉及使用定量实时PCR检测基因失调。技术背景提供以下描述以帮助阅读者理解。提供的信息或引用的文献均不被承认是本发明的现有技术。染色体结构的变化涉及染色体的部分改变而不是基因组中染色体数目或染色体组数的改变。有四种常见的突变类型：缺失和重复(二者都涉及染色体上DNA量的改变)、倒位(涉及染色体片段的排列改变)和易位(涉及非同源染色体中各部分的重新排列)。相互易位和罗伯逊易位是最常发生的易位类型。相互易位通常涉及不同染色体之间的双向交换。染色体断裂开，并且断裂点下游的片段交换位置。在平衡情况下，不产生遗传物质的净增加或减少，并且如果基因没有被扰乱，个体的表型通常不受影响。当两条染色体在中心处融合并基本上结合为一体时，发生罗伯逊易位。保留来自两条染色体的大部分遗传物质。与平衡的相互易位相同，携带者可能正常，但产生遗传上不平衡的配子。大部分源自不平衡配子的后代不能存活，并在孕早期发生流产。如果携带者可育并且后代存活，可能发生多种缺陷。一种罗伯逊易位导致染色体14和21融合。获得的后代可能遗传得到染色体21的三个拷贝，导致唐氏综合征。当易位连接另外两个分离基因部分时可能导致基因融合。这在一些癌症例如非小细胞肺癌(NSCLC)中经常出现。间变性淋巴瘤激酶(ALK)是一种在血液学紊乱中频繁涉及基因融合的受体酪氨酸激酶，且在NSCLC中具有至少4个经报道的融合伴侣：EML4、KLC1、KIF5B和TFG(3-5)。基因融合产物(发现于3～7％NSCL中)导致本构ALK激酶激活并充当具有转化能力的致癌驱动物。靶向EML4-ALK融合产物的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的开发已获得成功，且克里唑替尼已于2011年被FDA批准以治疗具有ALK易位的NSCLC患者，连同作为伴随诊断的ALK荧光原位杂交(FISH)测试(6)。如同ALK，ROS1也是一种受体酪氨酸激酶。约1.7％的NSCLC具有ROS1易位且ROS1具有至少7个融合伴侣：FIG、GOPC、TPM3、SDC4、SLC34A2、CD74和EXR(7-9)。相似于ALK，ROS1融合产物导致本构激酶活性并对TKI敏感。虽然当前没有临床试验中的特异性ROS1抑制剂，但数据提示具有ROS1易位的NSCLC患者可能受益于使用克里唑替尼的靶向治疗(10)。RET(转染期间重排)是另一种受体酪氨酸激酶，并已知其通过染色体重排而与乳头状甲状腺癌相关联(RET/PTC)。约1.9％的NSCLC载带RET易位，其具有至少2个融合伴侣：KIF5B和CCDC6(7，9)。此外，NSCLC中RET易位是经批准用于治疗甲状腺癌的TKI如凡德他尼的潜在靶标(11)。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的约80％。在过去十年中，NSCLC中基因改变的表征已经导致新型治疗处理的发展，如吉非替尼和埃罗替尼用于具有EGFR突变的NSCLC患者(2)。通常，EGFR突变、KRAS突变、ALK、ROS1和RET易位在NSCLC患者中是互斥的。在受试者例如NSCLC患者中检测易位例如ALK、ROS1和RET易位的经改善方法将有用于鉴定将会受益于采用TKI如克里唑替尼和凡德他尼的靶向治疗处理的患者。检测该易位的试剂组(panel)和/或试剂盒也将是有用的。发明概述本文描述了用于检测基因失调，如由基因融合和染色体易位导致的那些基因失调的方法、组合物和试剂盒。所述方法、组合物和试剂盒对于检测导致目标基因5’区域相对于所述目标基因3’区域差异表达的突变是有用的。还公开了检测NSCLC患者中ALK、ROS1和RET易位的敏感、准确且有成本效益的分析。本文还描述了用于诊断癌症的方法。在一方面，本公开提供检测测试样品中目标基因的失调存在与否的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)用针对所述目标基因5’区域部分的两个或更多个不同的5’目标引物对扩增所述目标基因的转录物或来源于其的cDNA的5’区域部分，如果其在测试样品中存在的话；(b)用针对所述目标基因3’区域部分的两个或更多个不同的3’目标引物对扩增所述目标基因的转录物或来源于其的cDNA的3’区域部分，如果其在测试样品中存在的话；(c)检测由所述两个或更多个5’目标引物对和所述两个或更多个3’目标引物对所产生的扩增产物；(d)确定所述两个或更多个5’目标引物对中的平均循环阈值(Ct)和所述两个或更多个3’目标引物对中的平均Ct，(e)计算所述5’目标引物对中的平均循环阈值和所述3’目标引物对中的平均循环阈值之间的差异作为IDE分数，和(f)鉴定所述测试样品为(i)当所述IDE分数与临界值差异显著并且所述差异指示存在目标基因失调时，则具有目标基因失调，或者(ii)若所述测试样品中所述IDE分数与所述临界值无显著差异，则不具有目标基因失调。在另一方面，本公开提供诊断受试者中癌症或癌症易感性存在与否的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)从所述受试者获得包含核酸的测试样品；(b)用针对所述目标基因5’区域部分的两个或更多个不同的5’目标引物对扩增所述目标基因的转录物或来源于其的cDNA的5’区域部分，如果其在所述测试样品中存在的话；(c)用针对所述目标基因3’区域部分的两个或更多个不同的3’目标引物对扩增所述目标基因的转录物或来源于其的cDNA的3’区域部分，如果其在所述样品中存在的话；(d)检测由所述两个或更多个5’目标引物对和所述两个或更多个3’目标引物对所产生的扩增产物；(e)确定所述两个或更多个5’目标引物对中的平均循环阈值(Ct)和所述两个或更多个3’目标引物对中的平均Ct；(f)计算作为所述5’目标引物对间所述平均循环阈值和所述3’目标引物对间所述平均循环阈值之间的差异的IDE分数，和(g)诊断所述受试者为(i)当所述IDE分数与临界值差异显著并且所述差异指示存在癌症或癌症易感性时，则具有癌症或癌症易感性，或者(ii)若所述测试样品中所述IDE分数与所述临界值无显著差异，则不具有产生于所述目标基因失调的癌症或癌症易感性。在一些实施方式中，所述受试者是人且所述癌症是非小细胞肺癌。可分析易位以检测NSCLC存在与否的示例性目标基因是ROS1、RET和ALK。在一些实施方式中，这三种基因组成NSCLC组并均使用所述公开的方法进行分析。样品可以是生物样品或者包含核酸例如mRNA或cDNA的另外样品。扩增可使用实时PCR进行且扩增产物的检测可使用可检测的标记探针进行，所述探针例如为包含可检测标记的寡核苷酸探针。在本文所公开方法的一些实施方式中，通过使用针对所述目标基因5’区域不同部分的两个、三个、四个、五个或六个不同的引物对的扩增测定所述目标基因5’区域的表达水平。类似地，可使用针对所述目标基因3’区域不同部分的两个、三个、四个、五个或六个不同的引物对以测定所述目标基因3’区域的表达水平。扩增产物的量各自可被归一化成内源对照基因转录物(“对照”)例如ABL的量。在一些实施方式中，转录物的表达水平或相对量的测定可使用实时PCR并对比各扩增子的循环阈值(Ct)。使用目标基因各自所述3’(平均Ct3’)和5’(平均Ct5’)区域的平均Ct值以计算IDE分数，其可计算为IDE＝(平均Ct5’–平均Ct3’)、或IDE＝(平均Ct5’)/(Ct对照)-(平均Ct3’)/(Ct对照)、或IDE＝[Ln((平均Ct5’)/Ct对照)]-[Ln((平均Ct3’)/Ct对照)]。在一些实施方式中，所述Ct值被归一化成参照样品。使用所述公开的方法可分析生物样品例如全血、分离的血细胞、血浆、血清、和尿液。附图简述图1是阐释基于基因5’区域和3’区域的平均表达水平测定基因内差异表达(IDE)以检测融合转录物存在与否的图表。部分(1)显示所述5’区域和3’区域之间表达水平(IDE)的差异，表明存在融合转录物。部分(2)显示所述5’区域和3’区域同等的表达水平，表明无融合转录物存在。发明详述本文描述了用于在样品中检测基因失调，例如由基因融合或染色体易位导致的那些基因失调的方法、试剂和试剂盒，其中所述失调导致目标基因特定部分的差异表达或量。易位为突变，其作用是将先前单独的DNA片段并列，可能将单独的基因组合形成功能上不同的融合基因(例如ROS1-FIG、ROS1-TPM3和ROS1-SLC34A2)。为便于理解本发明，以下定义了一些术语和短语。如本文所用的，除非另有说明，否则单数形式“一个(a、an)”和“该(the)”包括复数引用。因此，例如，对“一个寡核苷酸”的引用包含多个寡核苷酸分子，对标记的引用是对一个或更多个标记的引用，对探针的引用是对一个或更多个探针的引用，对“一个核酸”的引用是对一个或更多个多聚核苷酸的引用。如本文所用的，除非另有说明，否则当涉及数值时，术语“约”是指所列举值的加或减10％。如本文所用的术语“扩增(amplification或amplify)”包含拷贝目标核酸，从而增加所选核酸序列拷贝数的方法。扩增可以是指数或线性的。目标核酸可以是DNA或RNA。以这种方法扩增的序列形成“扩增产物”。尽管下文说明的示例性方法涉及使用聚合酶链反应(PCR)扩增，但是本领域知晓多种其他核酸扩增方法(例如等温方法、滚环方法等)。熟练的技术人员将理解，这些其他方法可以代替PCR方法或与PCR方法一起使用。参见，Saiki，"AmplificationofGenomicDNA"inPCRProtocols，Innis等人编，AcademicPress，SanDiego，Calif.1990，pp.13-20；Wharam等人，NucleicAcidsRes.，29(11):E54-E54，2001；Hafner等人，Biotechniques，30(4):852-56，858，860，2001:Zhong等人，Biotechniques，30(4):852-6，858，860，2001。如本文所用的，术语“检测”是指观察可检测标记的信号以说明样品中目标核酸的存在。术语检测不需要所述方法提供100％灵敏性和/或100％特异性。众所周知，“灵敏性”是受试者有目标核酸序列时测试呈阳性的概率，而“特异性”是受试者没有目标核酸序列时测试呈阴性的概率。优选至少50％的灵敏性，尽管显然更优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的灵敏性。优选至少50％的特异性，尽管显然更优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的特异性。检测也包含用假阳性和假阴性的分析。假阴性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。假阳性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。如本文所用的术语“互补(complement)”、“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”是指碱基配对原则相关的多聚核苷酸(即核苷酸序列例如寡核苷酸或基因组核酸)。如本文所用的核酸序列的互补是指当与所述核酸序列比对以便一条序列的5’端与另一序列的3’端配对时呈“反向平行相关”的寡核苷酸。例如，序列5’-A-G-T-3’与序列3’-T-C-A-5’是互补的。本发明的核酸中可以包含一些天然核酸中不常见的碱基，包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补不需要是完全的；稳定的双链体可以包含错配碱基对或未配对碱基。核酸
技术领域：
的技术人员可以根据经验考虑多个变量包括例如寡核苷酸长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生率，确定双链体稳定性。互补性可以是“部分”的，其中只有一些核酸碱基根据碱基配对原则配对。或者，核酸之间可以有“完全(complete)”、“总(total)”或“全(full)”互补性。如本文所用的术语“可检测标记”是指与探针相连，用于识别与基因组核酸或参照核酸杂交的探针的分子或化合物，或一组分子或一组化合物。在一些情况下，所述可检测标记可以被直接检测。在其他情况下，所述可检测标记可以是结合对的一部分，其可以随后被检测。所述可检测标记的信号可以用多种手段检测，取决于所述可检测标记的性质。用以检测可检测标记的手段的实例包括但不限于分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学或化学手段，例如荧光、化学荧光或化学发光，或任何其他适当的手段。在基因片段或染色体片段的语境中，“片段”是指至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约250个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约个1000核苷酸、至少约2000个核苷酸、至少约5000个核苷酸、至少约10000个核苷酸、至少约20000个核苷酸、至少约50000个核苷酸、至少约100000个核苷酸、至少约500000个核苷酸、至少约1000000个核苷酸或更多的核苷酸残基序列。如本文所用的术语“基因异常”或“染色体异常”是指核酸序列与野生型或正常基因序列的偏差。基因异常可以反映与生物体全部染色体的正常全遗传互补(geneticcomplement)相比，该生物体的全遗传互补或其任何部分的差异。例如，基因异常可以包含染色体或其部分的改变(例如缺失、重复、扩增)；或染色体结构的改变(例如易位、点突变)。基因异常可以是遗传性的，即从一代传到下一代，或者是非遗传性的。基因异常可以存在于生物体的某些细胞中或该生物体的全部细胞中。如本文所用的术语“内源对照基因”是指通常持续表达，并被认为参与日常细胞代谢的基因。内源对照基因是众所周知的，包括基因例如ABL、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH或GAPDH)、白蛋白、肌动蛋白、微管蛋白、亲环蛋白、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HRPT)、L32.28S和18SrRNA。在诊断分析中检测内源对照基因可以作为该分析的阳性对照。术语“同一性(identity)”和“同一度(identical)”是指序列之间同一的程度。可以有部分同一性或完全同一性。部分同一的序列是与另一序列的同一性小于100％的序列。部分同一的序列可以具有至少70％或至少75％、至少80％或至少85％、或至少90％或至少95％的总体同一性。如本文所用的，术语“分离的”、“纯化的”或“基本纯化的”是指从其天然环境中移除、分离或分开的，并且至少60％，优选75％，最优选90％不含与其天然相关的其他成分的分子，例如核酸。分离的分子因而是基本纯化的分子。如本文所用的术语“多重PCR”是指在相同反应容器中同时提供两种或多种产物的扩增和检测的分析。每种产物使用不同的引物对引导。多重反应还可以包含用于每种产物的特异性探针，该探针用不同的可检测部分而被可检测地标记。如本文所用的，术语“寡核苷酸”是指由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合构成的短聚合物。寡核苷酸长度通常在约10、11、12、13、14、15、20、25或30至约150个核苷酸(nt)之间，更优选在约10、11、12、13、14、15、20、25或30至约70个nt之间，最优选长度在约18至约26个nt之间。对目标核酸特异性的寡核苷酸(例如探针或引物)将在严格条件下与目标核酸“杂交”。如本文所用的，“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridizing)”是指寡核苷酸单链通过碱基配对在限定的杂交条件下与互补链退火的过程。它是两个互补多聚核苷酸之间特异性，即非随机的相互作用。杂交和杂交强度(即核酸之间结合的强度)受例如核酸之间的互补程度、涉及条件的严格性以及形成的杂交物的Tm等因素影响。“特异性杂交”表示两条核酸序列享有高度互补性。特异性杂交复合物在允许的退火条件下形成并在随后的任何洗涤步骤后保持杂交。核酸序列退火的允许条件由本领域普通技术人员常规地确定，并且在严格条件下发生。杂交的严格性可以部分参照实施洗涤步骤的温度表示。该温度通常被选择为比特定序列在限定离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃至20℃。Tm是(在限定离子强度和pH下)50％的目标序列与完全配对的探针杂交的温度。本领域知晓计算Tm的方程和核酸杂交的条件。如本文所参照的“严格杂交条件”指定为37℃下的50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS。杂交程序是本领域众所周知的，并且描述在例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&SonsInc.，1994中。如本文所用的，用于扩增的“引物”是与目标核苷酸序列互补，并且在DNA或RNA聚合酶存在下导致核苷酸添加到引物3′末端的寡核苷酸。引物的3′核苷酸通常应当与目标核酸序列在相应核苷酸位置相同，以便优化表达和扩增。如本文所用的术语“引物”包含各种形式的引物，可以是合成引物，包括肽核酸引物、锁定核酸引物、硫代磷酸修饰的引物、标记的引物等。可使用可用的计算机程序和/或通过应用本领域已知的引物设计通用规则来设计特定序列或序列区特异性的上下游PCR引物。在一些实施方式中，引物对的引物各自为18-30个碱基对长度，具有相似解链温度(彼此5℃以内)且解链温度介于65°和75℃之间。在一些实施方式中，引物具有40和60％之间的GC含量，且各引物的3’以C或G结尾以促进结合。当设计引物时，通常避免二级结构域，且优选具有GC富集域和AT富集域平衡分布的序列。通常还避免一个碱基运行4次或更多次，或双核苷酸重复(例如ACCCC或ATATATAT)。如本文所用的，“正向引物”是与dsDNA反义链互补的引物。“反向引物”与dsDNA有义链互补。“外源引物”具体是指添加至扩增反应容器的且不从反应容器中的扩增产生的寡核苷酸，所述扩增反应容器含有要从容器外扩增的样品核酸。与荧光团或其他标记“相连的”引物通过一些手段与标记物理相连。一个实例是引物-探针。如本文所用的，“引物-探针”是一种引物类型。引物长度通常从至少10、15、18、或30个核苷酸直至约100、110、125、或200个核苷酸长度，优选长度从至少15个直至约60个核苷酸，最优选长度从至少25个直至约40个核苷酸。在一些实施方式中，引物和/或探针长度为15至35个核苷酸。不存在用于最佳杂交或聚合酶链式反应扩增的标准长度。具体引物应用的最佳长度可以容易地以H.Erlich,PCRTechnology,PrinciplesandApplicationforDNAAmplification,(1989)中所述的方式来确定。“引物对”是一对引物，其二者均指向目标核酸序列。针对特定基因或序列的引物对包含正向引物和反向引物，其在严格条件下各自与核酸序列的不同链(有义或反义)杂交。正向引物与dsDNA的反义链互补而反向引物与dsDNA的有义链互补。引物对的一个引物可以是引物-探针(即双功能性分子，其含有通过聚合酶阻断基团共价连接至探针元件的PCR引物元件，并且此外还含有与淬灭剂相互作用的荧光团)。在严格条件下特异性杂交目标基因的引物对可能侧接所述基因(与所述引物序列相对互补)的全部或一部分杂交。因此，可能扩增所述整个基因或者可能扩增所述基因的一个片段，取决于引物杂交的位置在基因内或周围。如果来自一个引物对的至少一个引物序列与其它引物对的任一引物序列均不相同，则两个或更多个引物对是不同的。因此，即使两个引物对共享一个相同的引物，它们也可能是不同的。在一些实施方式中。在一些实施方式中，不同引物对不共享任何共同的引物序列。如本文所用的，术语“引物-探针检测系统”是指用于实时PCR的方法。该方法利用双功能性分子(此处称为引物-探针)，其含有通过聚合酶阻断基团共价连接至探针元件的PCR引物元件。此外，每个引物-探针分子含有荧光团，其与淬灭剂相互作用以降低背景荧光。如本文所用的引物-探针可以包含具有5’延长探针尾(其包含发夹结构)的3’引物，其具有荧光团/淬灭剂对。在PCR过程中，通过包含六甘醇(hexethlyeneglycol)(HEG)，阻断了聚合酶延伸至探针尾中。在第一轮扩增过程中，3’目标特异性引物与目标核酸退火并延伸，从而使引物-探针整合至新合成的链中，其具有新合成的针对5’探针的目标区域。在下一轮变性和退火过程中，引物-探针发夹环的探针区将会与目标杂交，从而将荧光团和淬灭剂分离并产生可测量的信号。此类引物-探针描述于Whitcombe等,NatureBiotech17:804-807(1999)中。SCORPION引物是示例性的引物-探针。如本文所用的“PCR检测系统”是指一种用于实时PCR的方法。在该方法中，与扩增的核酸区段杂交的探针包含于扩增主混合液中。探针在探针的一端包含供体和淬灭剂荧光团，并且互相足够接近，从而使供体的荧光被淬灭剂占据。然而，当该探针与扩增的区段杂交时，Taq聚合酶的5’-核酸外切酶活性切割探针，由此允许供体荧光团发出可检测的荧光。如本文所用的，当寡核苷酸和核酸比对时，如果寡核苷酸与核酸的一部分具有至少50％序列同一性，则该寡核苷酸对该核酸是“特异性”的。对核酸特异性的寡核苷酸是在适当的杂交或洗涤条件下能与感兴趣的目标杂交并基本不与不感兴趣的核酸杂交的寡核苷酸。优选较高水平的序列同一性，包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，更优选至少98％序列同一性。序列同一性可以使用具有默认设置的可商业购得的计算机程序测定，所述程序采用本领域众所周知的算法(例如BLAST)。如本文所用的，具有“高序列同一性”的序列在至少约50％的比对核苷酸位置，优选在至少约60％的比对核苷酸位置，更优选在至少约75％的比对核苷酸位置具有相同的核苷酸。术语“目标核酸”、“目标基因”和“目标序列”在本文中可互换地使用，并指意图被鉴定的核酸序列。目标核酸可以包含目标基因或转录物或任何其他感兴趣序列的5’或3’区域。目标核酸可以表示特定基因的可选序列或等位基因。目标核酸可以是双链或单链的，或部分双链的，或部分单链的，或发夹结构的分子。目标核酸可以是约1-5个碱基、约10个碱基、约20个碱基、约50个碱基、约100个碱基、约500个碱基、约1000个碱基、约2000个碱基、约2500个碱基、约3000个碱基、约3000个碱基、约4000个碱基、约5000个碱基、约7500个碱基、约10000个碱基、约20000个碱基、约30000个碱基、约40000个碱基、约50000个碱基、约75000个碱基、约100000个碱基、约1000000个碱基或更多。当提及目标核酸时，术语“转录物”是指代表细胞基因组核酸的任何核酸，其包括例如任何形式的RNA(例如mRNA、前mRNA和snRNA)和合成的代表物例如cDNA。如本文所用的术语“测试样品”是指包含核酸或被怀疑包含核酸的样品。在一些实施方式中，测试样品中的核酸根据本文公开的方法使用。在一些实施方式中，测试样品是从受试者获得的生物样品。在一些实施方式中，测试样品是来自生物样品的提取核酸。在一些实施方式中，测试样品是逆转录自来自生物样品的mRNA的cDNA。如本文所用的术语“生物样品”是指包含目标核酸或用作本发明方法的目标核酸来源的样品。生物样品可以包括临床样品(即直接从患者获得)或分离的核酸，并且可以是细胞或非细胞液体和/或组织(例如活组织检查)样品。在一些实施方式中，样品从收集自受试者的组织或体液获得。样品来源包括但不限于唾液(处理的或未处理的)、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管冲洗液(BW)、全血或任何类型的分离血细胞(例如淋巴细胞)、体液、脑脊液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如活组织检查材料)。如本文所用的术语“患者样品”是指从寻求疾病诊断和/或治疗的人获得的样品。在受试者是胎儿的情况下，患者样品可以来自受试者(即胎儿)、羊水或母体(例如母亲血液)。如本文所用的，术语“受试者”是指哺乳动物例如人，但也可以是另一种动物例如家养动物(例如狗、猫等)、家畜牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。术语“患者”是指患有、或被怀疑患有染色体异常相关疾病的“受试者”。染色体“易位”是非同源染色体之间部分的交换。它通常通过受影响细胞的细胞遗传学或核型分析进行检测。有两种主要类型：相互易位，其中全部染色体物质被保留；以及罗伯逊易位，其中部分染色体物质丢失。此外，易位可以是平衡的(其中物质平等交换，没有遗传信息的增加或丢失)或不平衡的(其中染色体物质的交换不平等，导致基因增加或丢失)。染色体9和22之间的相互易位导致细胞遗传学上不同的近端着丝染色体，称为费城染色体。该易位融合染色体22的BCR基因座位与染色体9的原癌基因ABL座位以形成bcr/abl致癌蛋白(Tefferi等人，MayoClinPrvc，80(3)：390-402，2005)。尽管费城染色体最初与CML相关，但现在已知它是其他血液疾病例如急性淋巴性白血病(ALL)的预后指示物。如本文所用的“基因易位断裂点”是指基因序列中的以下位置：其中野生型序列被破坏且所述位置(断裂点)上游或下游的基因部分被删除或易位至所述基因组中的异位(即，除基因剩余部以外断裂并在不同位置掺入所述基因组)。技术概览本文公开的是检测样品中是否存在目标基因失调的方法。还公开了诊断或监测癌症例如非小细胞肺癌(NSCLC)的方法。另外的示例性癌症包括甲状腺癌(包括但不限于乳头状甲状腺癌)、骨和软组织肉瘤、以及任何不同的白血病和淋巴瘤(例如，急性髓性白血病(AML))。在一些实施方式中，在从需要针对是否存在基因易位进行测定的受试者获得的样品上进行本发明所公开的方法。本文所述的方法主要提供检测、测量和比较测试样品中目标基因不同区域的基因表达水平。因此，该技术涉及检测和/或监测包含目标基因信使RNA的样品以测定所述目标基因5’区域和所述目标基因3’区域的表达水平。如本文所用的，短语“检测……量”或“检测……水平”是指观察来自可检测标记的信号，所述可检测标记指示来自任何基因或基因部分例如基因5’区域、目标基因3’区域或参照基因的转录物的量。所述量例如可以表示为浓度、拷贝数或循环阈值(Ct)值。如本文所用的，分析物的“循环阈值”是当进行实时核酸扩增时检测信号(例如荧光信号)与指定检测阈值(例如荧光阈值)交叉的PCR循环。所述Ct取决于扩增反应效率，其包括起始模板拷贝数、生物体溶解、PCR扩增、杂交或荧光探针裂开以及检测灵敏性。检测基因表达水平或量不需要提供100％灵敏性和/或100％特异性的方法。众所周知，“灵敏性”是受试者有目标核酸序列时测试呈阳性的概率，而“特异性”是受试者没有目标核酸序列时测试呈阴性的概率。优选至少50％的灵敏性，尽管显然更优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的灵敏性。优选至少50％的特异性，尽管显然更优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的灵敏性。检测也包含用假阳性和假阴性的分析。假阴性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。假阳性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。所公开的方法利用当基因5’部分或基因3’部分缺失或易位至基因组内另一位置时表现出的基因内差异表达(IDE)。经历此重排的基因将表现出5’基因区域相对于3’基因区域的差异表达。目标基因的5’区域是基因易位断裂点上游的目标基因部分而目标基因的3’区域是基因易位断裂点下游的目标基因部分。在一些实施方式中，术语“5’区域”是指相对于3’区域，位置接近多聚核苷酸5’末端的多聚核苷酸部分，并且可以包括或可以不包括相同多聚核苷酸最5’端的核苷酸(一个或更多个)。在易位的背景下，5’区域是指处于易位断裂点的5’方向或上游的区域。在本方法的背景下，5’区域可以位于目标基因转录部分的5’末端附近。在一些实施方式中，5’区域包括目标基因5’非翻译区域(UTR)的全部或部分。在其他实施方式中，5’区域位于起始密码子的下游(如果目标基因是蛋白编码基因)；例如，在终止密码子下游至少10个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。要扩增的5’区域的大小可以根据所选检测方法而改变。在一些实施方式中，可以选择引物以扩增5’区域内至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。在一些实施方式中，术语“3’区域”是指相对于5’区域，位置接近多聚核苷酸3’末端的多聚核苷酸部分，并且可以包括或可以不包括相同多聚核苷酸最3’端的核苷酸(一个或更多个)。在易位的背景下，3’区域是指处于易位断裂点的3’方向或下游的区域。在本方法的背景下，3’区域可以位于目标基因转录部分的3’末端附近。在一些实施方式中，3’区域包括目标基因3’UTR的全部或部分。在其他实施方式中，3’区域位于终止密码子的上游(如果目标基因是蛋白编码基因)；例如，在终止密码子上游至少10个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。要扩增的3’区域的大小可以根据所选检测方法而改变。在一些实施方式中，可以选择引物以扩增3’区域内至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。当评价已知基因异常时，术语“5’-区域”和“3’-区域”在一定程度上是相对而言的，因为每个区域被选择以处于造成基因异常的缺陷(例如断裂点)的不同侧。这些区域可以为方便起见或其他实质性原因(即同时评价其他异常例如突变(SNP)、缺失、插入等)而选择，并且不需要分别处于转录物的5’-和3’-端。当评价未知转录物的目标核酸(即特异性断裂点先前还没有被鉴定)时，优选特定目标基因5’区域与3’区域的之间距离应当最大化到可能允许检测两个区域间可能发生的多种染色体异常的最大程度。该策略使得与基因异常有关的任何断裂点在这两个区域间发生的可能性最大化。在一个实施方式中，通过本发明方法评价的5’-和3’-区域中一个或两个位于转录物非翻译区(UTR)中。本领域熟知选择PCR扩增引物的指导原则。参见例如McPherson等人，PCRBasics:FromBackgroundtoBench，Springer-Verlag，2000。有多种用于设计引物的计算机程序，例如Oligo(NationalBiosciences，Inc，PlymouthMinn.)、MacVector(Kodak/IBI)和GCG序列分析程序套装(GeneticsComputerGroup，Madison，Wis.53711)。一种示例性IDE发生在基因5’区域保持在该基因正常调控元件(例如包含于5’非翻译区域(UTR)中的那些元件)控制下，而该基因的3’区域易位并变成并列以致在不同调控元件的控制下或完全不受控制的情况中。对于这些类型的突变，该基因的5’区域根据该目标基因自身的调控元件而表达，而3’基因区域将不表达(在3’区域缺失或易位到不活跃表达的位置的情况下)或将以与不同基因的调控元件一致的水平表达。本文公开的IDE方法使用跨越目标基因5’区域不同部分的两个或更多个引物、引物对和/或探针以及跨越目标基因3’区域不同部分的两个或更多个附加引物、引物对和/或探针。鉴定多个引物、引物对和/或探针的组合以扩增5’基因区域和3’基因区域的各自部分并可将IDE表达为ΔCt，其计算是基于5’和3’区域中多个引物间的平均Ct值。在一些实施方式中，3’和5’基因区域各自使用三个、四个、五个、六个或更多个引物、引物对和/或探针。在一个实施方式中，可以根据以下公式计算IDE分数：IDE分数＝ΔCt＝(平均Ct5’–平均Ct3’)其中ΔCt是针对5’基因区域引物的平均Ct值(平均Ct5’)和针对3’基因区域引物的平均Ct值(平均Ct3’)之间的差异。参见图1。在此实施方式中，当样本是易位阳性时平均Ct5’高于(反映较低的拷贝数)平均Ct3’。Ct值与表达水平成反比，以致当3’表达水平高于5’表达水平时，平均Ct3’水平将小于平均Ct5’。Ct值可通过实时PCR获得并测定为各自引物荧光信号与指定荧光阈值交叉处的PCR循环。本发明的发明人出人意料地发现由3’目标基因区域多个引物或引物对的平均Ct和5’目标基因区域多个引物或引物对的平均Ct计算ΔCt导致了优越的分析表现。事实上，当使用两个或更多个引物或引物对扩增3’目标基因区域和5’目标基因区域各自多个部分并由各自区域的多个引物或引物对的平均Ct计算ΔCt时，观察到分析灵敏性、特异性、阴性预测值(NPV)和阳性预测值(PPV)以致于IDE分析可有效用作易位的筛选工具，使得IDE阴性样品是真正的基因易位阴性且IDE阳性样品是推定的基因易位阳性。若需要，可通过随后的FISH或其它分子检测进一步证实使用本文公开的方法对样品进行的IDE阳性指定。此外，还出人意料地发现使用多个引物和/或探针克服了与其它方法相关的问题，在所述其它方法中，某些样品未适当扩增，导致高假阳性率和假阴性率。通过使用针对目标基因各自5’区域和3’区域的多个引物和/或探针，本文公开的所述IDE设计相比于各自区域(即3’区域和5’区域)仅使用单一引物对的方法，呈现出大大降低的假阳性率和假阴性率以及优越的分析灵敏性和特异性。在一些实施方式中，鉴定各自5’区域和3’区域的最佳引物、引物对和/或探针，并基于如使用那些引物和/或探针所测定的3’基因表达水平和5’基因表达计算IDE分数。在一些实施方式中，各自区域(即3’区域和5’区域)使用多个引物或引物对，并由采用各自区域的多个引物或引物对检测的信号所确定的各自区域的平均表达水平计算所述IDE分数。在一些实施方式中，IDE分数(ΔCt)计算为5’目标引物对间平均循环阈值和3’目标引物对间平均循环阈值之间的差异，若所述IDE分数与预设临界值差异显著并且所述差异表明目标基因失调严重度，则鉴定所述测试样品具有目标基因失调。“临界值”表示IDE(或ΔCt)值大于或等于鉴定样品为融合阳性的值。所述“临界”值确定自已知融合阳性和融合阴性样品的IDE分数范围。在一些实施方式中，阳性临界值计算为5’和3’之间ΔCt>2、>4、>5、>8或>10。因此，所公开的方法提供对导致基因5’区域相对于基因3’区域差异表达的突变的检测。这种情况的一个实例发生在许多NSCLC患者中，这些患者具有ALK、ROS1或RET基因的易位，使得基因的5’区域保持在与目标基因正常相关的启动子的控制下，而基因的3’区域被易位，使得它通过与不同基因相关的强很多的启动子表达。不含有目标基因内染色体异常的样本将在5’区域和3’区域之间呈现相同的表达图示，因为它们以单分子的方式连接。然而，当目标基因受某些基因或染色体异常影响时，所述5’区域和3’区域可能显示5’区域和3’区域独立的表达图式。在易位的情况下，所述5’区域和3’区域将显示不同的表达图式，因为这两个区域现在在染色体上不再连接。如本文所用的，短语“水平差异”、“量差异”和“表达图示差异”是指基因5’区域的转录物的量与该目标基因3’区域转录物的量相比的差异。在一个实施方式中，基因5’区域转录物与该目标基因3’区域转录物的量相比以增加的量或减少的量存在于样品中。在野生型或正常细胞中，目标基因5’区域转录物的量和目标基因3’区域转录物的量预期是在相等或接近相等的量。相等的量是指测得的5’区域和3’区域转录物或可检测信号(其与转录物的量相关)的量不表现出与对照样品中相同比较的统计学上显著差异。本领域技术人员已知比较这些值的方法，包括但不限于学生t-检验和ANOVA分析。技术人员了解，由于本文使用的检测方法的固有技术差异，即使不存在染色体异常(即两个区域保持以单分子方式连接和在相同调控元件的控制下)，来自5’区域的可检测信号的量也不必然等于来自3’区域的可检测信号的量。在含有目标基因易位的样品中和没有易位的那些样品中预期发现的不同3’目标基因表达水平可以通过将3’目标基因表达水平归一化成5’目标基因的表达水平而建立。在一些实施方式中，各3’-和5’-目标表达水平测量可归一化成内源对照基因(Ct对照)，且当计算IDE分数时使用归一化测量的均值。一些有用的公式包括，例如：IDE＝ΔCt＝[平均(Ct5’/Ct对照)]–[平均(Ct3’/Ct对照)]，和IDE＝ΔCt＝Ln[平均(Ct5’/Ct对照)]–Ln[平均(Ct3’/Ct对照)]在一些实施方式方式中，ΔCt≥4表明存在目标基因融合产物。在一些实施方式中，ΔCt≥2、4.5、5或8表明存在目标基因融合产物。在其它实施方式中，测试样品中3’和5’转录物的测量量可归一化成来自对照样品的相同转录物的水平，而非内源基因。IDE分数可以表示为目标基因5’区域相对目标基因3’区域表达的“相对量”或“比率”。相对量可以是单个值或值的范围。各区域(5’区域或3’区域)的表达被确定为来自针对该目标基因区域的多种引物、引物对和/或探针的转录物的平均Ct。如果目标基因5’区域的平均表达相对目标基因3’区域的平均表达的比率在统计学上小于或大于1，则检测到染色体异常。当该比率小于1时，目标基因3’区域已被易位到比原目标基因转录更活跃的基因组区域。当该比率大于1时，3’区域或已缺失或已被易位到与原目标基因相比转录不太活跃的基因组区域。不论何种情况，显著不同于1的比率将表明差异表达，且可以得出目标基因的5’和3’区域在不同启动子的控制下表达(或者一个区域可能完全不表达)使得目标基因中存在染色体异常的结论。在一些实施方式中，如果5’和3’区域转录物或可检测信号的平均量在约1个标准差内、在约0.5个标准差内、在约0.2个标准差内、在约0.1个标准差内或在约0.01个标准差内，则这两个量之间可能没有显著差异。在该实例中，可以得出5’和3’区域以单分子方式表达和目标基因中没有染色体异常的结论。可选地，如果5’区域和3’区域转录物或可检测信号的平均量超过约1个标准差、约1.5个标准差、约2.0个标准差或约2.5个标准差，则这两个量之间可能有显著差异。在该实例中，可以得出5’和3’区域在不同启动子的控制下表达(或者一个区域可能完全不表达)使得目标基因中存在染色体异常的结论。所公开的IDE方法相比其它方法的一个另外优势是无需生成标准曲线以实践所述公开方法。因此，通过消除对于在5’和3’两处同等扩增的各目标基因进行标准设计的需求而简化分析设计程序。可使用针对多个基因各自5’区域和3’区域的多个引物和/或引物对以筛选特定疾病或病症的基因易位组。可使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和/或实时聚合酶链反应(实时PCR)分析从受试者获得的样品以确定特定基因或感兴趣核酸序列5’和3’区域的相对表达水平。RT-PCR是用于mRNA检测和定量的灵敏技术。与其他两种常用的用于定量mRNA水平的技术：RNA印迹分析和RNA酶保护分析相比，RT-PCR可用于定量更小样品的mRNA水平。实际上，该技术灵敏到足以能够定量单个细胞的RNA。只要已知感兴趣基因的序列，本领域技术人员将知道如何设计用于检测任何感兴趣基因的5’和3’差异表达的寡核苷酸引物和探针。引物的大小将取决于多种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。例如，用作延伸引物或探针的寡核苷酸将足够长以在催化剂例如DNA聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷存在的情况下引导延伸产物的合成。可选地，插入或转座事件可以导致目标基因5’区域和3’区域的差异表达。例如启动子或其它调控元件的插入或可转座元件转座到感兴趣基因的编码序列中间可以产生目标基因5’区域以不同于目标基因3’区域的水平表达的情况。任何这种导致目标基因5’区域和目标基因3’区域差异表达的突变可根据本文描述的方法、组合物和试剂盒检测。本领域技术人员将会知道如何将例如PCR引物引向存在于转录起始处或其附近的感兴趣基因的5’区域，从而确保产物对应于潜在染色体异常的5’(上游)区域。本领域技术人员只需要参考目标基因的已知序列和已知的碱基配对原则，以确定有效的PCR引物或引物对。同样，本领域技术人员能设计针对感兴趣基因3’区域的引物或引物对。在具体实例中，在存在已知染色体异常的情况下，本领域技术人员进一步通过已知突变位点知识的帮助，从而允许设计在突变位点处或其附近的引物，例如引物或引物对可以设计紧挨着突变位点的5’(上游)和紧挨着突变位点的3’(下游)；或者引物或引物对可以设计在突变位点任一侧约5个核苷酸(nt)内、在突变位点任一侧约10个nt内、在突变位点任一侧约20个nt内、在突变位点任一侧约50个nt内、在突变位点任一侧约100个nt内、在突变位点任一侧约250个nt内或在突变位点任一侧约500个nt内。在某些实施方式中，本文公开的IDE方法允许检测无关于染色体断裂点的易位。染色体异常:染色体异常可以反映与生物体全部染色体正常全基因互补相比该生物体全基因互补或其任何部分之间的差异。例如，基因异常可以包括染色体拷贝数的改变(例如非整倍性)或其部分的改变(例如缺失、重复、扩增)；或染色体结构的改变(例如易位、点突变)。基因异常可能导致病理状态。尽管有些疾病例如癌症是由生命过程中少数细胞中获得的基因异常引起的，但术语“遗传疾病”最常指存在于全部体细胞中和从怀孕即存在的疾病。基因异常可以是遗传性的或非遗传性的。遗传重复是基因组序列区域的任何重复。它可以作为同源重组、逆转座事件或整个染色体复制中的差错而发生。基因的重复与多种疾病相关，例如一些畸形性骨肉瘤的病例与MYC基因的重复有关(Sarcoma，1(3-4):131-134，1997)，一些乳腺癌的病例与HER-2/neu基因的重复有关(AnnOncol.，12(suppl1):S3-S8，2001)，一些膀胱肿瘤的病例与c-erb-2基因的重复有关(CancerRes.，55:2422-2430，1995)。缺失(又称为基因缺失、缺陷或缺失突变)是部分染色体或DNA序列丢失的基因畸变。缺失是遗传物质的丢失。从单个碱基到整个染色体片段，任何数量的核苷酸都可以缺失。缺失可以由减数分裂过程中染色体交换中的差错造成。缺失与多种遗传病症相关，包括一些男性不育病例和三分之二杜氏肌营养不良病例，染色体5短臂的部分缺失导致称为猫叫的综合征，又称为“猫啼”综合征。基因异常也可以是点突变、插入或缺失。点突变或置换是一种导致单个碱基核苷酸被另一核苷酸替换的突变。插入和缺失包括单个碱基对的插入或缺失。基因或染色体中的突变通常与疾病相关，例如镰刀形细胞贫血症、囊性纤维化、血友病、苯丙酮尿症、脊柱裂等。样品制备可以根据本发明分析的本文公开的样品包括但不以任何方式限于，血液(全血或血液组分(fraction)例如血浆、血清或具体细胞成分)、淋巴、粘液、泪液、唾液、囊液、尿液、精液、粪便、脑脊液(CSF)、腹水以及身体组织的活组织检查样品、细针穿刺物(FNA)、支气管肺泡灌洗液(BAL)。可采用本发明方法检测和定量的目标核酸所来自的附加样本可根据本领域技术人员已知的方法获得自受试者滑液、胸膜液、心包液、眼内液、活检组织(tissuebiopsy)或气管内吸出物、唾液、用拭子从例如皮肤、腹股沟、鼻和/或喉取下的样品。本领域技术人员熟知获得测试样品和参照样品的方法，且其包括但不限于吸出、组织切片、抽取血液或其它液体、外科或穿刺活检、收集石蜡包埋的组织、收集体液、收集粪便等。在一个实施方式中，测试样品可以从被怀疑患有疾病(例如癌症)或基因异常的个体收集。在一些实施方式中，样本是来自患有或被怀疑患有疾病或基因异常的受试者的组织样品(活检样品)。核酸(DNA和/或RNA)可以根据本领域技术人员熟知的任何方法从样品中分离。如果需要，可以通过离心等收集或浓缩样品。样品的细胞可以进行裂解，例如通过用酶、热表面活性剂、超声或其组合处理进行。进行裂解处理是为了获得足够量的源自感兴趣细胞的RNA(如果存在于样品中)，以使用RT-PCR和/或实时PCR进行检测。核酸不需要提取，但可以通过如美国专利公开号2008/131876中所述的细胞或组织的适当处理而获得。在一个实施方式中，可以使用mRNA或者从mRNA或总RNA产生的cDNA。多种RNA提取方法适于分离RNA。适当的方法包括酚和氯仿提取。参见Maniatis等人，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2d，ColdSpringHarborLaboratoryPress，16.54页(1989)。此外，用于分离mRNA和合成cDNA的试剂盒可以商业购得，例如来自Qiagen的RNeasyProtectMini试剂盒、RNeasyProtectCellMini试剂盒。在一个实施方式中，使用双RNA/DNA分离方法，其采用基于trizol的试剂从患者样品初步分离RNA和DNA。一旦与患者样品接触，trizol中的酚和高盐试剂有效地灭活患者样品中可能存在的任何病原体(diseaseagent)或次级病原体。在从患者样品中分离出RNA和DNA后，可以使用硅基柱(silicabasedcolumn)进一步分离RNA和DNA。硅基柱的使用允许快速高效地进行洗涤步骤，同时最小化污染的可能性。可以使用洗涤步骤除去PCR和RT-PCR抑制剂。由于可以与不同类型的患者样品使用并且旋转(spin)和洗涤步骤有效地除去PCR或RT-PCR抑制剂，核酸的柱纯化方法是有优势的。核酸的扩增核酸样品或目标核酸可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行扩增。在适当的实施方式中，使用PCR扩增感兴趣核酸。简而言之，在PCR中，制备与标记序列的相反互补链(oppositecomplementarystrands)上的区域互补的两条引物序列。向反应混合物中加入过量的三磷酸脱氧核糖核苷以及DNA聚合酶例如Taq聚合酶。在本方法中，使用至少两个引物对扩增转录物5’区域的两个不同部分。还使用至少两个引物对扩增转录物3’区域的两个不同部分。在一些实施方式中，使用三个、四个、五个或六个不同引物对扩增5’区域和/或3’区域的不同部分。5’区域或3’区域的“不同部分”或“不同部件”是指具有彼此不同的核苷酸序列的基因转录物区域。不同区域可彼此重叠。在一个实施方式中，在多重扩增反应中扩增目标核酸。本领域已知多种多重扩增策略，并且可以与本发明的方法一起使用。根据病原体中所含的核酸类型，多重扩增策略可以使用PCR、RT-PCR或其组合。例如，如果存在RNA基因组，可以使用RT-PCR。PCR酶可以是具有逆转录和聚合酶功能的酶。此外，PCR酶可以有能力进行本领域已知的“热启动”反应。如果样品中存在目标序列，引物将与该序列结合，并且聚合酶通过添加在核苷酸上而使引物沿着目标序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将从目标核酸上解离以形成反应产物，过量的引物将与目标核酸和反应产物结合，并且重复该过程，从而产生扩增产物。循环参数可以根据要延伸的扩增产物的长度而变化。样品中可以包括利用寡核苷酸引物和/或探针的内部阳性扩增对照(IC)。扩增核酸的检测.核酸的扩增可以通过本领域熟知的多种方法中任意一种检测，例如凝胶电泳、柱层析、探针杂交、测序、解链曲线分析或“实时”检测。在一种方法中，来自两个或更多感兴趣片段的序列在同一反应容器中进行扩增(即“多重PCR”)。可以通过测量反应的终点或“实时”测量来进行检测。对于实时检测，引物和/或探针可以可检测地被标记，以允许例如当引物被结合时或当探针杂交时荧光的差异，并且在能监测反应过程中荧光变化的装置中进行扩增。核酸扩增的实时检测方法是众所周知的，包括例如TAQMANTM系统、ScorpionTM双功能分子以及针对双链核酸的嵌入染料的使用。在终点检测中，可以通过首先按大小分离(size-separating)扩增子，然后检测按大小分离的扩增子，来检测扩增子。不同大小的扩增子的分离可以用例如凝胶电泳、柱层析或毛细管电泳完成。本领域熟知这些和其他分离方法。在一个实例中，大小差10个或更多个碱基对的约10个至约150个碱基对的扩增子可以例如在4％至5％琼脂糖凝胶(对于约150个至约300个碱基对的扩增子，为2％至3％琼脂糖凝胶)或6％至10％聚丙烯酰胺凝胶上分离。分离的核酸随后可用染料例如溴化乙锭染色，并且所得染色带的大小可以与标准DNA梯带进行比较。在另一实施方式中，两个或更多个感兴趣片段在单独的反应容器中进行扩增。如果扩增是特异性的，即，一个引物对扩增一个感兴趣片段而不是其它的，则扩增的检测足以区分两种类型，将不需要大小分离。在一些实施方式中，通过用特异性探针杂交来检测扩增的核酸。可以使用与扩增目标序列的一部分互补的探针寡核苷酸检测扩增的片段。杂交可以实时或非实时检测。每个目标序列的扩增核酸可以被同时(即在同一反应容器中)或单独(即在单独的反应容器中)检测。在一些实施方式中，使用两个或更多个可区别标记的基因特异性寡核苷酸探针同时检测扩增的DNA，其中一个与第一目标序列杂交，且一个与第二目标序列杂交。可以用本领域已知的方法可检测地标记探针。有用的标记包括例如荧光染料(例如CY5TM、CY3TM、FITC、罗丹明、镧系磷光体(lanthamidephosphor)、德克萨斯红、FAM、JOE、CalFluorRedQuasar670TM)、32P、35S、3H、14C、125I、131I、电子致密试剂(例如金)、酶(例如常用于ELISA的酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记(例如胶体金)、磁性标记(例如DYNABEADSTM)、生物素、地高辛配基(dioxigenin)或半抗原和可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白。其他标记包括能分别与相应受体或寡核苷酸互补体(oligonucleotidecomplement)形成复合物的配体或寡核苷酸。标记可以直接掺入要检测的核酸中，或其可以连接到与要检测核酸杂交或结合的探针(例如寡核苷酸)上。实时PCR的一个常用方法使用荧光探针例如探针、分子信标和ScorpionsTM。实时PCR以比其他形式的检测最终扩增产品量的定量PCR更高的特异性、灵敏性和重复性对模板的初始量进行定量。实时PCR不检测扩增子的大小。SCORPIONTM和技术中使用的探针基于荧光淬灭的原理，并且包括供体荧光团和淬灭部分。在一个实施方式中，可检测标记是荧光团。如本文所用的术语“荧光团”是指吸收特定波长(激发频率)的光，随后发射较长波长(发射频率)的光的分子。如本文所用的术语“供体荧光团”是指当紧邻淬灭剂部分时将发射能量供给或转移给淬灭剂的荧光团。由于能量供给淬灭剂部分，供体荧光团本身将会以在没有紧密放置的淬灭剂部分时发射的特定发射频率发射较少的光。如本文所用的术语“淬灭剂部分”是指这样的分子：其紧邻供体荧光团，吸收由供体产生的发射能量，并以热的形式将能量耗散或发射波长比供体发射波长更长的光。在后一种情况下，淬灭剂被认为是受体荧光团。淬灭部分可以通过接近(即碰撞)淬灭或通过荧光共振能量转移(“FRET”)起作用。FRET淬灭一般用在TAQMANTM探针中，而接近淬灭用在分子信标和SCORPIONTM型探针中。在接近淬灭(又称为“接触”或“碰撞”淬灭)中，供体紧邻淬灭剂部分，使得供体的能量被转移到淬灭剂，淬灭剂以热的形式耗散该能量而不进行荧光发射。在FRET淬灭中，供体荧光团将其能量转移到淬灭剂，淬灭剂以更高波长将该能量作为荧光释放。接近淬灭需要供体和淬灭剂部分的位置非常近，而FRET淬灭也与距离相关，其发生在较大的距离上(通常1-10nm，能量传递取决于R-6，其中R是供体和受体之间的距离)。因此，当涉及FRET淬灭时，淬灭部分是受体荧光团，其具有与供体发射频谱重叠的激发频谱。当使用FRET淬灭时，分析可以检测由于供体与淬灭剂(受体荧光团)之间距离增加而引起的供体荧光团荧光的增加，或者由于供体与淬灭剂(受体荧光团)之间距离减小而引起的受体荧光团发射的减小。适当的荧光部分包括以下本领域已知的荧光团：4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、吖啶及其衍生物(吖啶、吖啶异硫氰酸酯)Alexa350、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647(分子探针)、5-(2'-氨乙基)氨基萘1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-(乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸酯(LuciferYellowVS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、BlackHoleQuencher(BHQTM)染料(BiosearchTechnologies)、R-6G、530/550、FL、亮黄香豆素及衍生物(香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))、四氯四溴荧光素(cyanosine)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5’,5’'-二溴邻苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetate)、4,4'-二异硫氰酸二氢-芪-2,2'-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)、4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)、Eclipse(EpochBiosciencesInc.)、伊红及衍生物(伊红、伊红异硫氰酸酯)、赤藓红及其衍生物(赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯)、乙锭、荧光素及衍生物(5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯荧光素(TET))、荧光胺、IR144、IR1446、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、碱性副品红、酚红、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、邻苯二甲醛、Oregon碘化丙啶、芘及衍生物(芘、丁酸芘、琥珀酰亚胺基1-丁酸芘)、7、9、21、35(分子探针)、活性红4(BrilliantRed3B-A)、罗丹明及衍生物(6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明绿、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红))、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、CALFluorRed610、Quasar670、核黄素、玫红酸、铽螯合物衍生物。可以使用其他荧光核苷酸类似物，参见例如Jameson，278Meth.Enzymol.，363-390(1997)；Zhu，22Nucl.AcidsRes.，3418-3422(1994)。美国专利号5,652,099和6,268,132也描述了核苷酸类似物，其通过酶或化学合成而掺入核酸例如DNA和/或RNA或寡核苷酸中以产生荧光寡核苷酸。美国专利号5,135,717描述了用作荧光标记的酞菁染料和四苯三氮杂卟啉试剂。可检测标记可以掺入核酸中、与核酸连接或结合到核酸上。可以用多种长度的间隔臂连接标记，以减少潜在的立体位阻或对其他有用或期望性质的影响。参见例如Mansfield，Mol.Cell.Probes，9:145-156(1995)。可检测标记可以通过共价或非共价手段，例如通过转录，如通过使用Klenow聚合酶进行随机引物标记，或切口平移，或扩增，或本领域已知的等价方法而掺入核酸中。例如，核苷酸碱基结合到可检测部分例如荧光染料上，然后在核酸合成或扩增过程中掺入核酸中。采用ScorpionTM探针，使用单个分子实现序列特异性引导和PCR产物检测。ScorpionTM探针在未杂交状态下保持茎-环构型。荧光团连接到5’末端，并且通过与3’末端偶联的部分而淬灭。茎的3’部分也含有与引物的延伸产物互补的序列。该序列通过不可扩增单体与特异性引物的5’末端连接。在ScorpionTM引物延伸后，特异性探针序列能在延伸的扩增子内与其互补体结合，从而打开发夹环。这阻止荧光团的淬灭，并且观察到信号。通过反向引物和ScorpionTM的引物部分扩增特异性目标，产生延伸产物。由于ScorpionTM的探针元件与延伸产物结合，导致荧光团与淬灭剂分离，产生荧光信号。探针(Heid等人，GenomeRes，6:986-994，1996)使用Taq聚合酶的荧光5’外切核酸酶活性测量cDNA样品中目标序列的量。探针是包含通常位于5’碱基处或其附近的供体荧光团和通常位于3’碱基处或其附近的淬灭部分的寡核苷酸。淬灭剂部分可以是染料例如TAMRA或可以是非荧光分子例如4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)。参见Tyagi等人，NatureBiotechnology，16:49-53(1998)。当被照射时，激发的荧光供体通过FRET而不是发出荧光将能量转移到邻近的淬灭部分。因此，供体与淬灭剂的紧邻阻止供体荧光的发射，同时探针是完整的。探针被设计为退火(anneal)到PCR产物的内部区域。当聚合酶(例如逆转录酶)复制结合了探针的模板时，其5’外切核酸酶活性切割所述探针。这终止了淬灭剂的活性(没有FRET)，并且供体荧光团开始发射荧光，所述荧光在与探针切割速率成比例的每个循环中增加。PCR产物的累积通过监测报告染料荧光的增加进行检测(注意：引物没有被标记)。如果淬灭剂是受体荧光团，则PCR产物的累积可以通过监测受体荧光团荧光的减少进行检测。在适当的实施方式中，使用能检测来自一个或更多个荧光标记的荧光的任何适当装置进行实时PCR。例如，该装置(例如ABI7900HT序列检测仪)上的实时检测在每个PCR循环期间监测荧光并计算报告信号的测量，或Rn值。循环阈值，或Ct值是荧光与阈值交叉的循环。阈值通过序列检测系统软件或人工进行测定。Ct值可以与反应中初始模板核酸的量相关。在一些实施方式中，可以使用解链曲线分析检测扩增产物。解链曲线分析包括通过将扩增子暴露于温度梯度来测定核酸扩增子的解链温度以及观察来自荧光团的可检测信号。解链曲线分析基于以下事实：核酸序列在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链，所述解链温度被定义为一半DNA双链体已分离为单链的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子的Tm比具有富含A和T核苷酸的DNA分子高。当在所述方法中使用荧光染料测定核酸的解链温度时，荧光染料可以发射信号，所述信号可以与用于标记寡核苷酸的任何其他不同的荧光染料发射的信号区别开。在一些实施方式中，用于测定核酸解链温度的荧光染料可以由与用于标记寡核苷酸的任何其他不同的荧光染料所不同的波长能量进行激发。在一些实施方式中，用于测定检测的核酸解链温度的第二荧光染料是嵌入剂。适当的嵌入剂可以包括但不限于SYBRTMGreen1染料、SYBRTM染料、PicoGreen、SYTO染料、SYTOX染料、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭-吖啶异二聚体、单叠氮乙锭、碘化丙锭、花菁单体、7-氨基放线菌素D、YOYO-1、TOTO-1YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1。JO-PRO-1及其混合物。在适当的实施方式中，选择的嵌入剂是SYBRTMGreen1染料。通过检测失去荧光信号时的温度，可以测定解链温度。在公开的方法中，每个扩增的目标核酸可以具有不同的解链温度。例如，每个扩增的目标核酸可以具有与任何其他扩增的目标核酸相差至少约1℃，更优选至少约2℃或甚至更优选至少约4℃的解链温度。诊断方法在一方面，本文所述的方法提供诊断受试者中前列腺癌或癌症易感性。如本文所用的术语“诊断(diagnose)”或“诊断(diagnosis)”是指通过评估疾病或病症的征兆和症状，识别或确定生物体疾病或状况，或者疾病或状况的原因的行为或过程。通常，疾病或病症的诊断是基于对指示该疾病的一个或更多个因素和/或症状的评估。即，可以基于指示疾病或状况存在与否的因素存在与否或其量，进行诊断。每个被认为指示特定疾病诊断的因素或症状不需要排他地与该特定疾病相关，即可以从诊断因素或症状推断出不同诊断。同样也存在在没有特定疾病的个体中有指示该特定疾病的因素或症状的情况。该方法包括但不限于前列腺和肺癌，以及与这些癌症相关的易位、插入、倒位和缺失。在一个实施方式中，将受试者样品中ROS1基因5’区域的表达水平与ROS1基因3’区域的表达水平进行对比，其中ROS1基因5’区域与ROS1基因3’区域表达水平的差异指示受试者中的NSCLC或NSCLC易感性。在另一实施方式中，将受试者样品中RET基因5’区域的表达水平与RET基因3’区域的表达水平进行对比，其中RET基因5’区域与RET基因3’区域表达水平的差异指示受试者中的NSCLC或NSCLC易感性。在一个实施方式中，将受试者样品中ALK基因5’区域的表达水平与ALK基因3’区域的表达水平进行对比，其中ALK基因5’区域与ALK基因3’区域表达水平的差异指示受试者中的NSCLC或NSCLC易感性。预后方法在一方面，本文所述的方法提供癌症或受试者中的预后。如本文所用的术语“预后”是指临床状况或疾病的可能病程和结果的预测。患者的预后通常通过评估指示疾病有利或不利病程或结果的该疾病的因素或症状作出。术语预后不是指以100％的准确率预测状况的病程或结果的能力。相反，本领域技术人员将会理解，术语“预后”是指将发生某种病程或结果的增加的可能性；即，与没有表现出给定状况的个体相比时，表现出该状况的患者更有可能发生病程或结果。预后可以表示为患者能够预期存活的时间量。可选地，预后可以指疾病减轻的可能性或疾病预期保持减轻的时间量。预后可以以多种方式表示；例如，预后可以表示为一年、五年、十年等之后患者存活的机会百分比。可选地，预后可以表示为由于状况或疾病，患者可以预期存活的平均年数。患者的预后可以被认为是相对的表示，其中许多因素影响最终的结果。例如，对于患有某些状况的患者，预后可以适当地表示为状况可以治疗或治愈的可能性，或疾病将减轻的可能性，而对于患有更严重状况的患者，预后可以适当地表示为特定时间段内存活的可能性。该方法包括但不限于前列腺和肺癌。预后通常通过检查一个或更多个预后因素或指征确定。这些因素或指征是标记，例如特定染色体易位的存在，患者(或获自患者的样品)中这些标记的存在或量标志着给定病程或结果将发生的可能性。本领域技术人员将会理解，将预后指征与不利结果的诱因关联可能涉及统计学分析。在一个实施方式中，将受试者样品中ROS1基因5’区域的表达水平与ROS1基因3’区域的表达水平进行对比，其中ROS1基因5’区域与ROS1基因3’区域表达水平的差异指示受试者中前列腺癌的阶段、严重程度或结果。试剂盒在另一方面，本公开提供了用于检测样品中基因异常的试剂盒。所述试剂盒可包含：(a)针对目标基因转录物5’部分不同区域的至少两个引物对，和(b)针对目标基因转录物3’部分不同区域的至少两个引物对。所述试剂盒可任选地进一步包含针对源自采用试剂盒中引物扩增的至少一个扩增子序列的至少一个探针。在一些实施方式中，各引物对中的所述至少一个引物是可检测标记的和/或/是引物-探针。在一个实施方式中，所述目标基因是ROS1、RET或ALK。在一些实施方式中，针对各自3’目标基因转录物的引物对存在于所述试剂盒中。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含一种或多种试剂，例如用于进行逆转录、PCR和/或实时PCR的试剂。在一些实施方式中，试剂盒包含打印的说明。如本文所用的，“试剂盒”是指用于具体目的的经包装组件集合。其中可包装试剂盒的非限制性材料实例包括盒、袋、信封和管，但试剂盒组件可以另外的包装材料类型提供给消费者。在一些实施方式中，试剂盒中包含的引物和/或探针是分离的多聚核苷酸，且其可以试剂盒内的管、小瓶或其它容器类型提供。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含用于使用试剂盒组件的说明。所述说明可打印在试剂盒内材料上或以电子形式提供。在一些实施方式中，经打印的说明指明如何使用试剂盒中所含试剂以检测基因内差异表达。实施例实施例1-ALK+ROS1+RET易位组的基因内差异表达(IDE)分析以下实施例说明了进行实时PCR和实时分析的标准方案。TaqMan探针标记系统是实时检测PCR扩增子的示例性方法。以下实施例用于说明本发明，而决不意欲限制本发明的范围。IDE方案：设计靶向ALK、ROS1和RET的不同5’(易位断裂点之前)和3’(易位断裂点之后)区域的多个引物/探针对(表1)。首先使用SuperscriptIII(LifeTechnologies)将经提取RNA逆转录为cDNA，然后与序列特异性正向/反向引物(IDT，Coralville，Iowa)以及2XPCRMasterMix(Celera，Alameda，CA)混合。然后在BioMarkHD基因表达48.48阵列芯片(Fluidigm，SouthSanFrancisco，CA)或ViiA7仪器(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)上使该混合物经受45个PCR扩增循环(95℃下15秒，然后是60℃下60秒)。计算ΔCt且高IDE分数(ΔCt≥4.0)暗示存在目标基因融合产物。表1.基因内差异表达(IDE)多重RT-PCR试验的引物设计FISH方案在一个样品子集上进行荧光原位杂交(FISH)。将FFPE切片(4μm厚)与VysisALKBreakApartFISH探针(AbbottMolecular，AbbottPark，IL)、ROS1Breakapart探针(CytoCell，Cambridge，UK)和PoseidonRETBreakApart探针(Kreatech，Amsterdam，NL)杂交。简而言之，用70℃下1M硫氰酸钠溶液预处理脱石蜡组织切片，然后在40℃下通过胃蛋白酶进行消化(10mg/mL)。将10μL探针施用至各脱水和风干载片并在85℃下共变性3分钟，然后在37℃下过夜杂交。采用2xSSC/0.3％NP-40在72℃下进行杂交后洗涤。采用DAPII复染剂(VectorLaboratoriesInc.，BurlingameCA)进行载片装嵌。采用Nikon50i荧光显微镜(NikonCorp.，Tokyo，Japan)评估FISH结果。使用CCD相机和成像系统(MetaSystems，Watertown，MA)捕获图像。在全部正常情况下分析总共50细胞并在任何异常情况下分析100细胞。在所有情况下，检查整个载片可能错漏重排的可能区域。ALK、ROS1和RET的基因重排临界值分别为15％、9％和12％。EML4-ALK方案如前所述通过多重RT-PCR进行EML4-ALK(12)。简而言之，采用FAM标记引物通过多重RT-PCR扩增RNA样品。然后将RT-PCR产物稀释、变性并通过毛细管电泳在ABI3730遗传分析仪(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)中进行大小分级。采用GeneMapper软件(AppliedBiosystems)分析结果。RET-PTC方案如前所述通过实时RT-PCR检测RET-PTC1、RET-PTC3重排(13)。将经提取RNA逆转录并接着通过实时PCR在ABI7900仪器(LifeTechnologies)上扩增，通过SDS软件(LifeTechnologies)分析结果。结果：IDE分析的PCR效率使用不同RNA标准(ABL为Raji、ALK为PC3、ROS1为HCC-78、RET为TPC-1、以及各种临床样品)的连续稀释以确立IDE分析的扩增效率(表2)。PCR效率测试总共选择18个引物对。全部显示良好的PCR效率(介于90～110％之间)。表2.IDE试验PCR扩增效率(所选引物对)细胞系(阳性对照)样本的IDE结果：在9个单独设置中研究来自易位阳性细胞的RNA，且结果汇总在表3中。使用5’和3’之间ΔCt≥4.0作为阳性临界值，结果是预期和观测之间100％一致。表3.IDE分析表现:阳性对照细胞系RNAALK、ROS1、RETIDE结果汇总：然后，通过IDE测试总共408个NSCLC临床样品的ALK、ROS1和RET易位(参见表4)。通过ALK、ROS1、RETIDE总共测试了33个(8.40％)临床样品阳性。IDE分析具有3.67％的失败率。表4.通过IDE的ALK、ROS1、RET发生率对于ALK，通过IDE测试20个样品为阳性(表5)。15/20个样品通过FISH和/或EML4-ALK已知为ALK阳性。5/20个样品通过IDE测试为阳性但通过FISH或EML4-ALK测试为阴性(假阳性)。此外，一个FISH阳性样品通过IDE和EML4-ALK二者测试均为阴性(假阴性)。表5ALKIDE结果汇总对于ROS1，ROS1阳性细胞系和3/408个(0.76％)NSCLC样品通过IDE测试均为阳性IDE(表6)。ROS1和ALKIDE阳性是互斥的。在3个IDE阳性NSCLC样品中，1个通过FISH证实为阳性，且1个通过FISH证实为阴性。表6.ROS1IDE结果汇总对于RET，全部7个已知的RET阳性和10/408个(2.5％)NSCLC样品通过IDE测试为阳性(表7)。RET和ALKIDE阳性是互斥的。在10个IDE阳性临床样品中，4个通过FISH或RET-PTC证实为阳性，且2个通过FISH证实为阴性。表7.RETIDE结果汇总ALKIDE分析特性：ALKIDE真阳性临床样品(通过FISH和/或EML4-ALK证实阳性结果)相比ALKIDE真阴性样品(ΔCt平均为2.11，表8)显示较高的ΔCt(平均6.87)。ALKIDE假阳性样品(通过FISH和/或EML4-ALK为阴性结果)显示中间的ΔCt范围。表8.临床样品的ALKIDEΔCt范围ALKIDE#样品ΔCt范围均值真阳性154.4～10.76.87假阳性54.0～7.86.26真阴性372(1.2)～3.92.11来自ALKFISH、EML4-ALK和ALKIDE间一致性研究的结果表明IDE和FISH之间有96.9％(186/192)的一致性且IDE和EML4-ALK之间有96.4％(185/192)的一致性(表9)。3个EML4-ALK阴性样品通过FISH和IDE二者证实均为阳性，而1个ALKFISH阴性样品通过EML4-ALK和IDE二者证实均为阳性。具有1个假阴性(FISH阳性，但通过IDE和EML4-ALK二者证实均为阴性)和4个假阳性(IDE阳性，但FISH和EML4-ALK阳性)样品。表9.ALK一致性研究:FISH对EML4-ALK、对IDE为计算ALKIDE分析的灵敏性和特异性，具有15个真阳性样品、5个假阳性样品(IDE阳性，但FISH和/或EML4-ALK阴性)、1个假阴性(FISH阳性，但IDE和EML4-ALK阴性)和372个真阴性样品(参见表5)。因此，如下计算ALKIDE的分析表现特性：灵敏性＝TP/(TP+FN)*100％＝93.7％特异性＝TN/(FP+TN)*100％＝98.7％阳性预测值(PPV)＝TP/(TP+FP)*100％＝75％阴性预测值(NPV)＝TN/(TN+FN)*100％＝99.7％总而言之，总共使用416个样品(408个肺癌临床样品和2个ROS1阳性细胞系、以及7个RET阳性临床样品)以确立IDE的分析表现特性。除了一个以外，所有已知ALK、ROS1和RET易位阳性样品均通过IDE准确鉴定。IDE的易位阳性率为ALK5.09％、ROS10.76％、RET2.54％。所述ALK、ROS1、RETIDE分析可用作独立测试，或者用作有效筛选工具以发现用于通过FISH或其它跟踪方法证实的推定易位阳性样品。此外，可使用相同IDE策略检查NSCLC患者的附加易位/重排标记(例如NTRK、BRAF等)或者附加疾病导向易位组(例如甲状腺)。其他实施方式：因此，应当理解，尽管本发明通过优选实施方式和任选特征进行了具体公开，但本领域技术人员可以进行本文公开的包含在其中的本发明的修改、改进和变形，并且这些修改、改进和变形被认为在本发明的范围内。提供的材料、方法和实例代表了优选实施方式，其为示例性的，无意于对本发明范围进行限制。本文广泛且总体地描述了本发明。每个落入总体公开内的较窄种类和次总集合也形成本发明的部分。这包括用限制条件或否定限制除去该类中任何主题的对本发明的总体描述，无论除去的材料是否在本文中有具体叙述。此外，在本发明的特征或方面以马库什组的形式描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组成员中的任何单个成员或亚组的形式得以描述。本文提及的所有公开、专利申请、专利和其他参考文献以其全部并入本文作为参考，达到与如同每个分别并入作为参考的相同程度。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。本文说明性地描述的发明可以适当地在缺乏本文没具体公开的任何要素(一种或多种)、限制(一种或多种)的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被可扩展地理解而没有限制。此外，本文使用的术语和表达被用作描述性的术语，没有限制作用，并且无意于使用这些术语和表达排除任何所示和所述特征或其部分的等价物，但应当认识到，在本发明请求保护的范围内多种修改是可能的。参考文献1.HowladerN等人SEERCancerStatisticsReview，1975-2009(2012)NationalCancerInstitute.Bethesda，MD,2.HerbstRS和BunnPAJr.Targetingtheepidermalgrowthfactorreceptorinnon-smallcelllungcancer.ClinCancerRes.(2003)9:5813-24.3.SodaM等人IdentificationofthetransformingEML4-ALKfusiongeneinnon-small-celllungcancer.Nature(2007)448:561-6.4.HowladerN等人SEERCancerStatisticsReview，1975-2009(2012)RikovaK等人Globalsurveyofphosphotyrosinesignalingidentifiesoncogenickinasesinlungcancer.Cell(2007)131:1190-203.5.TakeuchiK等人KIF5B-ALK，anovelfusiononcokinaseidentifiedbyanimmunohistochemistry-baseddiagnosticsystemforALK-positivelungcancer.ClinCancerRes.(2009)15:3143-9.6.KwakEL等人Anaplasticlymphomakinaseinhibitioninnon-small-celllungcancer.NEnglJMed.(2010)363:1693-703.7.TakeuchiK等人RET，ROS1andALKfusionsinlungcancer.NatMed.(2012)18:378-81.8.RimkunasVM等人AnalysisofreceptortyrosinekinaseROS1-positivetumorsinnon-smallcelllungcancer:identificationofaFIG-ROS1fusion.ClinCancerRes.(2012)18:4449-57.9.SueharaY等人IdentificationofKIF5B-RETandGOPC-ROS1FusionsinLungAdenocarcinomasthroughaComprehensivemRNA-BasedScreenforTyrosineKinaseFusions.ClinCancerRes.(2012)18:6599-608.10.BergethonK等人ROS1rearrangementsdefineauniquemolecularclassoflungcancers.JClinOncol.(2012)30:863-70.11.KohnoT等人KIF5B-RETfusionsinlungadenocarcinoma.NatMed.(2012)18:375-7.12.Sanders，HR，LiHR，BrueyJM，ScheerleJA，Meloni-EhrigAM，KellyJC，NovickC，AlbitarM.Exonscanningbyreversetranscriptase-polymerasechainreactionfordetectionofknownandnovelEML4-ALKfusionvariantsinnon-smallcelllungcancer.CancerGenet.2011204:45-52.13.Cyniak-MagierskaA，Wojciechowska-DurczyńskaK，Krawczyk-RusieckaK，ZygmuntA，LewińskiA.AssessmentofRET/PTC1andRET/PTC3rearrangementsinfine-needleaspirationbiopsyspecimenscollectedfrompatientswithHashimoto'sthyroiditis.ThyroidRes.(2011)4:5.当前第1页1 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