本发明属于分析化学的分子逻辑门技术领域，涉及一种免标记、高灵敏度、高选择性的mirna智能检测方法的建立。
背景技术：
分子器件是20世纪80年代提出来的，主要涉及两个领域：基于分子尺度的器件和基于分子材料的器件。其中，基于分子尺度的器件是目前最为活跃、研究最广的几个热点领域之一。分子器件对于分析化学的仪器微型化的发展至关重要，分子器件本身具有成本低、反应迅速等特点，有利于便携式仪器的发展，以达到实时、在线检测的目的。分子器件主要包括分子整流器、分子存储器、分子马达、分子逻辑门等。本专利主要是利用分子逻辑门和生物传感器来进行分析信号的智能化处理。
由于dna出色的分子识别能力，基于dna的分子逻辑器件在疾病诊断、生物传感等领域取得了也取得了一定的发展。dna分子逻辑门的一个重要优势就是它可以对低浓度的目标物产生响应信号，从而完成检测。然而，建立基于分子水平的免标记逻辑传感器很少，这是由于逻辑传感器需要结合多个逻辑门，构建过程比较复杂造成的。这种逻辑传感器可以实现对同一样品中的不同目标物的多元检测，对于推动分子逻辑门在分析化学中的应用具有重要的意义。然而截止目前，仅仅有几例分子逻辑器件实现了对目标分子的多元检测。我们利用氧化石墨烯和银纳米簇，构建出一个基于or和inhibit的多重逻辑门，首次实现了对两种不同的mirna(mir-21和mir-141)的多元智能化检测，与传统的传感器相比，它能检测出多种分析物的存在并进行复杂的逻辑分析。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种基于银纳米簇和氧化石墨烯的免标记的多重分子逻辑门以及该逻辑器件在mirna多元智能化检测中的应用。这种or和inhibit级联的多重逻辑门是用来检验实际样品中两种不同的mirna(mir-21和mir-141)是否分别存在的组合逻辑电路。这种逻辑检测方法可以对复杂生物样品中的多个目标分析物的含量进行鉴定。
本发明是这样实现的，一种用于鉴定实际样品中的两种不同的mirna(mir-21和mir-141)是否分别存在的组合逻辑电路，具体包括以下步骤：
1.dna稳定的银纳米簇的制备：将银纳米簇的模板ag-dna1或ag-dna2溶解于磷酸钠的缓冲溶液中，加热至90℃退火，然后冷却至室温。将1mm银离子加入溶液，震荡摇匀，放置30min，再加入nabh4，将银离子还原，再次剧烈震荡1min后，避光保存过夜。反应完全后，得到淡黄色的dna保护的银纳米簇溶液。
2.基于银纳米簇和氧化石墨烯的分子逻辑平台的构建：将100nmag-dna1和100nmag-dna2保护的银纳米簇，与15μg/ml的氧化石墨烯混合15分钟后作为逻辑操作平台。
3.or逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的mir-21和mir-141来构建or逻辑门。当加入核酸序列(mir-21和mir-141)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.5作为判断依据，当相对荧光强度大于0.5时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.5时，输出为“0”。mir-21和mir-141可以在分子逻辑平台上构建一个or逻辑门。当输入mir-21或mir-141中的任意一个值时，输出信号均为“1”。
4.基于mir-21和p1的inhibit逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的mir-21和p1来构建inhibit逻辑门。mir-21和p1可以在分子逻辑平台上构建一个inhibit逻辑门。当输入p1时，无论体系中是否同时输入mir-21，输出信号均为“0”。只有体系中输入mir-21而不输入p1时，输出信号为“1”。
5.基于mir-141和p2的inhibit逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的mir-141和p2来构建inhibit逻辑门。mir-141和p2可以在分子逻辑平台上构建一个inhibit逻辑门。当输入p2时，无论体系中是否同时输入mir-141，输出信号均为“0”。只有体系中输入mir-141而不输入p2时，输出信号为“1”。
6.mirna的多变量检测：为了能够判断出样品中是否分别存在两种不同的mirna(mir-21和mir-141)，我们将同一样品分为四份。首先，把四份相同样品分别加入go/ag-dna1/ag-dna2分子逻辑平台，记为样品1，样品2，样品3，样品4。对于第一个样品，不再加入其它输入。对于第二个样品，加入1μmp1。对于第三个样品，加入1μmp2。对于第四个样品，加入1μmp1和1μmp2。根据样品1，2，3，4的相对荧光强度值输出“1”和“0”，用真值表判断样品中mir-21和mir-141是否存在。
附图说明
图1(a)or逻辑门构建示意图。(b)or逻辑门的荧光光谱图。(c)or逻辑门的相对荧光强度柱状图。(d)or逻辑门的真值表；
图2(a)基于mir-21和p1的inhibit逻辑门构建示意图。(b)基于mir-21和p1的inhibit逻辑门的荧光光谱图。(c)基于mir-21和p1的inhibit逻辑门的相对荧光强度柱状图。(d)inhibit逻辑门的真值表；
图3(a)基于mir-141和p2的inhibit逻辑门构建示意图。(b)基于mir-141和p2的inhibit逻辑门的荧光光谱图。(c)基于mir-141和p2的inhibit逻辑门的相对荧光强度柱状图。(d)inhibit逻辑门的真值表；
图4(a)inhibit-or级联逻辑门用于智能检测mir-21和mir-141的示意图。(b)inhibit-or级联逻辑门的真值表。“\”代表这种情况可以忽略；
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
实施例1
银纳米簇的制备：将5μmag-dna1或ag-dna2溶解在磷酸钠的缓冲溶液(10mmna2hpo4/nah2po4,100mmch3coona,5mmmg(ch3coo)2,ph7.5)中，然后在90℃下加热10分钟，然后缓慢冷却至室温。然后将30μm的agno3加入到5μmag-dna1或ag-dna2溶液中，混匀后，将混合溶液在避光下放置30分钟，使ag+离子与c碱基充分作用。最后，向缓冲体系中再次加入30μm的nabh4溶液，剧烈震荡1分钟。在4℃下避光反应过夜，制得荧光银纳米簇。
实施例2
基于银纳米簇和氧化石墨烯的or逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的mir-21和mir-141来构建or逻辑门。当加入核酸序列(mir-21和mir-141)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.5作为判断依据，当相对荧光强度大于0.5时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.5时，输出为“0”。当没有任何输入时，银纳米簇的荧光被氧化石墨烯所猝灭，相对荧光强度小于0.5，记为输出为“0”。由于mir-21和ag-dna1的序列部分互补，所以当加入mir-21时，ag-dna1会和mir-21杂交形成dna/rna双链结构，该双链结构会从氧化石墨烯表面脱附。因此，ag-dna1保护的银纳米簇同样会离开氧化石墨烯表面，荧光强度增强，相对荧光强度大于0.5，记为输出为“1”。同理，由于mir-141和ag-dna2的序列部分互补，所以当加入mir-141时，ag-dna2会和mir-141杂交形成dna/rna双链结构，该双链结构会从氧化石墨烯表面脱附。因此，ag-dna2保护的银纳米簇同样会离开氧化石墨烯表面，荧光强度增强，相对荧光强度大于0.5，记为输出为“1”。当然，二者同时存在时，ag-dna1保护的银纳米簇和ag-dna2保护的银纳米簇都会从氧化石墨烯表面脱附，相对荧光强度大于0.5，记为输出为“1”。由此可见，mir-21和mir-141可以在分子逻辑平台上构建一个or逻辑门。当平台输入mir-21或mir-141中的任意一个值时，输出信号均为“1”。
实施例3
基于mir-21和p1的inhibit逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的mir-21和p1来构建inhibit逻辑门。当加入核酸序列(mir-21和p1)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.5作为判断依据，当相对荧光强度大于0.5时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.5时，输出为“0”。当没有任何输入时，银纳米簇的荧光被氧化石墨烯所猝灭，相对荧光强度小于0.5，记为输出为“0”。由于mir-21和ag-dna1的序列部分互补，所以当加入mir-21时，ag-dna1会和mir-21杂交形成dna/rna双链结构，该双链结构会从氧化石墨烯表面脱附。因此，ag-dna1保护的银纳米簇同样会离开氧化石墨烯表面，荧光强度增强，相对荧光强度大于0.5，记为输出为“1”。而p1和ag-dna1、ag-dna2序列没有足够的互补碱基，所以当加入p1时，p1和其他dna不会发生杂交反应，这样银纳米簇无法离开氧化石墨烯表面，荧光信号不变，相对荧光强度小于0.5，记为输出为“0”。当然，mir-21和p1同时存在时，由于mir-21和p1是完全互补的，所以mir-21和p1会优先进行杂交，这样ag-dna1就无法和mir-21杂交。这样这样银纳米簇同样无法离开氧化石墨烯表面，荧光信号不变，相对荧光强度小于0.5，记为输出为“0”。由此可见，mir-21和p1可以在分子逻辑平台上构建一个inhibit逻辑门。
实施例4
基于mir-141和p2的inhibit逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的mir-141和p2来构建inhibit逻辑门。当加入核酸序列(mir-141和p2)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.5作为判断依据，当相对荧光强度大于0.5时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.5时，输出为“0”。当没有任何输入时，银纳米簇的荧光被氧化石墨烯所猝灭，相对荧光强度小于0.5，记为输出为“0”。由于mir-141和ag-dna2的序列部分互补，所以当加入mir-141时，ag-dna2会和mir-141杂交形成dna/rna双链结构，该双链结构会从氧化石墨烯表面脱附。因此，ag-dna2保护的银纳米簇同样会离开氧化石墨烯表面，荧光强度增强，相对荧光强度大于0.5，记为输出为“1”。而p2和ag-dna1、ag-dna2序列没有足够的互补碱基，所以当加入p2时，p2和其他dna不会发生杂交反应，这样银纳米簇无法离开氧化石墨烯表面，荧光信号不变，相对荧光强度小于0.5，记为输出为“0”。当然，mir-141和p2同时存在时，由于mir-141和p2是完全互补的，所以mir-141和p2会优先进行杂交，这样ag-dna2就无法和mir-141杂交。这样这样银纳米簇同样无法离开氧化石墨烯表面，荧光信号不变，相对荧光强度小于0.5，记为输出为“0”。由此可见，mir-141和p2可以在分子逻辑平台上构建一个inhibit逻辑门。
将实施例中构建的or和inhibit逻辑门应用于同一样品中的多个mirna的智能检测，其具体操作方法及结果如下应用实例：
应用实例1
为了能够判断出样品中是否分别存在两种不同的mirna(mir-21和mir-141)，我们需要使用inhibit-or级联逻辑门来完成信号输出。首先，我们将同一样品(原样品)分为四份。然后，将把四份相同样品(原样品)分别加入go/ag-dna1/ag-dna2分子逻辑平台，记为样品1，样品2，样品3，样品4。对于第一个样品，不再加入其它输入。对于第二个样品，加入1μmp1。对于第三个样品，加入1μmp2。对于第四个样品，加入1μmp1和1μmp2。当第一个样品没有明显的荧光信号时，我们可以认为原样品中不存在mir-21和mir-141，测试结束。如果第一个样品产生了荧光信号时，说明原样品中至少含有mir-21和mir-141中的一个。这样我们对第二个样品进行荧光测试。如果第二个没有产生荧光信号时，说明原样品中含有mir-21，这是因为第二个样品和第一个样品相比多加入p1，使得原样品中的mir-21被抑制了，无法杂交产生荧光信号。如果第二个仍然有荧光信号时，说明原样品中至少含有mir-141。我们需要进一步测试原样品是否只含有mir-141。这就需要对第三个样品进行荧光测试，如果第三个样品没有产生荧光信号时，说明原样品只含有mir-141。这是因为第三个样品比第一个样品多加入了p2，使原样品中的mir-141被p2抑制，无法杂交产生荧光信号。如果第三个样品仍然有荧光信号，说明原样品同时含有mir-21和mir-141两种mirna。这样只有当同时加入p1和p2的时候，荧光信号才会被猝灭(见第四个样品)。具体的真值表见附图4b。这种结合逻辑的检测方法为分析化学的智能化检测方面提供了很好的概念性模型。