本发明涉及一种荧光图像处理方法，具体是关于一种单分子荧光散焦图像处理方法。
背景技术：
玻璃化转变是凝聚态物理中未解的难题，对其本质目前尚没有一致的认识。单分子荧光方法被大家广泛用于研究玻璃化转变问题，尤其是在动力学非均匀性上，通过探测荧光分子的转动行为，可以间接地表征聚合物局域的动力学行为，但是由于受到荧光分子寿命和自相关分析方法的影响，目前的研究主要集中在过冷液体，对玻璃态体系的性质研究比较少，主要原因是缺乏一种有效地分析方法。在众多单分子荧光方法中，单分子荧光散焦成像方法主要具有两个优势，其一是可以实时追踪荧光分子的转动，通过分析散焦图像获得荧光分子的空间取向信息；其二是可以大范围同时观察很多荧光分子的转动，具有很强的空间分辨率。
用于单分子荧光方法的数字图像处理的优点包括：1)数字图像再现性好，在图像处理过程中，用户总是希望图像能承载更多信息，这就要求图像不会因存储、传输和复制等一系列操作而造成质量的退化，只要图像在数字化时准确地表现了原图，则数字图像处理过程始终能保持图像的再现。2)处理精度高，按照目前的技术，可将一幅图像数字化为任意大小的二维数组，对计算机而言，无论数组大小和每个像素的位数多少，处理程序基本相同。换句话说，从原理上不论图像的精度有多高，只要在处理时改变程序中的数组参数就可以实现其既定功能。3)适用面宽，图像信息源不会成为图像处理的障碍，可以是可见光图像、不可见的波谱图像、电子显微镜图像、航空照片、遥感图像或天文望远镜图像，来自不同信息源的图像只要转换成数字编码形式后，均由二维数组表示的灰阶图像组合而成，均可用计算机来处理。4)灵活性非常高，图像处理可分为图像的像质改善、图像分析等，每一部分均包含丰富多彩的内容，数字图像处理不仅可以完成线性运算且能实现非线性处理，可以用数学公式或逻辑关系来表达的一切运算均可以用数字图像处理实现。
但是由于现有技术中的软件均为通用软件，并未给这一类散焦图像的图像处理提供一个强有力的工具，不能将图像处理部分和频谱分析部分在同一个软件下实现既定功能，增加了工作周期，降低了工作效率，因此急需一种处理单分子荧光散焦图像的方法，以弥补传统通用软件的不足。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够减少工作周期、提高工作效率的单分子荧光散焦图像处理方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种单分子荧光散焦图像处理方法，其特征在于，包括以下步骤：对薄膜样品中所有荧光分子的按曝光时间形成的散焦图像序列进行灰度化处理，得到薄膜样品中所有荧光分子的灰阶图像序列；对所有荧光分子的灰阶图像序列进行图像切割处理，得到每一荧光分子的灰阶图像序列；对每一荧光分子的灰阶图像序列依次进行去噪声和图像复原处理；对处理后的每一荧光分子的灰阶图像序列进行图像分割处理，得到每一荧光分子的二值图像序列；将每一荧光分子的二值图像序列分别转化为一个椭圆，将每一椭圆的长轴与水平线的夹角作为该荧光分子在相应曝光时间所对应的转动角度；根据每一荧光分子的转动角度和每帧散焦图像的曝光时间，得到每一荧光分子随时间转动的随机信号序列，并对每一随机信号序列作快速傅里叶变换，得到每一荧光分子的功率谱密度。
进一步，荧光分子的按曝光时间形成的散焦图像序列获取，包括以下步骤：激光激发放置在单分子荧光散焦显微镜上的荧光标记的薄膜样品，获取经激发产生的荧光信号；对荧光信号通过单分子荧光散焦显微镜进行散焦成像，得到薄膜样品中进行荧光标记的所有荧光分子按曝光时间形成的散焦图像序列。
进一步，激光激发放置在单分子荧光散焦显微镜上的荧光标记的薄膜样品，获取经激发产生的荧光信号，具体为：搭建单分子荧光散焦显微镜，其中，单分子荧光散焦显微镜包括奥林巴斯倒置显微镜、格兰泰勒棱镜、λ/4波片和二向色镜，奥林巴斯倒置显微镜的工作模式采用全内反射成像模式；设定奥林巴斯倒置显微镜的全内反射成像模式参数；将薄膜样品放置在奥林巴斯倒置显微镜的盖玻片上，通过奥林巴斯倒置显微镜的热台对薄膜样品进行控温，同时，通过奥林巴斯倒置显微镜的物镜加热套对物镜进行同步加热；激光通过格兰泰勒棱镜和λ/4波片转变为圆偏振光发射到二向色镜，经二向色镜出射的光发射到物镜聚焦薄膜样品，薄膜样品中的荧光分子经激发产生荧光信号。
进一步，对荧光信号通过单分子荧光散焦显微镜进行散焦成像，得到薄膜样品中进行荧光标记的所有荧光分子按曝光时间形成的散焦图像序列，具体为：薄膜样品中所有荧光分子经激发产生的荧光信号依次经物镜、二向色镜和高通滤光片发射到电荷藕合器件图像传感器；根据设定的全内反射成像模式参数，电荷藕合器件图像传感器对荧光信号进行散焦成像，得到薄膜样品中所有荧光分子按曝光时间形成的散焦图像序列。
进一步，全内反射成像模式参数包括过焦距离、每帧散焦图像的曝光时间和连续拍摄图像的数量。
进一步，对每一荧光分子的灰阶图像序列进行去噪声处理采用滤波。
进一步，对每一荧光分子的灰阶图像序列进行图像复原处理采用维纳滤波。
进一步，对处理后的每一荧光分子的灰阶图像序列进行图像分割处理采用大津法。
进一步，将每一荧光分子的二值图像序列分别转化为一个椭圆采用区域子描述方法。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、和传统的方法相比，本发明可以将图像处理结果继续操作，对信号作快速傅里叶变换，这大大减少了工作周期、提高了工作效率，MATLAB软件与外部文件的友好交互，也使得结果更加快速地输出。将图像处理部分和频谱分析部分集成在一起，一次分析即能够输出荧光分子的转动角度和功率谱密度。随着工作效率的提升，有利于获取更多荧光分子的信息，为分析多个条件下荧光分子的功率谱密度创造了条件，为探索高分子玻璃化转变这个科学难题提供了一个新的方法。2、本发明基于奥林巴斯倒置显微镜搭建了一个单分子荧光散焦显微镜，通过单分子荧光散焦显微镜得到薄膜样品的散焦图像序列，薄膜样品上各个方向取向的荧光分子均能通过单分子荧光散焦显微镜得到很好地激发。3、本发明在图像切割步骤对所有荧光分子的灰阶图像序列均采用动态阈值切割法来切割，在图像分割步骤对每一荧光分子的灰阶图像序列均采用大津法来分割，大大提高了图像切割和图像分割的准确度，使得测得的荧光分子的转动角度更加准确，而荧光分子作为一种聚合物内部信息的探针，其转动角度准确度的增加，将使聚合物的结果更加真实可靠。4、本发明还具有多种聚合物薄膜样品中的荧光分子散焦图像的通用性，只要能够散焦成像的图像均可用本发明方法，对于用户而言，原理简单、操作方便、易学即会，且具有成本低的特点，可以广泛应用于荧光图像处理技术领域中。
附图说明
图1为本发明中单分子荧光散焦显微镜的结构示意图；
图2为本发明中散焦图像序列的一帧图像的示意图；
图3为本发明中四臂星形PnBMA末端荧光标记薄膜的荧光分子转动角度的随时间变化曲线图；
图4为对图3中的转动角度作快速傅里叶变换得到的功率谱密度的随频率变化曲线图；
图5为本发明中线形PnBMA中心荧光标记薄膜的荧光分子转动角度的随时间变化曲线图；
图6为对图5中的转动角度作快速傅里叶变换得到的功率谱密度是随频率变化曲线图。
具体实施方式
以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。
本发明提供的单分子荧光散焦图像处理方法，包括以下步骤：
1)如图1所示，激光1激发放置在单分子荧光散焦显微镜3上的荧光标记的薄膜样品2，获取经激发1产生的荧光信号，具体为：
1.1)搭建单分子荧光散焦显微镜3，其中，单分子荧光散焦显微镜3包括奥林巴斯倒置显微镜、格兰泰勒棱镜4、λ/4波片5和二向色镜6，奥林巴斯倒置显微镜上设置有盖玻片7、物镜8、高通滤光片9、电荷藕合器件图像传感器10、热台和物镜加热套等，物镜8采用高数值孔径的物镜，奥林巴斯倒置显微镜的工作模式采用全内反射成像模式。
1.2)设定奥林巴斯倒置显微镜的全内反射成像模式参数，其中，全内反射成像模式参数包括过焦距离、每帧散焦图像的曝光时间和连续拍摄图像的数量等。
1.3)将薄膜样品2放置在盖玻片7上，通过热台对薄膜样品2进行控温，同时，通过物镜加热套对物镜8进行同步加热，以保证薄膜样品2温度的均一。
1.4)波长为532nm的激光1通过格兰泰勒棱镜4和λ/4波片5转变为圆偏振光，发射到二向色镜6，经二向色镜6出射的光发射到物镜8聚焦薄膜样品2，薄膜样品2中的荧光分子经激发产生荧光信号。
2)对荧光信号通过单分子荧光散焦显微镜3进行散焦成像，得到薄膜样品2中进行荧光标记的所有荧光分子按曝光时间形成的散焦图像序列，具体为：
2.1)薄膜样品2中所有荧光分子经激发产生的荧光信号依次经物镜8、二向色镜6和高通滤光片9发射到电荷藕合器件图像传感器10，其中，高通滤光片9为532nm高通滤光片。
2.2)根据设定的全内反射成像模式参数，电荷藕合器件图像传感器10对荧光信号进行散焦成像，得到薄膜样品2中所有荧光分子按曝光时间形成的散焦图像序列。
3)将薄膜样品2中所有荧光分子的按曝光时间形成的散焦图像序列读入MATLAB软件中，并进行灰度化处理，得到薄膜样品中所有荧光分子的灰阶图像序列，以便后续操作。
4)采用动态阈值切割法，对薄膜样品中所有荧光分子的灰阶图像序列进行图像切割处理，得到每一荧光分子的灰阶图像序列，其中，动态阈值分割法为现有技术中公开的方法，具体过程在此不多做赘述，由于玻璃态体系下荧光分子只有转动扩散，没有平动扩散，在此条件下为一次切割一个分子提供了很大的便利。
5)对每一荧光分子的灰阶图像序列依次进行去噪声和图像复原处理，得到处理后的每一荧光分子的清晰的灰阶图像序列，其中，去噪声处理采用滤波，图像复原处理采用维纳滤波，维纳滤波的大小系数可以根据实际应用时的灰阶图像来决定。
6)采用大津法，对处理后的每一荧光分子的清晰的灰阶图像序列进行图像分割处理，得到每一荧光分子的二值图像序列，其中，大津法均为现有技术中公开的方法，具体过程在此不多做赘述。
7)采用区域子描述方法，将每一荧光分子的二值图像序列分别转化为一个椭圆，并将每一椭圆的长轴与水平线的夹角作为该荧光分子在相应曝光时间所对应的转动角度，其中，区域子描述为现有技术中公开的形状描述方法，具体过程在此不多做赘述。
8)根据每一荧光分子的转动角度和每帧散焦图像的曝光时间，得到每一荧光分子随时间转动的随机信号序列，并对每一随机信号序列作快速傅里叶变换，得到每一荧光分子的功率谱密度，其中，对随机信号序列作快速傅里叶变换可以采用现有技术公开的处理方法，具体过程在此不多做赘述。
在一个优选的实施例中，MATLAB软件的运行环境为window系统，在其他系统如Linux或Mac系统下，修改相应的代码即可运行。
下面通过具体实施例详细说明本发明单分子荧光散焦图像处理方法。
实施例1：星形聚合物的单分子荧光散焦图像处理
将四臂星形PnBMA(聚甲基丙烯酸正丁酯)末端荧光标记薄膜放置在单分子荧光散焦显微镜3上，设定过焦距离为0.6微米，每帧散焦图像的曝光时间为0.5秒，连续拍摄时长为200秒，得到的散焦图像序列中的一帧如图2所示。
采用本发明的方法对四臂星形PnBMA末端荧光标记薄膜的散焦图像序列进行处理，随机挑选出一个荧光分子，该条件下荧光分子的转动角度随时间变化的曲线如图3所示，该条件下荧光分子的功率谱密度随频率变化的曲线如图4所示，其中，图3中的横轴表示曝光时间，间隔0.5秒，纵轴表示荧光分子在平面内的转动角度，图4中的坐标均为对数坐标，横轴表示频率，纵轴表示功率谱密度。
实施例2：线形聚合物的单分子荧光散焦图像处理
将线形PnBMA中心荧光标记薄膜放置在单分子荧光散焦显微镜上，设定过焦距离为0.6微米，每帧散焦图像的曝光时间为0.5秒，连续拍摄时长为200秒，得到400帧散焦图像。
采用本发明的方法对线形PnBMA中心荧光标记薄膜的散焦图像序列进行处理，随机挑选一个荧光分子，该条件下荧光分子的转动角度随时间变化的曲线如图5所示，该条件下荧光分子的功率谱密度随频率变化的曲线如图6所示，其中，图5中的横轴表示曝光时间，间隔0.5秒，纵轴表示荧光分子在平面内的转动角度，图6中的坐标均为对数坐标，横轴表示频率，纵轴表示功率谱密度。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。