一种评估疾病遗传风险的基因检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种评估疾病遗传风险的基因检测方 法，该方法用于评估个体将来患某种或某些疾病的概率。
【背景技术】
[0002] 基因检测风险评估是指我们通过分子生物学手段破译人体携带的基因密码，从而 预测个体将来患某种或某些疾病的概率。简单的说所谓基因检测，就是取被检测者的一滴 血、口腔黏膜或其它组织细胞，经提取和扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞 中的DNA分子等基因信息作检测，分析其所含有的各种疾病易感基因的情况，从而使人们能 及时了解自己的基因信息，预测身体患疾病的风险。
[0003] 癌症及某些疾病的发生，是环境因素和遗传因素共同作用的结果，不同的疾病类 型受到不同程度遗传因素和环境因素的影响，例如肺癌的发生受到环境因素影响比较大， 吸烟的人容易得肺癌，然而不是所有吸烟的人都会得肺癌，而是特定基因发生变异的人群 容易患病。又如乳腺癌的发生，与遗传因素影响较大，BRCA1或BRCA2基因特定位点突变的人 容易发生乳腺癌。有些癌症的发生也与人群有关，如白种人比黄种人得黑色素瘤的风险要 高很多，文献报道，ALDH2突变者过度饮酒更容易患上食管癌。因此探究我们遗传基因的变 异程度，可以指导我们对疾病的早期预防，通过自主调整对环境因素的应对措施来极大程 度地避免这些遗传性疾病的发生。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种基于遗传物质的信息评估疾病遗传风险的基因检测 方法，采用基因测序的方法获得遗传物质的信息，并通过构建数学模型获得基因序列与疾 病遗传风险的关联关系，实现基于遗传物质信息对疾病遗传风险的评估。
[0005] 我们根据肿瘤细胞的特征并结合大量文献，总结了 57种肿瘤相关的易感基因见表 1〇
[0006] 表1 57个肿瘤相关基因
[0007]
[0010]
[0011] 在上述57个基因中，针对每种不同的疾病有不同的基因类型在起作用。而对于每 个起作用的基因来说，其对疾病发生的影响是由其上面的关键位点的情况所决定。
[0012] 根据人类基因组序列(HG19)设计多重PCR引物。通过分子生物学方法获得被测个 体的上述基因序列，检测序列中的每个突变位点。这些突变包括:编码区的同义突变、移码 突变、错译突变;非编码区的MNV(multiple nucleotide variation，多核苷酸位点突变）、 INDEL(Insert and Delete，插入缺失）、SNV(single nucleotide variation，单核苷酸位 点突变）。
[0013] 首先，根据下述公式估算影响蛋白质序列变化的突变在人群中出现的频率coef:
[0014]
[0015] 其中，maf(Minor Allele Frequency)表示最小等位基因频率;phylop是序列保守 性预测值，用于评估所得可疑致病突变的保守性。（这两个参数均由iron reporter服务器 自动计算）
[0016] maf值为0到0.5，值越大，表明这种突变出现的就越多，在进化上讲就说明危害较 小;phy 1 op的范围是[-14-14 ]，数值越小，表明该位点越保守，在进化上讲，这些位点的突变 危害越大；另外，一般来讲杂合子比纯合子有更多的杂交优势，所以对于杂合子这个系数再 乘以0.5。
[0017] 根据上述频率coef，计算序列中发生突变的每个位点引起疾病的概率值harm。当 突变是同义突变时，harm=coef X0;当突变是移码突变时，harm = coef X0.5;当所述突变 是错译突变时，harm = coef X 0.3;当所述突变是发生在非编码区的MNV或INDEL时，harm = coef X 0.1;当所述突变是发生在非编码区的SNV时，harm = coef X 0.05。
[0018] 根据一个基因所有发生突变的位点的harm值算出该基因的健康概率值health:
[0019]
[0020] 其中，η表示每个基因上发生突变的位点个数。
[0021] 由于一种疾病是由多种基因来控制的，这里我们假设每种基因对于疾病的影响是 相互独立的。根据所述基因的健康概率值health计算与所述基因相关的疾病遗传风险值 risk：
[0022]
[0023] 其中，m表示决定一种疾病的基因个数。
[0024] 这样，疾病的得病风险就可以通过高通量测序分析出的基因突变位点来评估。
【具体实施方式】
[0025] 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段，以下结合较佳实 施例，对依据本发明提出的一种评估疾病遗传风险的基因检测方法的【具体实施方式】、步骤、 特征及通过其获得的结果，详细说明如后。
[0026] -.样本米集
[0027] 采集的样本信息如下表：
[0028]
[0029] 样本采集方法采用口腔拭子采集口腔脱落细胞，具体方法如下：
[0030] 1.取样前准备
[0031] (1)取样前30分钟内禁止进食、吸烟和饮酒。
[0032] (2)取样前5分钟，准备清水，一次饮入约30ml，充分洗漱口腔8-12秒，吐出。
[0033] (3)按照上步，再洗漱口腔2次。
[0034] (4)采集人员取样前需洗净双手。
[0035] 2.取样操作
[0036] (1)旋开口腔拭子柄部外盖，从管中小心抽出口腔拭子，避免手触及拭子头部。
[0037] (2)用手按住左侧脸颊，握住手柄，将拭子伸入口腔左侧，用拭子头部充分接触左 侧口腔内壁粘膜，在左侧上下牙床咬合部位用力上下擦拭，同时旋转拭子，使拭子头部均匀 接触口腔粘膜，重复此动作1分钟。擦拭力度等同刷牙力度。采样后将拭子插回套管拧紧。
[0038] (3)用第二支口腔拭子按照上步相同方法采集右侧口腔内壁脱落细胞。
[0039] (4)用剩余两支口腔拭子按（2)、（3)步骤再次分别采集左右两侧口腔内壁脱落细 胞。
[0040] (5)取样后将采集完毕的所有口腔拭子管放回样本盒原处。
[0041] 二.DNA提取流程
[0042] (1)样本(棉拭子）的预处理:双手戴上手套，从冰箱取出样本，检查样本是否合格 并核对编号，做好记录。从样本盒中取出两支依次置于试管架上，做好标记，放于超净台上。 [0043] (2)取一定数量的2ml离心管，对应样本依次编号后置于离心管架上，放入超净台 上备用。
[0044] (3)打开2ml离心管管盖，用剪刀将棉签部分从杆上剪下，加入400μ1的生理盐水， 盖上盖子静置5min〇
[0045] (4)打开盖子，加入20μ1的蛋白酶K，再加入400μ1 buffer AL。
[0046] (5)将离心管盖好，在涡旋振荡器上适度振荡，简短离心去除管盖上的液滴。
[0047] (6)将恒温金属浴设定在56°C，温浴10分钟，时间到后取出简短离心去除管盖上的 液滴。
[0048] (7)打开离心管的盖子，加入400μ1无水乙醇，盖上盖子，在涡旋振荡器上适度振 荡，简短尚心去除管盖上的液滴。
[0049] (8)准备一定数量的QIAamp离心柱（已套在2ml收集管内），对应样本依次编号后置 于离心管架上，打开离心柱的盖子，取上一步的样品600μ1转移到离心柱中，盖好盖子，置于 离心机中，配平后进行离心，6000g离心lmin。
[0050] (9)离心完毕后，取出离心柱与收集管，将离心柱置于一个干净的2ml收集管中，将 原来的收集管弃掉。
[0051 ] (10)将2ml离心管中剩余的样品转移到QIAamp离心柱中，重复前两步操作。
[0052] (11)小心打开离心柱盖，加入500μ1 buffer AW1到离心柱中，小心盖上盖子，置于 离心机中，配平后进行离心，6000g离心lmin。
[0053] (12)离心完毕后，取出离心柱与收集管，弃掉收集管中的废液。
[0054] (13)小心打开离心柱盖，加入500μ1 buffer AW2到离心柱中，小心盖上盖子，置于 离心机中，配平后进行离心，20000g离心3min。
[0055] (14)离心完毕后，取出离心柱与收集管，弃掉收集管中的废液。
[0056] (15)准备一定数量的1.5ml离心管，对应样本依次编号后置于离心管架上，放入 超净台上，将离心柱对应编号依次置于1.5ml离心管中，弃掉装有离心废液的旧收集管。打 开离心柱的盖子，于超净台上晾干5min。
[0057] (16)加入70μ1 buffer AE，枪头不要接触滤膜且尽量使液体均匀铺在滤膜上。盖 上盖子，室温静置5min。置于离心机中，配平后进行离心，6000g离心lmin。
[0058] (17)离心完毕后，取出离心柱与收集管，右手使用移液器将1.5ml管中的液体吸出 再次垂直加入离心柱中进行二次洗脱，盖上盖子，室温静置5min。置于离心机中，配平后进 行离心，6000g离心lmin。
[0059] (18)离心完毕后，取出离心柱与收集管，弃掉离心柱，盖上盖子，进行浓度测定。
[0060] 根据上述步骤，测得的三个样本的DNA浓度如下： ΓηηΑ?1
[0062] ~三.引物设计 '
' ' '
[0063] 利用https :// www.ampliseq.com/网站的在线多重引物设计工具设计多重PCR引 物：设计名称命名为tumor gene