用于生物荧光芯片的自动对焦方法与流程

本发明涉及生物成像领域，特别涉及一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法。
背景技术：
：数字聚合酶链反应(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)是一种测量靶dna绝对拷贝数的独特方法，是一种绝对定量技术，最早由saiki等发表在文章里，与实时荧光定量pcr(real-timequantitativepcrdetectingsyste,即qpcr)相比，dpcr已被证明具有更高的灵敏度，精度及重复性。从扩增后的dpcr芯片中获取到有用的信息依赖于dpcr检测分析系统，如进行无创产前检测，人类乳腺癌中her2癌基因的检测等。目前，dpcr荧光信息的检测方式主要包括两种：一是荧光成像，二是流式细胞荧光分选。荧光成像技术随着相机成像技术的发展，其成像速度越来越快，分辨率也越来越高，这种成像方式在显微成像中得到越来越广泛的应用。而相机成像存在失焦的问题，特别是像dpcr这样，需要通过处理得到的图像数据来获得生物信息数据，若图像离焦问题严重，则会影响统计数据的准确性。不同样本之间垂直位置的差异性，导致相机获得的图像呈现不同程度的模糊，因此，对焦在光学视觉成像系统中起着重要作用，例如各类相机，扫描仪，显微镜。而自动对焦优势体现在：可以在最少的人工干预下获得清晰图像，进而获得准确的统计数据。为了快速获取清晰的图像以便于后续数据处理得到准确的检测结果，必须根据样品变化动态的改变样品与物镜或物镜与成像面之间的距离，以实现样品的自动对焦。自动对焦可以通过主动、被动或者两者混合来实现。主动方法一般是通过激光等测距工具来测量离焦距离后进行对焦。主动方法需要在系统中额外嵌入测距系统，并且当使用激光时，会造成基因芯片上的荧光基团淬灭，对后续数据的准确性造成影响。被动方法可以分为相位检测法和对比度检测法，前者通过测量两幅图像之间的相位差来估计聚焦位置，依赖于特殊的传感器检测系统；后者计算每一帧的清晰度以寻找最佳位置，无需额外检测附件，精简整体系统，降低成本，但搜索每一帧并计算，明显增加了计算量和搜索步骤，造成对焦时间延长。微孔式数字pcr芯片面积大，通量高，弱荧光样本分布差异造成其计算对象存在片内差异与片间差异，若对焦方法不当，荧光基团长时间暴露在激发光下会发生淬灭，会影响后续结果统计。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法。考虑到微孔式数字pcr芯片面积大，通量高，弱荧光样本分布差异造成其计算对象存在片内差异与片间差异，若对焦方法不当，荧光基团长时间暴露在激发光下会发生淬灭，影响后续结果统计,为了实现快速准确对焦，本发明基于dpcr芯片多个排列孔的特征，提出了一种新的对焦算法，单曲线拟合函数法，通过计算包含单个孔的区域内大于阈值的像素的个数，得到随离焦距离变化，该区域内大于阈值的像素数变化曲线。在这里，阈值随图像平均灰度的变化而变化，从而得到一条与图像灰度无关的像素数随离焦距离变化曲线，通过正弦函数拟合得到该曲线的拟合函数，即为微孔式dpcr芯片的对焦评价算法。通过该对焦算法，可以快速的得到离焦图像的离焦距离与离焦方向，进而快速而准确的完成对焦。本发明采用的技术方案是：一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法，包括以下步骤：1)取相，选择一个窗口区域的图像；2)依据当前窗口区域的图像的亮度自适应选择当前窗口区域的图像的阈值t；3)获取一个窗口区域的图像内大于阈值的像素数随离焦距离变化的拟合曲线；4)计算当前窗口区域的图像内大于阈值t的像素数，再根据拟合曲线计算出当前窗口的离焦距离和离焦方向；5)调整样品和物镜之间的距离，进行对焦，若当前窗口区域无法完成对焦，则回到所述步骤1)，选择与当前窗口区域不完全重合的另一个窗口区域，循环执行，直至完成对焦。优选的是，所述步骤2)中依据亮度的最值选择阈值t的方法，具体按以下公式：t＝{max(iout(x,y,zr))+min(iout(x,y,zr))}/n(1)；其中，max(iout(x,y,zr))和min(iout(x,y,zr))分别表示当前窗口区域内图像的最大灰度值和最小灰度值，zr表示当前样品与物镜之间的距离，n表示求解系数。优选的是，所述步骤3)中通过对不同芯片对焦窗口中不同灰度级像素的数量进行统计得到三组统计数据，在同一图中做出像素数量随离焦距离的变化散点图，得到拟合曲线，表示为：其中，f1表示窗口区域内的像素的总数量，d表示离焦距离，k1、k2表示离焦区间的上下两个极限位置，均为常数，且k1<k2；a1、a2、a3、a4、b1、b2、b3、b4、c1、c2、c3、c4均为常数。优选的是，所述步骤4)根据拟合曲线计算出当前窗口的离焦距离和离焦方向的方法具体包括以下步骤：4-1)将样品向上移动，由下至上在间距为δd的三个位置依次取图像，依次为第一取相位置、第二取相位置、第三取相位置，计算三个取相位置获得的图像中大于阈值t的像素数分别为：f1(d)、f2(d)和f3(d)，通过上述公式(2)反推计算得到三个取相位置的离焦距离分别为(d1,d2)、(d1’,d2’)、(d1”,d2”)，其中，d1、d1’、d1”表示在负半轴的取值，d2、d2’、d2”表示在正半轴的取值；4-2)根据f1(d)、f2(d)和f3(d)的大小排序来选择样品的调焦距离和方向，具体包括以下几种情况：ⅰ.若f1(d)>f2(d)>f3(d)，则说明第一取相位置和第二取相位置位于焦点下方，选取d2和d2'，此时样品处于第三取相位置；调焦方法为：以第二取相位置为基准，将样品先下移δd，回到第二取相位置，然后再上移d2'；ⅱ.若f1(d)>f3(d)>f2(d)或f3(d)>f1(d)>f2(d)，则说明第一取相位置位于焦点下方，第三取相位置位于焦点上方；调焦方法为：以第三取相位置为基准，将样品下移d1”；ⅲ.若f3(d)>f2(d)>f1(d)，则说明第二、第三取相位置均位于焦点上方；调焦方法为：以第三取相点位基准，将样品下移d1”。优选的是，其中，若f1(d)，f2(d)，f3(d)中存在大于f1-m的点，则先运动到既定的初始基准位置，再进行步骤4-1)和4-2)，其中，m为常数，初始基准位置处于k1和k2之间。优选的是，其中，f1＝169，k1＝-122，k2＝115，δd＝20，m＝4。优选的是，所述用于生物荧光芯片的自动对焦方法，包括以下步骤：1)取相，选择一个窗口区域的图像：截取视觉中心p1×p1像素的区域；寻找截取图像中与边沿相差q个像素点的第一个质心点；以第一个质心点为中心截取周围p2×p2像素的区域，作为选择得到的当前窗口区域图像；2)依据当前窗口区域图像的亮度自适应选择当前窗口区域的图像的阈值t；3)获取一个窗口区域的图像内大于阈值的像素数随离焦距离变化的拟合曲线；4)计算当前窗口区域图像内大于阈值t的像素数，再根据拟合曲线计算出当前窗口的离焦距离和离焦方向；5)调整样品和物镜之间的距离，进行对焦，若当前窗口区域图像无法完成对焦，则回到所述步骤1)，选择与当前窗口区域不完全重合的另一个窗口区域，循环执行，直至完成对焦。优选的是，其中，p1＝31，q＝6，p2＝13。本发明的有益效果是：本发明可以快速的得到离焦图像的离焦距离与离焦方向，进而快速而准确的完成对焦；本发明提供了一种微孔式数字pcr芯片的自适应窗口选择法：根据微孔式pcr芯片的微孔及排列特征自适应的选择及调整窗口位置，以保证对焦对象及其边界区域位于对焦窗口内；本发明提供了一种微孔式数字pcr芯片的自适应阈值选择法：根据对焦对象亮度的高低自适应的调整阈值，变化的阈值给后续不同亮度的样本在其对焦曲线的一致性上奠定了基础。本发明提供了一种微孔式数字pcr芯片的自动对焦算法：本发明在上述窗口和阈值的选择条件下，得出了微孔式数字pcr芯片荧光图像随离焦距离的变化，其大于阈值的像素数的变化曲线及其分段函数，根据分段函数及方向判别方法，只需3个位置的荧光图像，即可得出离焦距离和离焦方向，再需一步即可完成对焦，整个过程仅需4步完成对焦。附图说明图1为本发明用于生物荧光芯片的自动对焦方法的整体流程图；图2为微孔式数字pcr芯片荧光成像图及部分放大图；图3为本发明的窗口的自适应选择的流程图；图4为本发明的阈值选择示意图；图5为本发明中图像清晰度随位置变化的示意图；图6为大于阈值的像素数随离焦距离变化散点图及分段拟合曲线；图7为本发明的取相位置示意图；图8为本发明的样本1的对焦前后对照图像；图9为本发明的样本2的对焦前后对照图像；图10为本发明的样本3的对焦前后对照图像。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本发明目的在于实现大面积、高通量生物荧光芯片，如微孔式pcr荧光芯片的快速准确自动对焦。本发明一是选择单孔及其附近区域作为对焦窗口，在保证对焦对象存在于对焦窗口的同时，最大可能的减少了计算量，降低了计算复杂度，且通过自适应选取窗口。二是阈值是根据样品荧光亮度本身的最大值与最小值计算所得，在不抛弃样品本身的特征的同时得到一个具有普适性的阈值计算方法。三是根据光学成像特点及样本成像随离焦距离的变化得到一个窗口内大于阈值的像素数随离焦距离变化曲线及分段拟合函数。需要理解的是，本发明的方法的对焦对象可以但不仅限于微孔式数字pcr芯片，对于其它样本，若几何特征不变，均可使用该方法对焦，因此也应当在本发明的保护范围内。以下以用于微孔式数字pcr芯片进行具体说明。参照图1，本发明的总体思路为：(1)自适应窗口选取；(2)自适应阈值选取；(3)计算离焦距离和离焦方向；(4)实现样本对焦。更为具体的，本实施例的一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法，包括以下步骤：1)取相，选择一个窗口区域的图像；2)依据当前窗口区域的图像的亮度自适应选择当前窗口区域的图像的阈值t；3)获取一个窗口区域的图像内大于阈值的像素数随离焦距离变化的拟合曲线；4)计算当前窗口区域的图像内大于阈值t的像素数，再根据拟合曲线计算出当前窗口的离焦距离和离焦方向；5)调整样品和物镜之间的距离，进行对焦，若当前窗口区域无法完成对焦，则回到所述步骤1)，选择与当前窗口区域不完全重合的另一个窗口区域，循环执行，直至完成对焦。其中，自适应窗口选取体现为：步骤5)中若当前窗口区域无法完成对焦，则回到所述步骤1)，选择另一个窗口。其中，自适应阈值选取体现为：步骤2)中当前窗口区域的图像的阈值t依据图像的亮度自适应选择。一、对于对焦窗口的选择对焦窗口要尽可能的包含所对焦对象同时尽可能减少背景。本发明针对的对焦对象为微孔式数字pcr芯片，参照图2，微孔式数字pcr芯片上规则排列的微孔，使用时，将稀释的dpcr样本溶液分割，一部分微孔内填充有dna样本，引物及特异性的荧光探针，dna每扩增一条dna链，就有一个荧光分子的产生。经过热循环的芯片在激光激发的作用下，荧光分子累积的孔呈现高亮度，其他孔亮度无较大区别，其芯片内灰度差异的存在及芯片间灰度差异的存在，使得传统的根据像素灰度梯度差来评价离焦量的自动对焦体系出现了片内差异及片间差异，这就要求其计算窗口尽可能的大以减少这种误差，进而增加了计算量。本发明中窗口选择为单孔及其附近区域，包含对焦对象的单元特征，同时又体现边缘变化现象。且本发明在对焦过程中不断优化窗口选择，考虑到单孔的位置随离焦距离的改变会发生变化，对焦过程中的窗口选择也会随之自适应改变。参照附图3，对于窗口的自适应选择的具体描述为：1)取相，选择一个窗口区域的图像：截取视觉中心31×31像素的区域；寻找截取图像中与边沿相差6个像素点的第一个质心点；以第一个质心点为中心截取周围13×13像素的区域，作为选择得到的当前窗口区域图像；2)依据当前窗口区域图像的亮度自适应选择当前窗口区域的图像的阈值t；3)获取一个窗口区域的图像内大于阈值的像素数随离焦距离变化的拟合曲线；4)计算当前窗口区域图像内大于阈值t的像素数(评价值)，再根据拟合曲线计算出当前窗口的离焦距离和离焦方向；5)调整样品和物镜之间的距离，进行对焦，若完成对焦则结束；若当前窗口区域图像无法完成对焦，则回到所述步骤1)，选择与当前窗口区域不完全重合的另一个窗口区域，循环执行，直至完成对焦。二、对于自适应阈值选取阈值的选取关系到对焦准确度，同时又要随样本的改变而自动变化，才能达到自动准确对焦的目的。本发明中，根据对焦对象的特征提出了基于最值的自动阈值选取方法，在跟随样本变化的同时，能够做到准确对焦。如图4，为一张样本芯片在对焦窗口内的最值变化曲线。在对焦区域内，根据区域内的最大值与最小值变化曲线可知，其最值的和在一定范围内呈现一个稳定的值，这个稳定的值除以一个系数，即为所取阈值，具体按以下公式：t＝{max(iout(x,y,zr))+min(iout(x,y,zr))}/n(1)；其中，max(iout(x,y,zr))和min(iout(x,y,zr))分别表示当前窗口区域内图像的最大灰度值和最小灰度值，zr表示当前样品与物镜之间的距离，n表示求解系数。本发明提供了一个具有普适性的阈值选取办法，同时为下面的离焦距离和离焦方向的计算奠定了基础。三、对于离焦距离和离焦方向的计算依据对焦窗口的选取及阈值的选取，通过统计对焦窗口内大于阈值像素点数量的变化，得到对焦评价曲线。在离焦到正焦再到离焦的序列图像中，图像的离焦量越小，弥散斑半径越小，亮度越集中，大于某一阈值的像素数量值达到最小，如附图5所示，a,b,c三点对应着a,b,c三幅图像，其中a点距离焦点最远，b点位于准焦点，c点距离焦点较近，在图像中呈现出不同的清晰度，孔与孔之间的分割界限呈现不同的是清晰度，当所获样本图像呈现图b所示孔与孔之间分割较为明显的特征时，是所需的样本图像。清晰的样本图像为后续的生物信息统计提供原始而准确的信息。传统的搜索方法通常根据一些自定义的规则来寻找最高峰，本发明中通过对不同芯片对焦窗口中不同灰度级像素的数量进行统计得到三组统计数据，在同一图中做出像素数量随离焦距离的变化散点图及其拟合曲线，如附图6所示。3组数据中，像素数量随离焦距离的变化趋势主要表现为2个特征，一是在一定离焦距离范围内，对于不同灰度的样本芯片，其像素数随离焦距离的变化趋势呈现高度的一致性，经过各种拟合测试，发现拟合曲线符合高阶半周期正弦曲线的变化特征；二是，在上述离焦距离范围之外，对于不同灰度的样本芯片，其像素数量稳定在＝169，即对焦窗口所包含的总的像素数，这两个特征符合光学成像原理所述的弥散斑半径及亮度分布特征，可用分段函数表示为：其中，f1表示窗口区域内的像素的总数量，d表示离焦距离，k1、k2表示离焦区间的上下两个极限位置，均为常数，且k1<k2；a1、a2、a3、a4、b1、b2、b3、b4、c1、c2、c3、c4均为常数。在本实施例中，f1＝169，k1＝-122，k2＝115。在这里，曲线的d、f取值只与离焦距离、大于阈值的像素数有关，在窗口和阈值确定的条件下，可认为曲线的变化特征唯一确定，因此，在计算得出大于阈值的像素数后，可根据拟合曲线来计算离焦距离与方向。根据像素数反推出的数字的绝对值代表离焦距离，正负代表方向，为正时，代表取相位置在准焦点位置的下方，应向上运动；为负时，代表取相位置在准焦点位置的上方，应向下运动。考虑到已知y轴坐标求x时的解是双解，需要判断取相位置来判断取何解。本实施例中，所述步骤4)根据拟合曲线计算出当前窗口的离焦距离和离焦方向的方法具体包括以下步骤：4-1)将样品向上移动，由下至上在间距为δd的三个位置依次取图像，依次为第一取相位置、第二取相位置、第三取相位置(图中标示为1、2、3)，计算三个取相位置获得的图像中大于阈值t的像素数分别为：f1(d)、f2(d)和f3(d)，通过上述公式(2)反推计算得到三个取相位置的离焦距离分别为(d1,d2)、(d1’,d2’)、(d1”,d2”)，其中，d1、d1’、d1”表示在负半轴的取值，d2、d2’、d2”表示在正半轴的取值；4-2)根据f1(d)、f2(d)和f3(d)的大小排序来选择样品的调焦距离和方向，具体包括以下几种情况：ⅰ.如图7中的case1，若f1(d)>f2(d)>f3(d)，则说明第一取相位置和第二取相位置位于焦点下方，选取d2和d2'，此时样品处于第三取相位置；调焦方法为：以第二取相位置为基准，将样品先下移δd，回到第二取相位置，然后再上移d2'；ⅱ.若f1(d)>f3(d)>f2(d)，如图7中的case2；或f3(d)>f1(d)>f2(d)，7中的case3，则说明第一取相位置位于焦点下方，第三取相位置位于焦点上方；调焦方法为：以第三取相位置为基准，将样品下移d1”；ⅲ.如图7中的case4，若f3(d)>f2(d)>f1(d)，则说明第二、第三取相位置均位于焦点上方；调焦方法为：以第三取相点位基准，将样品下移d1”。其中，若f1(d)，f2(d)，f3(d)中存在大于f1-m的点，则先运动到既定的初始基准位置，再进行步骤4-1)和4-2)，其中，m为常数，初始基准位置处于k1和k2之间。本实施例中，δd＝20，m＝4四、采用本发明的对焦方法进行离线测试如附图8、9、10，分别为使用该对焦算法对3组新的样本芯片(样本1、2、3)分别选取了3个不同的初始位置进行对焦测试，得到9组数据，附图8、9、10中initial列是芯片位于初始位置时整幅芯片图像及5个区域微观图；autofocus列是对焦后整幅芯片图像及5个区域微观图；focusright是准焦点整幅芯片图像及5个区域的微观图，图中的红色方框代表截取的图像在整幅芯片图像中所处位置。autofocus列的a、b、c三组图像中，孔与孔之间已经可以明显分辨，在预设清晰度条件下，所有对焦测试结果已能满足后续计算要求。样本1、2、3的测试数据如下表1、2、3所示表1样本1的测试数据参数abc平均灰度110.3102.1102.2计算离焦距离63-34-57实际离焦距离57-43-63误差+6+9+6是否满足条件是是是表2样本2的测试数据参数abc平均灰度138.9129.6127.4计算离焦距离63-32-73实际离焦距离62-18-58误差+1-14-15是否满足条件是是是表3样本3的测试数据参数abc平均灰度105.197.596.8计算离焦距离46-21-64实际离焦距离49-31-71误差-3+10+7是否满足条件是是是进一步的实施例中，在同等初始条件下，使用较为准确的混合爬山算法(各类爬山算法的区别主要在于步长与精度的选择上，但是基本思想是相同的)，预设同等对焦精度，测试了混合爬山算法所需要的步骤数，并与本发明提出的方法进行对比。在这里，根据对象创建的搜索条件是，粗搜索步距，20个位置差，较为精细搜索，10个位置差，初始搜索方向定位向上搜索，搜索到峰值即停止搜索，统计传统爬山搜索算法所需步骤数进行统计。而本发明所提方法完成对焦仅需4步，与传统爬山算法相比，步骤数明显减少。同时，爬山完成所需步骤数明显与芯片的初始位置以及初始运动方向的设定有关，当设定初始方向为向上，芯片初始位置位于焦点以下比初始位置位于焦点以上对焦步骤数明显减少，原因是少了第三次取相后的换向过程。另外，若爬山步距设置较小，并且评价函数选取不恰当，搜索过程中很容易陷入局部极值，在未到达峰值点的情况下就退出搜索，对焦过程中断，而本方法不存在这种缺陷。表4为采用本发明的对焦方法与传统爬山搜索算法针对3个样本的对比结果。表4不同对焦方法所需步骤数对比尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。当前第1页12