预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合物的制作方法
【专利说明】预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合 物
[0001] 本申请是国际申请日2007年8月6日、国际申请号PCT/US2007/075292于2009 年2月3日进入中国国家阶段、申请号200780028951. 8、发明名称"预防和/或逆转新发作 自身免疫糖尿病的基于微球的组合物"的申请的分案申请。
[0002] 发明描述
[0003] 本申请要求2006年8月4日提交的美国临时申请No. 60/835, 742和2006年11 月8日提交的美国临时申请No. 60/864, 914的优先权。上述各申请的全部内容在此引入作 为参考。
[0004] 发明背景
[0005] 总的来说，本公开涉及在N0D小鼠中预防和/或逆转自身免疫糖尿病病症的反义 方法。这包括通过注射微球投送AS-寡核苷酸以获得引起负调节活性的治疗效果，具体是 在非肥胖型糖尿病（N0D)小鼠模型中。微球使用完全水性的条件制造，该微球中结合有一 种或多种反义（AS)寡核苷酸。
[0006] 微粒、微球和微囊是固体或半固体的颗粒，其直径小于1毫米，也可以小于100微 米，它们可以由各种不同的材料形成，包括合成聚合物、蛋白和多糖。微球已经被用于许多 不同的应用中，主要是分离、诊断和药物投送。
[0007] 有许多不同的技术可用于从合成聚合物、天然聚合物、蛋白和多糖制造这些颗粒， 包括相分离、溶剂蒸发、乳化和喷雾干燥。一般来说，聚合物形成这些微球的支撑结构，而 目标药物结合在聚合物结构中。用于形成微球的示例性聚合物包括在Ruiz等的美国专 利 No. 5, 213, 812、Reid 等的美国专利 No. 5, 417, 986、Tice 等的美国专利 No. 4, 530, 840、 Tice等的美国专利No. 4, 897, 268、Tice等的美国专利No. 5, 075, 109、Singh等的美国专 利 No. 5, 102, 872、Boyes 等的美国专利 No. 5, 384, 133、Tice 等的美国专利 No. 5, 360, 610、 以及南方研究所（Southern Research Institute)的欧洲专利申请公布No. 248, 531中描 述的乳酸和乙醇酸的均聚物或共聚物（PLGA);在Ilium的美国专利No. 4, 904, 479中描述 的嵌段共聚物例如Tetronic? 908和泊洛沙姆（poloxamer)407 ;以及在Cohen等的美国专 利No. 5, 149, 543中描述的聚磷腈。使用例如这些聚合物生产的微球表现出荷载效率差，通 常仅能在聚合物结构中结合少量百分比的目标药物。因此，为了获得疗效，通常必须施用相 当大量的这些类型的微球。此外，这些聚合物一般是疏水性的，对目标药物的溶解有负性影 响。在这种情况下使用的典型聚合物包括聚乳酸乙醇酸（PLGA)。
[0008] 医疗团体的目标是将核酸投送到动物细胞中以治疗各种疾病，包括糖尿病。在许 多方法中，通过加入转染剂，能够相对有效地将核酸投送到培养细胞中（体外）。此外，在体 内，当给动物投送核酸时，内源核酸酶的存在将导致核酸高速降解。
[0009] 除了保护核酸免受核酸酶消化之外，核酸投送载体还必需表现出低毒性，必须被 细胞有效摄取，并且具有定义明确的、容易制造的配方。临床试验中显示，用于投送的病毒 载体在体内能导致严重的不利、甚至是致命的免疫应答。此外，这种方法有可能在体内有致 突变效应。通过将核酸复合在不同配方的脂质复合物（例如脂质体或阳离子脂质复合物） 中进行投送，可能具有有毒的效应。核酸与各种聚合物或与肽的复合物显示出不一致的结 果，并且这些配方的毒性还没有解决。核酸还已经被包裹在聚合物基质中进行投送，但是在 这些情况下颗粒的粒度范围广，并且治疗性应用的有效性还没有被证实。这些早先的方法 能产生与这里所希望的目标相反的效果，包括免疫系统的刺激。例如，当PLGA被掺入到颗 粒中时，PLGA的存在刺激了免疫系统。
[0010] 因此，对于解决核酸投送中的问题存在着需求，对于微球的开发和制造微球的新 方法有正在发展的需求。关于微球的详细情况，特别是关于它们的制备和性质的详细情 况,可以在Scott等的美国专利No. 6, 458, 387, Woiszwillo等的美国专利No. 6, 268, 053、 No. 6, 090, 925、No. 5, 981，719 和 No. 5, 599, 719, Woiszwillo 的美国专利 No. 5, 578, 709 以 及Brown等的美国申请公布No. 2006/0024240中找到。这些以及所有在本文中指明的参考 文献在此引为参考。
[0011] 发明简沭
[0012] 按照本公开，寡核苷酸作为微球投送。据信这样的投送方法阻止了核酸酶接近微 球内的核酸。进行反义（AS)寡核苷酸的微球投送以诱导树突状细胞耐受，特别是在N0D小 鼠模型中。使用水性条件制造微球，使得反义（AS)寡核苷酸被结合。这些微球用于抑制基 因表达，并用于在N0D小鼠中体内预防和/或逆转自身免疫糖尿病病症。
[0013] 在本公开的一个方面，合成了靶向⑶40、⑶80和⑶86转录物的三种AS-寡核苷 酸，制备了寡核苷酸混合物的水溶液，并与水性聚合物溶液合并。形成含有寡核苷酸的微 球，通过注射将它们投送到N0D小鼠中。
[0014] 在本公开的一个方面，提供了用于在哺乳动物中逆转1型糖尿病的方法，包括施 用微球组合物，其中组合物中的微球含有与选自CD40、CD80和CD86初级转录物的初级转录 物及其组合是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸。该寡核苷酸选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3,或事实上可以是任何其它以⑶40、⑶80和⑶86为靶标的寡核苷酸。
[0015] 本公开的另一个方面涉及保护哺乳动物胰腺P细胞免于自身免疫破坏的方法， 包括在哺乳动物中注射微球组合物，其中组合物中的微球含有与选自⑶40、⑶80和⑶86初 级转录物的初级转录物及其组合是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸。
[0016] 另一个方面是在哺乳动物中减少T细胞介导的胰腺炎症和/或胰腺0细胞死亡 的方法，包括给哺乳动物施用微球组合物，其中组合物中的微球含有与选自⑶40、⑶80和 CD86初级转录物的初级转录物及其组合是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸，其中组合 物以在哺乳动物中有效缓解1型糖尿病症状的量施用。在更加限定的方面，该组合物在1型 糖尿病临床发作之后施用。在备选的方面，该组合物在1型糖尿病临床发作之前施用。在 这些治疗性方面，与施用前哺乳动物的血糖水平相比，组合物的施用使哺乳动物中的血糖 水平归于正常。
[0017] 施用组合物可以再生哺乳动物的0细胞群，或终止0细胞种的进一步恶化，或这 二者。
[0018] 组合物可以以任何形式施用，在某些示例性方面，以注射形式施用。在特定方面， 组合物与胰岛素一起组合施用。在使用组合疗法时，可以在施用微球组合物之前、同时或之 后施用胰岛素。
[0019] 其它方面还涉及在患有新发作或临床前期自身免疫糖尿病的对象中保护剩余的 3细胞团的方法，包括给对象施用含有微球的组合物，该微球中含有与⑶40、⑶80和⑶86 初级转录物是反义的并与它们定向结合的寡核苷酸，其中组合物的施用将哺乳动物的3 细胞团维持在糖尿病发作前存在的细胞团的至少15%。对象可以是人类对象。对象可以 是人类儿童。治疗方法可以包括重复施用组合物，并且重复施用增加了哺乳动物的3细胞 团。
[0020] 在具体定义的方法中，微球的30%以及多达70% w/w是寡核苷酸。这样的组合物 通常可以在微球组合物中含有比例为1:1:1的反义⑶40:反义⑶80:反义⑶86。
[0021] 通过下面的具体说明，本发明的这些以及其它的方面、目标、特点和