3350、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000 等， 以及各种不同分子量的泊洛沙姆例如泊洛沙姆188和Pluronic FI27或Pluronic F68。常 用的聚合物是聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。另一种聚合物是羟乙基淀粉。其它的两亲性聚合物 也可以单独或组合使用。相分离增强剂也可以是非聚合物，例如丙二醇和乙醇的混合物。
[0051] 在典型的实施方案中，可以制备聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇的聚合物溶液， 并与其它溶液合并。加热、冷却、离心和清洗多次提供水性悬浮液，通常被冷冻和冻干，以形 成含有寡核苷酸和聚阳离子的微球的干粉。
[0052] 微球适合通过注射途径体内投送，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、鞘内、硬膜外、 动脉内、关节内等。其它可以实施的投送途径包括例如局部、口、直肠、鼻、肺、阴道、颊、舌 下、经皮、经粘膜、耳或眼内。
[0053] 不受任何具体理论的束缚，据信含有本文例举的反义寡核苷酸的微球下调细胞表 面分子⑶40、⑶80和⑶86。注射微球，据信树突状细胞主动摄取寡核苷酸微球。这些寡核 苷酸抑制了树突状细胞中细胞表面细胞分子CD40、CD80和CD86的表达。在N0D小鼠中，施 用这些开发后的反义寡核苷酸微球，有效地逆转了糖尿病。
[0054] 下面的实施例说明了本公开的某些特点和优点，以对本公开进行进一步的说明。 实施例不应该被视为限制或局限了本发明。
[0055] 实施例1
[0056] 合成了三种靶向⑶40、⑶80和⑶86初级转录物的AS-寡核苷酸。在本实施例中 施用的AS-寡核苷酸序列显示如下，其中星号表示骨架中巯基化的位点：
[0057] Seq ID 1:CD 40-AS:5'-C*AC*AG*C C*GA*GG*C*AA*AGA*C*AC*C A*T*G OAG*GG*C*A-3'
[0058] Seq ID 2:CD80_AS:5'_G*GG*AA*A G*CC*AG*G A*AT*CT*A
[0059] G*AG*CC*A A*TG G*A-3'
[0060] Seq ID 3:CD86-AS:5'-T*GG*GT*G C*TT*COG T*AA*GT*T C*TG*GA*A OAC*G*T*C_3'
[0061] 通过将各含有一种类型寡核苷酸的三种寡核苷酸溶液等份合并，制备寡核苷酸 混合物的水性溶液，形成三种类型寡核苷酸的l〇mg/ml溶液。在去离子水中制备了 10mg/ ml的聚L-赖氨酸? HBr溶液（聚L-赖氨酸? HBr最高为70, 000道尔顿，Bachem，King of Prussia，PA)。将聚L-赖氨酸? HBr以1:1的体积比加入到寡核苷酸溶液中。将混合 物轻柔润旋。以2:1的体积比加入在pH5. 5的1M乙酸钠（Spectrum, Gardena, CA)中含有 12. 5% PVP (聚乙烯吡咯烷酮，40, 000 道尔顿，Spectrum Chemicals, Gardena, CA)和 12. 5% PEG(聚乙二醇，3, 350 道尔顿，Spectrum Chemicals, Gardena, CA)的 25%聚合物溶液，如 下：0. 75mlAS-寡核苷酸，0. 75ml 聚 L-赖氨酸? HBr，3. 0ml PEG/PVP，总体积为 4. 50ml。
[0062] 将批料在70°C温育30分钟，然后冷却到23°C。冷却后，溶液变得浑浊，微球形成。 然后将悬浮液离心，除去过量的PEG/PVP。通过将沉淀重新悬浮在去离子水中来清洗得到的 沉淀，然后离心并除去上清液。清洗步骤重复三次。将水性悬浮液冷冻并冻干，以形成含有 寡核苷酸和聚L-赖氨酸的微球的干粉。
[0063] 图la和b显示了两种不同放大倍数的1:1比例的聚L-赖氨酸：寡核苷酸微球的 代表性扫描电镜照片（SEM)。制造了 0. 5-4 ii m大小、平均粒度大约2. 5 ii m的微球。图2a 显示了通过激光散射揭示的按照本公开制造的一种微球制剂的大小分布。图2b显示了通 过光散射测定的微球制剂表面电荷（〖电势）。图3显示了在微球分解后用于定量反义寡 核苷酸组分的载量和评估其完整性的反相（RP)HPLC方法。使用⑶86、⑶40、⑶80寡核苷 酸和聚L-赖氨酸（PLL;MW 30-70kD)来配制微球。然后使用聚L-天冬氨酸（PAA)对PLL 的竞争性置换DNA寡核苷酸来使微球分解。PAA被选作在260nm处没有吸收并且不干扰在 260nm处对寡核苷酸定量的聚氨基酸试剂。在RP-HPLC图谱，如图3中，每个峰下的面积与 微球中荷载的每种寡核苷酸的量成比例。如图3中所示，峰的高度表明在微球中每种寡核 苷酸大致相等的载量。微球中寡核苷酸的载量经计算为重量的大约65%到大约80%。图 3还显示了寡核苷酸的完整性没有受到微球配制过程的影响，这由分解后峰的狭窄分布表 明。
[0064] 实施例2
[0065] 在本实施例中，显示了覆盖本公开的预防方面的试验结果。如图4所示，在5-8周 龄的N0D小鼠中单次施用AS-MSP延迟了糖尿病发作。对两组雌性N0D小鼠（5-8周龄）单 次皮下注射配制成本公开的微球的反义寡核苷酸（AS-MSP)。制剂以被认为含有每种反义寡 核苷酸（抗⑶40、抗⑶80和抗⑶86)的1:1:1混合物50 ii g的量进行注射。其它组的小鼠 注射错义序列的微球（SCR-MSP)或PBS介质（对照N0D)。每周通过尾部静脉穿刺测量血 糖。在两次连续读数>280-300mg/dL后，证实糖尿病。图4显示了两个独立治疗组群的累 计存活率。
[0066]图5显示在5-8周龄的N0D小鼠中多次施用AS-MSP防止了糖尿病发作。对N0D 雌性小鼠（5-8周龄）连续8次单剂皮下注射（每周一次）配制成本公开的微球的反义寡 核苷酸。注射（每种反义寡核苷酸的1:1:1的混合物或错义寡核苷酸50 y g)每周给予一 次，为期8周，在第13周停止。其它组的小鼠注射错义序列的微球（SCR-MSP)或PBS介质 (对照NOD)。图5显示了治疗的动物的累计存活率。
[0067] 图6a和6b显示了没有接受治疗、因此自发发展成自身免疫性的小鼠（糖尿病N0D 小鼠）的胰腺组织切片，用苏木精和曙红染色（H+E ;图6a)或对胰岛素进行染色（图6b)。 图6c和6d显示了用SCR-MSP制剂治疗的小鼠（与用特异性AS-MSP治疗的组平行开始注 射）的胰腺组织的切片。这些切片也用苏木精和曙红染色（H+E;图6c)或对胰岛素进行染 色（图6d)。SCR-MSP小鼠都发展出糖尿病。
[0068] 图7a和7b显示了在不到8周龄时治疗（预防模型）和用本公开的反义微球治疗 的小鼠的胰腺组织切片，用苏木精和曙红染色（H+E ;图7a)或对胰岛素进行染色（图7b)。
[0069] 图8中显示，来自AS-MSP治疗的N0D小鼠的T细胞表现出Foxp3+⑶25+推定的 1；%细胞的优势增加。图8A显示用于FACS分析的门（gating)。图8B显示从脾脏富集的 Foxp3+⑶25+T细胞的百分率，图8C显示来自集合淋巴结的百分率，所述淋巴结来自ASMSP 无糖尿病组群随机选择的ASMSP治疗的无糖尿病小鼠或来自用错义序列微球（SCR-MSP)治 疗的或用PBS介质治疗的动物。
[0070] 图9显示了来自ASMSP治疗的无糖尿病N0D小鼠的T细胞在与同系脾细胞共培 养时的增殖。来自ASMSP治疗的无糖尿病N0D小鼠的T细胞通过富集柱获得，并与来自于 Balb/c、C57BL6或同系无糖尿病N0D小鼠（10周龄）的Y射线辐照过的脾细胞共培养。在 四天后使用Cyquant试剂测量增殖。Spl是指同系的辐照过的脾细胞。
[0071] 图10显示了来自ASMSP治疗的、无糖尿病N0D小鼠的T细胞在同系的辐照过的脾 细胞和卵清蛋白的存在下的体外增殖。T细胞从在ASMSP无糖尿病组群中随机选择的ASMSP 治疗的无糖尿病小鼠的脾脏或集合淋