巴结富集。
[0072] 图11显示了来自ASMSP治疗的、无糖尿病N0D小鼠的T细胞，在同系的胰岛裂解 物的存在下在体外表现出增殖抑制。T细胞从图4描述的ASMSP无糖尿病组中随机选择的 ASMSP治疗的无糖尿病小鼠的脾脏或集合淋巴结富集。辐照过的N0D脾细胞（来自10周龄 的无糖尿病N0D小鼠）被用作抗原呈递细胞，平行培养物用NIT-1裂解物（1 y g/孔）（或 PBS介质）脉冲。
[0073] 对于人类试验中糖尿病抑制疗法的最终结果（translation)的主要顾虑是治疗 方法的抗原特异性（以及因此的细胞特异性），以及治疗是否造成全面的非特异性抑制。为 了解决这些问题，将从图4显示的组群中随机选择的无糖尿病小鼠处以安乐死，以确定脾 脏和淋巴结T细胞对同种异体抗原、规定（nominal)抗原（以完整的卵清蛋白的形式）和来 自N0D衍生的胰岛瘤细胞系NIT-1的细胞裂解物形式的同系0细胞衍生抗原的增殖。尽 管胰岛素和谷氨酸脱羧酶（GAD)是在机理和目的上有牵连的候选自身抗原，但启动自身抗 原的本质仍然不清楚。然而，可以合理地认为它应该是0细胞驻留性的。因此，源自于N0D 胰岛瘤的NIT-1细胞系被用作3细胞抗原的来源，与来自AS-MSP治疗的无糖尿病NOD小 鼠的T细胞共培养，以确定抗原特异性低应答性的可能性。从这些研究可以看到，对规定的 和同种异体抗原的T细胞增殖得到了维持，而在与NIT-1细胞裂解物共培养中存在T细胞 低增殖。
[0074] 此外，为了确定共培养上清液中的细胞因子，我们观察到来自AS-MSP治疗的无糖 尿病N0D小鼠的T细胞，即使在NIT-1裂解物的存在下，也明显减少TNF a的产生。尽管在 AS-MSP治疗的小鼠的T细胞的共培养物中，IFN Y的生产略有减少，但它与在NIT-1裂解物 存在下、与PBS治疗小鼠的T细胞的共培养物没有统计学上的可区别性。最后，该分析不能 检测到上清液中IL-4、IL-10或TGFP的存在。
[0075] 实施例3
[0076] 还测试了反义寡核苷酸微球在早期发作N0D小鼠中逆转糖尿病症状的能力。这些 实验的时间线显示在图13A中。通过测试血糖水平并鉴定血糖水平大于400mb/dL的动物， 选择了具有早期发作的N0D小鼠。给选出的动物胰岛素粒，使血糖水平正常，低于300mg/ dL的正常水平。撤销胰岛素，开始进行一系列肠胃外微球注射。6只动物每周两次注射含 有⑶40、⑶80和⑶86反义寡核苷酸的微球。另外10只动物注射含有不针对⑶40、⑶80和 /或⑶86的错义序列的寡核苷酸混合物的微球。对于这两组动物来说，每次注射都在100 微升注射液的微球中含有50 y g寡核苷酸。错义组动物中的两只由于身体状况差在实验结 束前被安乐死。在开始进行注射方案后，血糖水平每周取样两次。在实验过程中动物不禁 食。结果在图12中作图，其中指示符（1)表示开始用胰岛素颗粒，指示符（2)表示除去胰 岛素颗粒并开始每周两次MSP注射。应该注意在图12中报道的最商血糖值是700mg/dL，这 对应于所用测量计的最大读数，应该理解为700mg/dL数据点表示血糖读数为700mg/dL以 上。接受含有⑶40、⑶80和⑶86反义寡核苷酸混合物微球的组中所有的动物（ASMSP1到 ASMSP6)与接受带有错义寡核苷酸的微球的动物（SCRMSP1到SCRMSP10)相比，显示出明显 较低的葡萄糖水平。此外，该ASMSP组的6只动物中4只显示出血糖水平低于400mg/dL，这 一般被认为是糖尿病发作的阈指标。
[0077] 在图13A中显示了实验的时间线。对每组的平均非空腹血糖（图13B)和平均空 腹血糖水平（图13C)进行了作图（+/-SEM)。在某些小鼠中，如图13A所示撤销了 ASMSP的 施用。如图13B和13C所示，在新发作糖尿病的N0D雌性小鼠中施用多轮AS-MSP，相对于未 治疗动物（对照）、用PBS治疗的动物或用错义寡核苷酸（SCR-MSP)微球治疗的动物来说， 改善了血糖水平并产生稳定的空腹血糖正常，即使是在撤去AS-MSP后。
[0078] 图7c和7d显示了在糖尿病发作后用反义制剂治疗的N0D小鼠的胰腺组织切片， 并显示了疾病的逆转。切片用苏木精和曙红染色（H+E ;图7c)或对胰岛素染色（图7d)。
[0079] 三种不同的AS-寡核苷酸可以被结合在PR0MAXX微球中，这样的微球可以用作组 合物，通过诱导免疫调节性树突状细胞预防和/或逆转新发作的自身免疫糖尿病。事实上， 单次注射组合物延迟了疾病发作，而在新发作糖尿病的小鼠中重复用药使高血糖归于正 常，表明了疾病的逆转。在这些研究中，每日施用胰岛素，直到血糖低于300mg/dL。然后在 皮下施用AS-MSP下停用胰岛素。在示例性给药方案中，动物每周两次施用每公斤体重2mg AS-MSP，为期3-4周。对无糖尿病的NOD小鼠进行监测。
[0080] 在图14A-C中，证实了给N0D小鼠施用AS-MSP使所述小鼠的血糖水平回复到正常 水平，并且所述血糖水平的正常化维持一段较长的时期。如图14B和14C所示，在停止施用 胰岛素后〇到30天之间施用AS-MSP。在停用胰岛素后第15天，血糖水平回复到正常，并保 持正常水平直到监测期结束（第55天）。
[0081] 在图15中显示了自身免疫糖尿病的治疗性逆转的影响的图示。如果P在图15中 显示的新发作"蜜月"期施加R0MAXX治疗的话，预计将会保留10-20%的仍具有功能的3 细胞，从而导致对糖尿病的控制并减少患者对胰岛素的依赖。
[0082] 应该理解，已经描述的本公开的实施方案是说明本公开的原理的某些应用。对于 本领域的专业人员来说，可以在不背离本公开的真实精神和范围下进行大量的修改。本文 描述的各种特点可以以任何组合使用，而不限于在本文具体概括的明确组合。
【主权项】
1. 含有寡核苷酸的微球在制备用于逆转哺乳动物1型糖尿病的药物中的应用，所述哺 乳动物显示糖尿病症状，其中所述寡核苷酸与选自CD40、CD80和CD86初级转录物的初级转 录物及其组合是反义的并与它们定向结合，其中所述药物每周施用两次。2. 权利要求1的应用，其中所述寡核苷酸选自SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2或SEQID NO:3及其组合。3. 权利要求1的应用，其中所述药物使得所述哺乳动物的血糖水平与所述哺乳动物在 施用所述组合物前的血糖水平相比正常化。4. 权利要求1的应用，其中所述微球含有与CD40、CD80和CD86初级转录物是反义的 并与它们定向结合的寡核苷酸。5. 权利要求1的应用，其中所述药物的施用引起所述哺乳动物的P细胞群的再生。6. 权利要求1的应用，其中所述药物为可注射的组合物。7. 权利要求1的应用，其中所述药物与胰岛素组合施用。8. 权利要求7的应用，其中所述胰岛素在所述药物施用之前、同时或之后施用。9. 权利要求1的应用，其中所述微球的70%w/w或更多是寡核苷酸。10. 权利要求9的应用，其中所述微球药物中反义⑶40:反义⑶80:反义⑶86的比率 是I:1:1。
【专利摘要】本发明涉及预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合物。具体地，本发明采用微球形式投送AS-寡核苷酸以诱导树突状细胞耐受，特别是在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中。微球结合了反义(AS)寡核苷酸。方法包括使用反义方法在NOD小鼠中体内逆转自身免疫糖尿病病症。寡核苷酸被定向结合于初级转录物CD40、CD80、CD86以及它们的组合。
【IPC分类】A61K31/711, A61P3/10, A61K48/00, A61K9/16
【公开号】CN105168146
【申请号】
【发明人】拉里·R·布朗, 尼克·吉安努卡基斯, 金伯利·A·吉利斯
【申请人】巴克斯特国际公司, 巴克斯特医疗保健股份有限公司, 高等教育联邦体系所属匹兹堡大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2007年8月6日