优点，包括其 各种组合，将得到明显和清楚的理解。
[0022] 附图简沭
[0023] 在本说明的过程中，将对附图进行参考，其中：
[0024] 图la和lb是AS-寡核苷酸和聚L-赖氨酸聚阳离子微球的扫描电镜照片。
[0025] 图2a和2b是显示本公开的微球制剂性质的图。图2a是显示微球制剂大小的图。 图2b是显示微球制剂的表面电荷的图。
[0026] 图3是微球分解（deformulation)后寡核苷酸的RP-HPLC色谱图。
[0027] 图4是显示了与用错义（scrambled)寡核苷酸微球或只用PBS载体治疗的动物相 t匕，在用本发明的反义寡核苷酸微球（AS-MSP)治疗多次的N0D小鼠中对糖尿病的防止的绘 图。
[0028] 图5是显示了与用错义寡核苷酸微球或只用PBS载体治疗的动物相比，在用本公 开的AS-MSP治疗一次的N0D小鼠中对糖尿病的防止。
[0029] 图6a_6d是用苏木精和曙红染色（图6a和c ;H+E)或对膜岛素进彳丁染色（图6b 和6d)的对照NOD小鼠胰腺组织切片的光学显微镜照片。
[0030] 图7a_7d是用苏木精和曙红染色（图7a和c ;H+E)或对膜岛素进彳丁染色（图7b 和7d)的AS-MSP治疗的NOD小鼠胰腺组织切片的光学显微镜照片。
[0031] 图8显示了从本公开的AS-MSP治疗的小鼠或对照动物获得的T细胞的FACS分析。
[0032] 图9显示了相对荧光强度（RFI)图，证实了来自以本公开的AS-MSP治疗的动物并 与脾细胞一起培养的T细胞的增殖。
[0033] 图10显示了 RFI图，证实了来自AS-MSP治疗的无糖尿病N0D小鼠的T细胞在同 系的被辐照脾细胞和卵清蛋白的存在下的体外增殖。
[0034] 图11显示了 RFI图，证实了来自AS-MSP治疗的无糖尿病N0D小鼠的T细胞在同 系胰岛裂解物的存在下体外增殖受抑制。
[0035] 图12是新发作糖尿病小鼠用含有反义或错义寡核苷酸的微球治疗的血糖水平 图。
[0036] 图13A显示了用患有新发作糖尿病的小鼠进行实验的时间线，图13B和13C是用 AS-MSP或对照进行治疗的新发作糖尿病小鼠的平均血糖水平图。
[0037] 图14A-C显示了 N0D小鼠中1型糖尿病表型的逆转。这些图显示了在施用AS-MSP 后，哺乳动物的血糖水平在15天内回复到正常（正常水平用虚线显示，大约为200mg/dL)， 并且甚至在停止AS-MSP的施用后（第30天）仍维持正常。
[0038]图15描绘了自身免疫糖尿病的治疗性逆转的模式。
[0039]说明件实施方案的描沭
[0040]按照需要，在这里公开了本公开的详细实施方案；但是，应该理解，公开的实施方 案仅仅是本公开的示例，它可以以各种形式体现。因此，本文公开的具体细节不应该被解释 为是限制性的，而仅仅是作为权利要求书的基础，以及作为给本领域专业人员讲授的代表 性基础，以便以实际上任何适合的方式多样性运用本发明。
[0041]I型糖尿病是一种自身免疫疾病，其中胰腺，具体来说是产生胰岛素的内分泌3 细胞，存在着进展性炎症。在发病前，炎症首先使内分泌0细胞功能障碍。在人类自身免 疫（1型）糖尿病的非肥胖型糖尿病（N0D)小鼠模型中，单次注射微球制剂明显延迟了疾病 的发作。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，但据信在疾病发作前，微球被注射位点的驻 留性和迁移性树突状细胞摄取，然后移动到邻近的淋巴结中。还认为在被治疗的受体中，发 生了靶向推定0细胞抗原的T细胞的体外增殖降低。在免疫缺陷的N0D-SCID小鼠中，通 过用同系T细胞和树突状细胞重建然后再施用微球，可以发生⑶4+⑶25+推定的调节T细 胞优势增加。因此，基于微球的治疗性组合物可以调节树突状细胞活性并动员调控网络进 行预防。
[0042]能够防止糖尿病发作的治疗方法是合乎需要的。当临床发病后显著数量的@细 胞已经被破坏时，能够遏制或逆转疾病的治疗性组合物也是合乎需要的。在新发作糖尿病 的小鼠中重复用药使高血糖归于正常，并逆转了疾病。逆转一般表示使个体，例如人类或其 它哺乳动物，表现出接近正常的血糖水平。不受任何具体理论的束缚，据信在"逆转"期间， 疾病诱导的T细胞炎症和细胞死亡被抵制了。
[0043] 一个实施方案通过配制和注射本文描述的、以⑶40、⑶80和⑶86转录物为靶标的 反义（AS)寡核苷酸微球，逆转了自身免疫胰岛素依赖性糖尿病。针对转录物的反义寡核苷 酸的具体例子公开在本文的实施例中。应该理解，也可以设计其它与CD40、CD80和CD86转 录物有效结合的反义寡核苷酸，以获得本文描述的效果。还应该理解，这样的寡核苷酸可以 结合本领域已知的修饰，包括但不限于巯基化（thioation)、甲基化和甲氧乙基化，并且这 些修饰的位置和数量可以被改变，以获得最优效果。这些寡核苷酸被设计用于诱导免疫耐 受，这样导致在N0D小鼠模型中产生胰岛素的0细胞的破坏被逆转。
[0044] 在N0D小鼠以及人类中，1型糖尿病被证实是由于产生胰岛素的胰腺0细胞被自 身免疫破坏。在临床发病时，人类通常具有10-20%以下的残留P细胞团。散在的任何该 残留细胞团可以产生足以调节葡萄糖水平的残余胰岛素水平。此外，逆转0细胞破坏可以 导致0细胞群的部分再生。提供本公开的含有寡核苷酸的微粒是为了干扰0细胞的自身 免疫破坏。
[0045] 应该认识到，能够被激活的树突状细胞（DC)是在所有组织中发现的强抗原呈递 细胞，它们存在于皮肤下。这些抗原呈递树突状细胞的功能是通过活化T细胞作为免疫应 答、包括自身免疫应答的引发物，特别是在淋巴结中。尽管不希望受到理论的束缚，但据信 ⑶40、⑶80和⑶86对于自身免疫应答是重要的，这些分子的下调被认为促进了自身免疫的 低应答性。此外，某些细胞因子例如干扰素和白介素，因为低应答性而降低。
[0046] 在制备用于在小鼠中治疗自身免疫糖尿病的微球中，可以将一种、两种或三种 AS-寡核苷酸溶解在水性溶液中，并与水溶性聚合物和聚阳离子合并。溶液通常在大约 60-70°C温育，冷却到大约23°C，并除去过量的聚合物。
[0047] 核酸通常占微球的大约30到大约100重量％，平均粒度不超过大约50微米，通常 不超过大约20微米，并可以不超过大约10微米。它们通常如下制备。制备寡核苷酸的水 溶液。在要制备含有三种寡核苷酸的微球时，将三种寡核苷酸溶液等份合并。每种溶液含 有这三种寡核苷酸类型的一种。含有寡核苷酸的终溶液通常含有大约l〇mg/ml寡核苷酸。
[0048] 在特定的实施例中，微球制剂含有65%、70%、75%、80%，85%、90% w/w或更多 的寡核苷酸载量。在这样的实施方案中，组合物具有6-10% w/w的聚L-赖氨酸含量。此 外，微球的水分含量是变化的，可以为大约4%。寡核苷酸以1:1:1的反义⑶40:反义⑶80: 反义⑶86的比率存在。
[0049] 将它们与10mg/ml聚阳离子储存液的等份合并。聚阳离子的例子是聚赖氨酸和聚 鸟氨酸。其它包括聚乙烯亚胺（PEI)、谷醇溶蛋白、鱼精蛋白、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、聚精 氨酸、乙烯胺、以及带正电荷多糖的衍生物例如带正电荷壳聚糖，及其组合。聚阳离子溶液 中聚阳离子：寡核苷酸的体积比可以从大约1:1到大约4:1。常用的聚阳离子包括聚L-赖 氨酸*HBr (最高达70, 000道尔顿，可以从Bachem获得）和聚L-鸟氨酸*HBr (例如11，900 道尔顿，可以从Sigma获得）。
[0050] 还制备了聚合物溶液。它们可以用作相分离增强剂。适合的聚合物的例子包括线 性或分支的聚合物、共聚物和嵌段共聚物。这些聚合物可以是水溶的、半水溶的、与水混溶 的的或可溶于与水混溶的溶剂中的。聚合物的例子包括可药用添加剂，例如各种不同分子 量的聚乙二醇（PEG)，如 PEG 200、PEG 300、PEG