KRAS野生型状态的肿瘤中，候选基因的基线表达与在第6周时的疾 病控制的相关性。Log比值是具有疾病控制的患者的平均Iog2表达水平减去具有进展性疾 病的患者的平均Iog2表达水平，针对样品的肝污染程度进行调整。
[0079] 图14 =Luminex血浆蛋白质组学数据的统计学分析结果。分析指的是，在所有患 者中以及在具有KRAS野生型肿瘤的患者中，基线和第4周样品之间的一般改变、治疗中改 变与在第6周时的应答的相关性。对于这些分析之每一个，针对每一种测量的蛋白质，给出 Iog2比值、P值和q值。Log2比值指的是在第4周和基线样品之间log2浓度的平均差异 (一般改变），或在应答者和非应答者之间的这些平均差异之间的差异（与应答的相关性）。
[0080] 图15 :抗体试剂和免疫组织化学测定条件。
[0081] 图16 :基于在结肠直肠癌（蓝色框）和正常肝（紫色框）中优势表达的基因的表 达，鉴定具有高（绿色）、中（红色）或低（黑色）肝污染的RNA样品。色度反映在标准化 后的绝对元素信号强度。
[0082] 图17 :从基线到第4周表达的治疗中改变与最佳总体应答的相关性（部分应答与 稳定疾病加进展性疾病比较）。显示了具有P〈〇. 002的47个探针组。在图右侧上给出基因 名称，随后为元素 ID (element ID)。元素强度代表在第4周时的基因表达超过在基线时的 基因表达的Iog2比。缩写；PD，进展性疾病；SD，稳定疾病；PR，部分应答。
[0083] 图18 :从基线到第4周候选基因表达的治疗中改变与最佳总体应答的相关性（部 分应答与稳定疾病加进展性疾病比较）。在图右侧上给出基因名称，随后为元素 ID。元素 强度代表在第4周时的基因表达超过在基线时的基因表达的Iog2比。
[0084] 缩写；PD，进展性疾病；SD，稳定疾病；PR，部分应答。
[0085] 图19 :在具有KRAS野生型状态的肿瘤中候选基因的基线表达与疾病控制的相关 性（部分应答加稳定疾病与进展性疾病比较）。在图右侧上给出基因名称，随后为元素 ID。 强度程度反映，相对于每个探针组在所有样品上的平均值，每种元素的Iog2比值。缩写；PD， 进展性疾病；SD，稳定疾病；PR，部分应答。
[0086] 图20 :在用西妥昔单抗（Erbitux)治疗的mCRC患者中KRAS状态与应答率和无进 展生存的相关性。
[0087] 图21.在皮肤㈧和肿瘤⑶样品中所选EGFR信号途径相关标记的表达的免疫 组织化学分析：在配对的第4周/基线样品之间的改变。
[0088] 图22.根据KRAS肿瘤突变状态，相对于无进展生存时间（以月表示），无疾病进展 的患者的比例。
[0089] 图23.在具有KRAS野生型肿瘤的患者中，基线基因表达数据与在第6周时的疾病 控制的相关性（部分应答加稳定疾病与进展性疾病比较）。显示了具有P〈〇. 002的57个探 针组。在图右侧上给出基因名称，随后为元素 ID。色度反映，相对于每个探针组在所有样品 上的平均值，每种元素的Iog2比值。缩写；PD，进展性疾病；SD，稳定疾病；PR，部分应答。
[0090] 图24.在所有患者中（分别为图A、C和E)和在肿瘤具有野生型KRAS的患者中 (分别为图B、D和F)，根据第6周时的应答，在基线样品中的AREG(element 205239_at)、 EREG(element 205767_at)和TGFA(element 205016_at)的表达水平。P值指与疾病控制 的相关性（部分应答PR和稳定疾病SD与进展性疾病ro比较）。
[0091] 图25.在意向治疗（ITT)群体中的45个患者（图A)中和在具有KRAS野生型肿瘤 的24个ITT患者（图B)中，从基线到第4周血浆蛋白质浓度的治疗中改变与在第6周时 的应答的相关性（部分应答PR与稳定疾病SD加进展性疾病ro比较）。显示了具有P〈. 01 的所有蛋白质。兀素强度代表在第4周时的蛋白质浓度超过在基线时的蛋白质浓度的Iog2比。
[0092] 图26 :盒图（boxplot)显示VAV3与应答的相关性。PD :进展性疾病，PR :部分应 答，SD :稳定疾病。绿点：具有KRAS和BRAF野生型肿瘤的患者，红点：具有KRAS突变的患 者，黑点：具有BRAF突变的患者，蓝点：突变状态未知。P值基于Welch t检验。
[0093] 图27 :Kaplan_Meier曲线显示通过VAV3表达分层的估计的无进展生存分布函数。 取决于患者的基线VAV3表达水平是高于还是低于全部患者的中值水平，已将患者分类为 高或低VAV3表达者。p值衍生自Cox比例风险模型。
[0094] 图28 :Kaplan_Meier曲线显示通过VAV3表达分层的估计的总体生存分布函数。 取决于患者的基线VAV3表达水平是高于还是低于全部患者的中值水平，已将患者分类为 高或低VAV3表达者。p值衍生自Cox比例风险模型。
[0095] 图29 =Kaplan-Meier曲线显示通过VAV3表达和KRAS突变状态分层的估计的无进 展生存分布函数。患者已分为4层，代表KRAS突变状态和基线VAV3表达（高于或低于中 值）的所有可能组合。
[0096] 图30 :Vav3与活化的EGFR相互作用。在用VAV3和EGFR单独地或组合地转染HEK 293细胞后，使细胞裂解且实施免疫沉淀（IP)和蛋白质印迹（WB)。
[0097] 发明详述
[0098] EGFR靶向免疫球蛋白（Ig)Gl单克隆抗体西妥昔单抗是批准用于治疗实体瘤的第 一个单克隆抗体。
[0099] 已进行了关于预测西妥昔单抗应答的有用生物标记的深入研究，以鉴定将从西妥 昔单抗治疗中最显著获益的那些患者。对于CRC中的EGFR靶向治疗功效，通过免疫组织 化学评价的肿瘤EGFR表达已被证明为是一个令人失望的生物标记。对于KRAS基因突变， 已报道了更有希望的数据，所述KRAS基因编码GDP/GTP结合蛋白，其将EGFR信号级联的 配体依赖性受体激活与细胞内途径联系在一起。在多个临床研究中KRAS突变状态的回顾 性分析，包括在转移性CRC (mCRC)中的一线治疗的2个随机化研究EMR 62202-047和EMR 62202-013,以及随机化CO. 17研究（研究在先化疗失败的mCRC患者中的西妥昔单抗单一 治疗），已证实KRAS密码子12/13突变状态对CRC中的西妥昔单抗活性具有预测性。在其 肿瘤为KRAS野生型的患者亚组中主要观察到肿瘤应答，携带KRAS密码子12/13突变的患 者不获益于西妥昔单抗治疗。KRAS的突变状态因此看起来是CRC中西妥昔单抗活性的一个 有力预测生物标记，允许从治疗中排除不可能获得显著利益的亚群。
[0100] 然而，具有KRAS野生型肿瘤的CRC患者中约60%，并非所有，获益于西妥昔单抗治 疗。约40%的KRAS野生型肿瘤患者不响应西妥昔单抗治疗，并且在这些患者中一个相当大 的部分早期进展且具有短的总体生存。
[0101] 因此，需要鉴定和使用进一步的生物标记，加上KRAS突变状态，其可以用于更好 地预测CRC患者中西妥昔单抗治疗的临床结果。还需要鉴定除KRAS突变状态外允许更好 地预测西妥昔单抗在CRC治疗中的功效的生物标记。
[0102] 在2个西妥昔单抗CRC研究EMR 62202-502和EMR 62202-045中，执行了新鲜冷 冻的肝转移灶活检组织的微阵列分析，以鉴定在一般患者群体或具有KRAS野生型肿瘤的 患者中，其表达与应答、无进展生存或总体生存相关的基因。这些基因的表达可以用作西妥 昔单抗在CRC中的治疗功效的预测性生物标记，和用于更好地鉴定将在CRC中从西妥昔单 抗治疗中获得最大利益的那些患者。
[0103] 上述基因的表达被用作生物标记，用于预测西妥昔单抗和其他抗EGFR定向治疗 抗体在具有CRC的患者中的功效、和用于促进临床中的治疗决定，即患者是否将接受西妥 昔单抗或其他抗EGFR定向治疗抗体。临床实践中的应用是：
[0104] 1.自福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE)或新鲜的肿瘤活检组织（后者必须直接 在液氮中冷冻或用RNA-Iater处理以保存RNA完整性）分析这些基因的mRNA表达。活检 组织可以得自原发性肿瘤或转移灶。mRNA表达的分析可以通过基于PCR的方法（例如实时 PCR，qPCR)使用基因特异性引物扩增目的基因而执行，或通过目的基因的mRNA与基因阵列 上的基因特异性的固定化杂交探针杂交而执行。
[0105] 2.自FFPE或新鲜肿瘤活检组织（后者必须直接在液氮中冷冻或用RNA-Iater处 理以保存RNA完整性）分析这些基因的蛋白质表达。活检组织可以得自原发性肿瘤或转移 灶。蛋白质表达的分析包括方法例如免疫组织化学、酶联免疫吸附测定（ELISA)、Luminex、 在膜上的蛋白质印迹和检测、质谱法。
[0106] 对于可溶性蛋白质：自血浆或血清分析蛋白质表达，包括方法例如ELISA、 Luminex、质谱法。
[0107] 为了建立用于临床实践的诊断试验，候选基因（一种或多种）或蛋白质（一种或 多种）的表达水平需要针对另一基因或蛋白质（或多种基因或多种蛋白质的组合）的表达 进行标准化，所述另一基因或蛋白质用相同测定法从相同活检组织中进行评价。这些"标准 化"基因或蛋白质可以包括已知在患者之间展示极低变异的细胞持家基因。可替代地，可以 测定来自"良好预后"（或不管最终使用的术语如何（例如"敏感性"））组的基因或蛋白质 (或多种基因或多种蛋白质的组合）的表达水平和来自"不良预后"（或例如"抗性"）组的 基因或蛋白质（或多种基因或多种蛋白质的组合）的表达水平的比值。后面一种方法提供 了优点一一仅使用与抗EGFR疗法的功效直接相关的基因或蛋白质的表达水平。这种方法 导致高动态范围，不依赖于适宜的持家基因或蛋白质。
[0108] 在实施诊断试验前，必须定义阈值，其是：为了触发使用相应抗EGFR疗法治疗患 者的正决定，必须达到的所应用标记（如上所述）的表达水平的比值。这个阈值应以最佳 可能方式区分从抗EGFR治疗中获益的患者和不获益的患者。此阈值必须源自用抗EGFR疗 法治疗的患者的肿瘤样品的"训练集"。随后阈值必须在来自足够数目的患者的一个不同肿 瘤样品集合中进行前瞻性验证，以证明其能够选出将获得最大利益的患者或能够排除将不 从治疗中获益的患者。
[0109] 在用西妥昔单抗治疗CRC患者的2个独立的临床研究中（EMR62202-502和EMR 62202-045)，发现上文和下文描述的基因的表达与应答和/或无进展生存和/或总体生存 相关。
[0110] · EGFR基因扩增可以预测对于抗EGFR治疗的有利结果
[0111] ?后续研究发现EGFR基因扩增的较低发生率。
[0112] ?方法学/可比较性问题
[0113] · K-Ras突变"压倒" EGFR基因扩增在患者中的益处
[0114] ?皮疹迄今为止可能是Erbitux活性（mCRC，NSCLC)的最佳预测性生物标记
[0115] .Erbitux的PhIII研究FLEX:皮疹的早期发作（前21天）与延长的总体生存 (OS)相关
[0116] ?在5%患者中发现BRAF突变
[0117] · BRAF和KRAS突变是相互排斥的
[0118] · BRAF突变看起来是一个不良预后标记，而非Erbitux功效的预测标记
[0119] · mCRC中的AREG和EREG表达不依赖于KRAS突变状态
[0120] ?通过组合AREG和EREG表达状态与KRAS突变状态的额外预测力
[0121] 根据本发明的实验，西妥昔单抗处理与基底角质化细胞（basal keratinocytes) 中p-EGFR、ρ-ΜΑΡΚ和增殖的实质性下调以及ρ27Κιρ1和p-STAT3水平的实质性上调相关。 对于不同的施用方案和剂量水平，未注意到在这些效应中的显著差异。在西妥昔单抗单一 治疗阶段中，仅在其肿瘤是KRAS野生型的患者中实现了应答（8/29与KRAS突变型肿瘤的 0/19相比；P = .015)。与KRAS突变型肿瘤比较，无进展生存对于KRAS野生型的患者更长 (logrank，P = . 048)。基因组学/蛋白质组学分析鉴定了与应答相关的候选标记。
[0122] 在西妥昔单抗单一治疗的I期剂量递增试验中进行的这个转化研究 (translational study)，据我们所知，是使用药理基因组学和药理蛋白质组学分析在一线 背景中鉴定西妥昔单抗应答性mCRC的预测性治疗前生物标记的首次尝试。
[0123] 此临床研究（在其他地方报道）证实西妥昔单抗可以作为第一线疗法每两周以 400-700mg/m2的剂量安全地施用于具有mCRC的患者。以此最高剂量水平未达到MTD，并且 以不同剂量水平在不良事件的发生率或严重性或西妥昔单抗的活性上不存在显著差异。使 用皮肤测量靶影响，药效生物标记评估中的IHC数据显示在所有这些剂量递增组中EGFR途 经内信号蛋白质的一致抑制。这些数据提供了支持每周和每两周给药方案在功能上等价的 生物学基础。
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