24] 单臂和随机化mCRC研究的回顾分析已证实，肿瘤中KRAS在密码子12和13上的 突变状态是西妥昔单抗活性的强预测物，其中治疗益处与野生型状态紧密联系4'713。本研 究首次解决了在mCRC患者的第一线治疗中KRAS突变状态对西妥昔单抗单一治疗的影响。 与来自用西妥昔单抗治疗（作为单一活性剂或与化学疗法组合）的先前一系列化疗难治性 患者的数据一致s'n'13,在研究的单一治疗部分中的客观应答仅在具有KRAS野生型肿瘤的 那些患者中观察到（29个患者中的8个，28% )，在具有该基因携带突变的肿瘤的患者中未 见到应答（19中的O个）（P = .015)。在具有KRAS野生型肿瘤（55% )和KRAS突变肿瘤 (32% )的患者中最佳的总体应答率（包括在加入FOLFIRI后的应答）与CRYSTAL和OPUS 研究（其中西妥昔单抗分别与F0LFIRI和FOLFOX组合作为第一线治疗4'12)中获得的结果 相当。在本研究中，在接受与化学疗法组合的西妥昔单抗作为第一线治疗的具有KRAS突变 肿瘤的mCRC患者中观察到的应答十分可能归因于化学疗法的效应。总体PFS对于其肿瘤 为KRAS野生型的患者明显更长，证实KRAS肿瘤突变状态作为与西妥昔单抗治疗相关的预 测性生物标记的临床意义。
[0125] 具有KRAS野生型肿瘤的一个患者亚集看起来不获益于西妥昔单抗治疗。因此可 以鉴定进一步的预测生物标记，以便于使治疗更准确地针对将响应西妥昔单抗的那些患 者。近来，已初步描述了 BRAFis和PI3K19'2°突变以及PTEN去调节19 21的负向预测价值。已 推定与西妥昔单抗的临床活性相关的其他分子标记包括VEGF、IL8、EGFR和PTGS2(C0X2) 的肿瘤表达水平22;在治疗过程中VEGF的循环水平23;PTGS2和EGFR的组成多态性 (constitutional polymorphisms)24和 TP53 肿瘤突变状态 25。
[0126] 对于一系列抗癌剂，高通量基因组学技术越来越多地被用于预测性生物标记的搜 索中26 29。在西妥昔单抗的情况下，通过微阵列ια3°(未选择的群体和具有KRAS野生型肿 瘤的群体）和定量逆转录酶-PCR31 (接受西妥昔单抗加依立替康的患者）方法，已经证实， 在肿瘤中编码EGFR配体AREG(双调蛋白）和EREG(表皮调节素）的基因的高水平表达与 mCRC患者中的临床活性相关。类似地，在本申请的一线研究中，在总群体和KRAS野生型肿 瘤亚组中，AREG和EREG表达看起来在无疾病进展的患者的肿瘤中是升高的。相比之下， TGFa(编码TGF-α )在无疾病进展的患者中显示更低水平的表达。KRAS野生型肿瘤的此全 面基因表达分析鉴定到推定与在第6周时的疾病控制相关的57种基因（P〈. 002)。在这些 候选物中，发现 6 种基因（TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A 和 KLK6)具有〈0. 1 假 发现率。用于改善KRAS野生型mCRC中西妥昔单抗功效预测的这些推定生物标记的价值需 要进一步研究。
[0127] 血衆蛋白质的Luminex分析揭示，在西妥昔单抗单一疗法的治疗过程中双调蛋白 和TGF-α水平的强增加，对于EGF也观察到了此趋势。这些EGFR配体的上调可能是对于 EGFR抑制的补偿反应。有趣的是，双调蛋白水平的增加在响应西妥昔单抗治疗的患者中明 显更低。在应答者中在西妥昔单抗单一治疗下观察到癌胚抗原和癌抗原125和19-9的明 显降低。还值得注意的是，IL-8水平的降低与所有肿瘤以及KRAS野生型肿瘤中的应答明显 相关。IL-8是促进肿瘤细胞增殖和生存且对肿瘤微环境具有深远作用的促炎细胞因子32。 IL-8看起来是西妥昔单抗功效的预测生物标记。
[0128] 此外，根据本发明，当EGFR和VAV3在HEK 293细胞中表达时，可以检测到EGFR和 VAV3的直接相互作用。这说明VAV3在EGFR信号中的直接和显著作用以及在观察到的高 VAV3表达水平和西妥昔单抗的抗EGFR治疗活性的调节之间的直接联系。
[0129] 本发明首次证实，在第一线情况中用抗EGFR抗体优选西妥昔单抗（每两周和每周 施用）作为单一活性剂进行治疗，将有益于具有KRAS野生型肿瘤的mCRC患者。此外，在此 早期研究中的全面基因表达分析已产生了与某些基因的表达和西妥昔单抗的临床活性相 关的许多有意义的结果。这些观察促使可以使用不同方法学在更大的患者系列上进行验 证。这些研究的结果，为优化在患有不同癌症特别是CRC或mCRC的患者中用西妥昔单抗或 具有类似活性的抗EGFR抗体进行的治疗，提供了合理的基础。
[0130] EGFR途径组分的免疫组织化学分析
[0131] 从多达35个患者中获得可评估的配对基线/第4周皮肤活检组织，以分析所评价 的标记的药效学改变。与基线样品比较，在第4周中观察到p-EGFR、P-MPK和增殖的实质 性下调（如通过Ki67染色评价的）。平行地，观察到ρ27Κιρ1和P-STAT3的实质性上调。在 不同的施用方案和剂量水平的分析中，对于基线到治疗中时间点，患者组间在这些标记的 水平的改变上不存在相关差异（图21Α)。
[0132] 从高达17个患者中获得可评估的配对基线/第4周肿瘤活检组织。在治疗后在 肿瘤细胞中观察到增殖的减少以及P-EGFR和ρ-ΜΑΡΚ的显著下调（图21Β)。然而，ρ27Κιρ1、 P-STAT3和ρ-ΑΚΤ水平通过西妥昔单抗治疗未发生显著改变（数据未显示）。此小数目的 可得配对肿瘤活检组织不允许将剂量组和应答变量与生物标记水平的改变进行比较。
[0133] KRAS突变分析
[0134] KRAS密码子12或13突变在19/48 (40 % )患者样品中检测到（G12V，9个患者； G13D，5个患者；G12D，4个患者；G12A，1个患者）。在西妥昔单抗单一治疗阶段中，在此48个 患者中存在8个部分应答（PRs)。所有均在其肿瘤为KRAS野生型的患者中（8/29 ;28% )。 在其肿瘤携带KRAS突变的19个患者中未报道应答（P = . 015)(表1)。在总体研究（单一 治疗和联合治疗阶段）中，应答在具有KRAS野生型的16/29(55%)患者和具有KRAS突变型 肿瘤的6/19 (32% )患者中见到（P = . 144)。与其肿瘤携带突变的那些患者比较，PFS在其 肿瘤为KRAS野生型的患者中明显更长（图22 ;中值9. 4对5. 6个月，风险比0.47 ;logrank P = .048)。
[0135] 基因表达的微阵列分析
[0136] 来自基线和第4周时间点的总共106个肿瘤来源样品与Affymetrix GeneChip HG-U133P1US 2.0阵列杂交。基于一般的质量控制参数，4个阵列从进一步分析中排除，并 且由于正常肝组织污染的存在，24个样品被排除（图16 ;补充材料）并且未进一步分析。 在此成对排除后，来自42个ITT患者（36个基线，26个第4周：20对）的62个阵列数据集 保留用于分析。
[0137] 对于分析的肿瘤样品，基于变异性、信号强度和探针组注释（参见补充方法），预 过滤来自54, 675个探针组的数据。此方法使肿瘤表达分析局限于15, 230个探针组，代表 10, 538个基因。根据应答：进展性疾病（PD ;n = 12)相对于在第6周时的疾病控制（η = 23 ;1个患者不可评估），以及针对最佳总体应答：Η)和稳定疾病（SD) (η = 19)相对于PR (η =14 ;3个患者不可评估），全局比较基线预过滤后的数据，在此全局比较中，P值的分布 (数据未显示）基本上与偶然预期的一样，提示对于全体群体未鉴定到预测应答的基因表 达谱。然而，使分析局限于KRAS野生型肿瘤（具有ro的8个患者相对于具有疾病控制的 11个患者），鉴定到57个探针组，其表达模式推定与在第6周时的疾病控制相关（P〈. 002 ; 图23)。利用0. 1的假发现率（FDR)阈值（关于FDR定义，参见补充方法部分），发现6种 基因与疾病控制显著相关（TNFRSF1B，P = 6. 90E-07 ;DNAJC8, P = I. 60E-06 ;ECSIT，P = 6. 80E-06 ;GOSR2, P = 3. 90E-05,在显示疾病控制的患者中具有更高表达；以及PPP1R9A，P =8. 90E-07和KLK6, P = 3. 00E-05,在具有的患者中具有更高表达）。
[0138] 使用从具有来自基线和第4周时间点的可用样品的患者得到的数据，检查与应答 相关的治疗中改变。与ro(n = 8)比较，未鉴定到看起来与在第6周时的疾病控制（η = 12)紧密相关的表达改变。考虑与化学疗法的组合，PR (η = 7)相对于SD/PD(n = 13)在表 达谱上的比较揭示了 47个探针组显示出在治疗中改变上的差异（P〈. 002,调节性t检验，参 见图17)。
[0139] 在具有KRAS野生型肿瘤的患者中，以及在所分析患者的全集中，基线EREG(表皮 调节素）和AREG(双调蛋白）表达水平在响应西妥昔单抗的那些肿瘤中更高（图24;图 18)。这些发现与Khambata-Ford等人报道的结果一致 ' 有趣的是，TGFA(TGF-a)表现出 了相反表达模式（图24 ;图18)。在已知直接或间接参与EGFR信号传导的其他基因中，例 如ERBB受体以及配体ERBB3(HER3)和ERBB2(HER2)显示出在具有PR作为最佳总体应答的 肿瘤中更强下调的趋势（图19)。
[0140] 血浆蛋白质组学
[0141] 使用Luminex技术在血楽;样品中分析了 97种不同蛋白质的浓度。该组蛋白质包 括EGFR配体、其他生长因子、白细胞介素和各种其他候选蛋白质。在西妥昔单抗单一治疗 阶段中，在基线和第4周之间白细胞介素（IL)_8、巨噬细胞炎性蛋白（MIP)-Ia以及肿瘤标 记癌胚抗原、癌抗原125和19-9的血浆水平降低与在第6周时的应答显著地相关（P〈. 01) (图25A)。双调蛋白血浆浓度的一般性强增加在对于西妥昔单抗单一治疗具有部分应答的 患者中显著更弱（P〈. 01)(图25A)。当分析局限于具有KRAS野生型肿瘤的患者时，也在癌 胚抗原、癌抗原19-9、IL-8和双调蛋白上发现了与在第6周时的应答的相关性（来自24个 患者的数据，图25B)。此外，在西妥昔单抗单一治疗治疗的前4周过程中在血浆中观察到 TGF- α和EGF水平的一般性增加（不依赖于应答）和可溶性EGFR的降低。
[0142] 在所研究的基因和候选物（显示出表达水平和接受西妥昔单抗的转移性结肠直 肠癌（mCRC)患者中的治疗成功性相关）中，VAV3是特别有意义的。在研究EMR 62202-502 中，高肿瘤VAV3mRNA表达水平不仅与对西妥昔单抗与依立替康的组合的更佳应答强相关 (图26)，还与无进展生存（PFS)(图27)和总体生存（OS)(图28)强相关。此外，发现高肿 瘤VAV3表达水平与具有KRAS野生型肿瘤的患者中的应答和延长的PFS尤其相关（参见图 1和图29)。因此，VAV3表达看起来是用于在具有KRAS野生型肿瘤的患者中预测西妥昔单 抗疗法在CRC中的临床结果的良好生物标记候选物，其将帮助进一步优化对如下患者的选 择，所述患者将从西妥昔单抗治疗中获得最大利益。
[0143] 有趣的是，当EGFR和VAV3在HEK 293细胞中表达时，可以检测到EGFR和VAV3的 直接相互作用（图30)。这提示VAV3在EGFR信号传导中的直接作用、以及VAV3表达水平 和抗EGFR治疗的活性变化之间的直接联系。 实施例
[0144] 临床研究:
[0145] EMR 62202-502:该随机化研究在具有EGFR表达性mCRC (包括依立替康的治疗失 败）的患者（Pts)中调查西妥昔单抗的剂量递增。患者在开始西妥昔单抗（400mg/m2初始 剂量，随后250mg/m2/周W)和I (180mg/m2q 2w)后22天，如果他们未经历>1度（G)皮 肤反应、任何其他〉G 2西妥昔单抗相关不良事件并且对于I耐受，则进行随机化分组。随 机化分入标准西妥昔单抗剂量组（A组；250mg/m2/w)或剂量递增组（B组；西妥昔单抗剂量 以50mg/m2q 2w增加，直至〉G 2毒性、肿瘤应答或剂量= 500mg/m2)。未随机化的患者（C 组）继续用标准西妥昔单抗剂量。主要终点是：在治疗前和治疗过程中采集的皮肤和肿瘤 活检组织中，与标准西妥昔单抗方案比较剂量递增对EGFR和下游信号标记的影响。次要终 点是：PK、功效、安全性、耐受性、在肿瘤活检组织和血浆样品上的生物标记分析。从肿瘤活 检组织分析KRAS突变状态。
[0146] EMR 62202-045:此研究调杳在具有转移性结肠直肠癌的患者中西妥昔单抗的每 两周施用的安全性和药物代谢动力学。第二目的包括药效学生物标记分析。患者接受西 妥昔单抗单一治疗6周，随后为西妥昔单抗加 F0LFIRI直至疾病进展。患者在对照组中以 400mg/m2初始剂量随后250mg/m2/周接受西妥昔单抗，在剂量递增组中以400-700mg/m2， 每两周，接受西妥昔单抗。从肿瘤活检组织分析KRAS突变状态。
[0147] 用于基_表汰（微阵列）分析的肿瘤材