料:
[0148] EMR 62202-502:在基线时(治疗前）、在第22天时、以及可能的话在剂量递增组 (B组）中在患者的疾病进展时，通过开放手术、内窥镜术或Core针/细针活检，获得肿瘤材 料。样品在液氣中进行速冻。
[0149] EMR 62202-045:在基线时、在第4周时、以及可能的话在疾病讲展时,通过开放手 术、内窥镜术或Core针/细针活检，获得肿瘤材料。样品在液氮中进行速冻。
[0150] RNA表汰谱分析
[0151] 在补充方法部分中详述了与微阵列分析有关的实验程序。简言之，速冻的肿瘤活 检组织进行勾衆化，并且使用RNeasy Micro Kit? (Qiagen，Hilden)提取总RNA。根据 Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target标记方案，从所有样品中制备用于阵列杂交实 验的生物素化的靶cRNAs。对于分析的每一肿瘤，在此cRNA扩增/标记法的第一 cDNA合成 反应中包括了起始50ng总RNA。标记的cRNA随后与Affymetrix GeneChip HG_U133Plus 2.0基因表达阵列在45 °C以60rpm杂交16小时。在杂交后，在Affymetrix Fluidics Station 450上染色阵列，并且使用GeneChip Scanner定量信号。使用Affymetrix GCOS 专利软件和Bioconductor包，affyPLM，执行原始表达数据的质量控制和预处理。
[0152] EMR 62202-502 :在已执行所有质量控制检查和预处理步骤后，来自意向治疗 (ITT)群体的47个受试者的总共68个阵列数据集对于进一步分析是合格的。基线样品从 35个受试者获得。
[0153] EMR 62202-045 :在已执行所有质量控制检查和预处理步骤后，来自42个ITT患者 的总共62个阵列数据集对于进一步分析是合格的。基线样品从36个受试者获得。
[0154] 对于在2个研究的至少一个中基于变异性和信号强度通过了初始过滤的具有可 靠基因注释的所有Affymetrix探针组（代表10785种基因的16414个Affymetrix探针 组），进行了统计分析。
[0155] 在应答者和非应答者之间（EMR 62202-502)比较，或在西妥昔单抗单一治疗6周 后具有疾病控制的患者与具有进展性疾病的患者之间（EMR 62202-045)比较，用Welch t 检验鉴定了其表达与临床应答相关的基因。使用Cox比例风险回归，鉴定了其表达与无进 展生存或总体生存相关的基因 （EMR 62202-502)。针对患者全集以及仅针对具有KRAS野生 型肿瘤的患者，执行了这些分析。
[0156] 使用单研究单侧p值的乘积作为检验统计量和来自这些乘积的零分布（null distribution)的衍生p值，进行了跨此2个研究的元分析（meta-analysis)以鉴定应答相 关基因。
[0157] 在低于0.01和0.0001的范围中的P值，特别是低于0.01，优选0.005、更优选 0. 002、最优选0. 0005或0. 0001 (来自与临床应答的相关性的元分析，和来自与无进展生存 和总体生存的相关性的EMR 62202-502分析），视为统计上显著的。对于代表179种已知基 因的200个Affymetrix探针组，在至少一个比较中满足了这个标准。
[0158] 患者合格性和研究设计
[0159] 在分开的手稿中已全面地报道了合格性标准和研究设计。简言之，研究分成2个 部分；持续6周的西妥昔单抗单一治疗阶段和联合治疗阶段，在联合治疗阶段中患者接受 与单一治疗阶段相同剂量/方案的西妥昔单抗和方案基于依立替康的F0LFIRI。患者顺次 被分到标准每周方案和剂量的西妥昔单抗组（400mg/m2,随后为250mg/m2的每周剂量），或 每两周方案的西妥昔单抗剂量递增组（具有从400到700mg/m2的不同群组）。在西妥昔单 抗单一治疗6周后，作为最佳总体应答（单一治疗和联合治疗阶段），报道了临床应答。
[0160] 患者材料的收集和贮存
[0161] 在基线时和在第26-28天（第4周）时获得皮肤活检组织。如果出现皮疹，那么 从无疹区域中获得样品。将活检组织立即浸入4°C> 20倍其体积的中性缓冲甲醛溶液内， 并且在室温保持8-16小时。使用梯度乙醇系列使固定的样品脱水至二甲苯，并且在真空下 在60 °C纵向包埋到石蜡中。在基线时、在第4周时和可能的话在疾病进展时，通过开放手 术、内窥镜术或Core针/细针活检，获得肿瘤材料。如先前所述13a，1个样品/时间点进行 甲醛固定和石蜡包埋，3个样品在液氮中速冻。为了提供正常DNA，在基线时从每个患者中 获得IOml全血，并且IC存于-20°C或更低直至使用。对于Luminex分析，在基线和第4周时 收集血浆（2. 5ml)，并且贮存于-80°C。
[0162] 免疫组织化学
[0163] 甲醛固定石蜡包埋的（FFPE)组织的免疫组织化学（IHC)分析用于研究下述蛋白 质的表达：EGFR、磷酸（p)-EGFR、p-MAPK、Ki67 (MIBl)、p27Kipl (CDKNlB)和 p-STAT3(皮肤和 肿瘤活检组织）；HER2、P-HER2和p-AKT(肿瘤活检组织）。如先前描述的执行免疫组织化 学分析。133使用的抗体和方法的细节在补充方法部分中提供。
[0164] KRAS突变分析
[0165] FFPE患者来源的存档肿瘤组织从意向治疗（ITT)群体的48个患者中获 得。提取DNA且就KRAS密码子12和13突变的存在进行筛选，其中使用由Chen等人， 200414(LightMix，k-ras Glyl2, TIB M0LBI0L，Berlin，德国）改良的聚合酶链反应（PCR) 发夹和恪解曲线技术（PCR clamping and melting curve，如先前描述的12)。
[0166] RNA表达谱分析
[0167] 在补充方法部分中详述了与微阵列分析有关的实验程序。简言之，速冻的肿瘤活 检组织进行勾衆化，并且使用RNeasy Micro Kit? (Qiagen，Hilden)提取总RNA。根据 Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target标记方案，从所有样品中制备用于阵列杂交实 验的生物素化的靶cRNAs。对于分析的每一肿瘤，在此cRNA扩增/标记过程的第一 cDNA合 成反应中包括了起始50ng总RNA。标记的cRNA随后与Affymetrix GeneChip HG_U133Plus 2.0基因表达阵列在45 °C以60rpm杂交16小时。在杂交后，在Affymetrix Fluidics Station 450上染色阵列，并且使用GeneChip Scanner定量信号。使用Affymetrix GCOS 专利软件和Bioconductor包affyPLM，执行原始表达数据的质量控制。15如果从样品个体 获得重复阵列，那么选择具有最佳质量控制评价的数据集用于分析。使用GCRMA算法执行 原始探针水平强度数据的预处理。16
[0168] 蛋白质组学分析
[0169] 在 Rules-Based Medicine (Austin，Texas，US)，使用 Luminex .X砸AP?技术平 台（如补充方法部分中所述），对来自血衆的97种蛋白质（HumanMAP版本1.6加双调蛋 白、β-celluliruEGFR、肝素结合（HB)-EGF、表皮调节素、白细胞介素-18、转化生长因子 (TGF)-a和血小板反应蛋白-1)的多重分析。在来自随后入选试验的患者的23个样品中 仅评价了 β -cellulin、EGFR 和 HB-EGF。
[0170] 统计学分析
[0171] 对于肿瘤是KRAS野生型或突变型的患者，分别使用Fisher确切检验和Iogrank 检验，比较了应答率和无进展生存（PFS) -一定义为从西妥昔单抗的第一次输注直到在西 妥昔单抗和F0LFIRI组合下首次放射学证实疾病进展的持续时间。
[0172] 使用Bioconductor软件15和SAS版本9. 1执行IHC、微阵列和蛋白质组学数据的 所有统计分析（参见补充方法）。这些探索性分析被认为生成假设。
[0173] 参考文献（相关的和/或在本说明书中使用的）
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