4 B1和 EP0463151 B1中一般性描述的）。
[0048] 本发明使用的抗体Fab或Fab '片段的起始材料可以使用任何适当的酶切割和/或 消化技术(例如通过用胃蛋白酶处理)获自任何完整抗体，特别是完整单克隆抗体。可选地， 或另外，可以通过使用重组DNA技术(包括操作和重表达编码抗体可变和/或恒定区的DNA) 制备抗体起始材料。标准分子生物学技术可以用于修饰、添加或缺失期望的氨基酸或结构 域。如本文使用的，对可变或恒定区的任何改变仍然包括在术语"可变"和"恒定"区内。
[0049] 抗体片段的起始材料可以获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美 洲驼、山羊或人。抗体片段部分可以获自一种以上的物种，例如抗体片段可以是嵌合的。在 一个实例中，恒定区来自一个物种而可变区来自另一个物种。抗体片段的起始材料还可以 是经修饰的。在另一个实例中，使用重组DNA工程技术产生抗体片段的可变区。此类工程改 造的形式包括例如通过插入、缺失或改变天然抗体的氨基酸序列从天然抗体可变区产生的 那些。这个类型的特别的实例包括那些工程改造的可变区结构域，所述结构域包含至少一 个CDR和任选地，来自一个抗体的一个或多个构架氨基酸和来自第二抗体的可变区结构域 的其他部分。产生和制造这些抗体片段的方法是本领域公知的（参见，例如，Boss等人，US 4,816,397 ;Cabilly等人，US 6,331,415; Shrader等人，W0 92/02551; Ward等人，1989， Nature，341，544;Orlandi等人，1989,Proc .Natl .Acad. Sci .USA，86，3833;Riechmann等人， 1988，Nature，322，323 ; Bird等人，1988，Science，242，423; Queen等人，US 5，585，089 ; Adair，W091/09967;Mountain和Adair，1992Biotechnol.Genet.Eng.Rev，10，1-142;Verma 等人，1998,Journal of Immunological Methods，216,165-181)。
[0050] 在本发明中，与Fab或Fab'片段融合的各个单域抗体可以直接或经由连接体连接。
[0051] 本文使用的直接连接是指，Fab或Fab'的〃最后一个〃氨基酸通过肽键与单域抗体 的"第一个"氨基酸相连(或反之亦然）。
[0052]用于将dAb与Fab或Fab'连接的适当的连接体区域的实例包括但不限于，柔性连接 体序列和刚性连接体序列。柔性连接体序列包括在Huston等人1988，PNAS 85:5879-5883; ffright&Deonarain ,Mol. Immunol ·，2007，44( 11): 2860-2869 ;Alfthan等人，Prot · Eng ·， 1995，8(7) :725-731 ;Luo等人，J.Biochem.，1995,118(4) :825-831; Tang等人，1996， J ·Biol · Chem. 271 (26): 15682-15686;和Turner等人，1997，JHM 205，42-54中公开的那些 (关于代表性实例，参见表1)。
[0053] 表1.柔性连接体序列
[0054]
[0056] S)在序列3和45-48中是任选的。
[0057]刚性连接体的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID N0:34)，PPPP(SEQ ID N0: 35)和PPP。
[0058] 在一个实施方案中，肽连接体是白蛋白结合肽。白蛋白结合肽的实例提供于WO 2007/106120中，并且包括：
[0059] 表 2
[0060]
[0061]在一个实施方案中，抗体铰链序列或其部分用作连接体，例如上面的铰链序列。通 常，本发明使用的抗体Fab'片段具有天然或经修饰的绞链区。此类绞链区用作连接dAb部分 的天然连接体。天然绞链区是通常与抗体分子的C H1结构域结合的绞链区。经修饰的绞链区 是在长度和/或组成上与天然绞链区不同的任何铰链区。此类铰链区可以包括来自任何其 他物种的绞链区，例如人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊绞链区。其他经修饰的 绞链区可以包括来源于与ChI结构域不同的种类或亚类的抗体的完整绞链区。因此，例如γ 1种类的CH1结构域可以连接至γ 4种类的绞链区。可选地，经修饰的绞链区可以包括重复单 元或天然铰链的部分，在所述重复单元中重复的各个单元来源于天然绞链区。在进一步的 可选方案中，可以通过将一个或多个半胱氨酸或其他残基转换为中性残基(例如丙氨酸）， 或通过将合适位置的残基转换为半胱氨酸残基而改变天然绞链区。通过此类方法，可以增 加或减少绞链区中的半胱氨酸残基的数目。另外，可以控制铰链的其他特征，例如从轻链链 间半胱氨酸至铰链半胱氨酸的距离，铰链半胱氨酸之间的距离和铰链中其他氨基酸的组成 (其可以影响铰链的性质(例如柔性）），例如甘氨酸可以掺入铰链以增加旋转柔性或脯氨酸 可以掺入以减少柔性。可选地，带电或疏水残基的组合可以掺入铰链以赋予多聚化性质，参 见例如Richter等人，2001，Prot.Eng. 14(10) :775-783(关于带电或离子尾部例如酸性尾部 作为连接体的用途)和Kostelny等人，1992, Immunol. 5(1 ):1547-1553(关于亮氨酸拉链序 列）。其他经修饰的绞链区可以是完全合成的并且可以设计为具有想要的性质（例如长度、 组成和柔性）。
[0062] 大量的经修饰的绞链区已经被描述，例如描述于US5,677,425、US6642356、 恥9915549、恥2005003170、恥2005003169、恥2005003170、恥9825971和恥2005003171中，其 通过引用并入本文。此类铰链通常在CH1区之后，但也可以并入轻链κ或λ片段的恒定区的末 端;例如，参见表3。
[0063]表3.铰链连接体序列 [00641
[0065]可以使用本领域已知的方法产生本发明所用的单可变结构域(也称为单域抗体或 dAb)并且所述方法包括 W02005118642、Ward 等人，1989Nature，341，544-546 和 Holt 等人， 2003，Trends in Biotechnology，21，484_490中公开的那些。在一个实施方案中，本发明所 用的单域抗体是重链可变结构域(VH)或轻链结构域(VL)。各个轻链结构域可以是κ或λ亚群 的结构域。本领域已经描述了用于分离VH和VL结构域的方法，参见例如ΕΡ0368684和Ward等 人(同上）。此类结构域可以来源于任何适当的物种或抗体起始材料。在一个实施方案中，单 域抗体可以来源于啮齿类、人或其他物种。在一个实施方案中，单域抗体是人源化的。
[0066]在一个实施方案中，单域抗体来源于噬菌体展示文库，使用例如W02005/118642、 Jespers等人，2004，Nature Biotechnology，22，1161-1165和Holt等人，2003，Trends in Biotechnology，21，484-490中描述的方法。优选此类单域抗体是完全人的但也可以来源于 其他物种。在一个实施方案中，单可变结构域是嵌合的，其中构架是人的或基本上人来源的 且CDR是非人来源的。应理解，分离后，单域抗体的序列可以进行修饰以改进单域抗体的特 征(例如可溶性），如Ho 11等人(同上）中描述的。
[0067]如本文使用的，基本上人的是指，保留原始材料的人的特征，所述特征可以与免疫 原性有关。基本上人的材料包括其中构架序列中的一个氨基酸被添加、缺失或被另一个氨 基酸取代。
[0068]在一个实施方案中，dAb是获自scFv噬菌体展示或获自转基因 Humouse?或 Velocimouse?或人源化啮齿类动物的人序列。
[0069]在一个实施方案中，dAb获自人或人源化啮齿类动物，骆驼或鲨鱼。此类dAb优选是 人源化的。在一个实例中，单域抗体是基于骆驼免疫球蛋白的VHH结构域，如EP0656946描述 的。在一个实例中，用目的抗原免疫骆驼或美洲驼并且当滴度适当时收集血液。可以通过单 细胞PCR克隆编码dAb的基因，或可以通过EBV转化或通过与永生化的细胞系融合来永生化 编码dAb的B细胞。
[0070]如上文描述的，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含对目的抗原具 有特异性的抗体Fab或Fab '片段，所述片段直接或经由连接体与至少一个单域抗体融合，所 述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。
[0071 ]因此，在一个实施方案中，抗体片段，例如Fab或Fab '片段在重链或轻链可变区的 N-末端与dAb直接或经由连接体融合。可选地，抗体Fab或Fab'片段在重链或轻链的C-末端 与dAb直接或经由连接体融合。在另一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段的重链和轻链各 自在C-末端与dAb直接或经由连接体融合。连接可以是化学缀合，但最优选是翻译融合，即 基因融合，其中通过表达载体依次编码各自的序列。
[0072] -般地，将单域抗体的N-末端直接或经由连接体与Fab或Fab'片段的重链或轻链 的C-末端融合，并且当将单域抗体与Fab或Fab '的N-末端融合时，其经由其C末端进行融合， 任选地经由连接体。
[0073] 在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白质，所述蛋白包含或由对 目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab '片段组成，所述片段与单域抗体在重链或轻链的N-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。
[0074] 在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白质，所述蛋白包含或由对 目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab '片段组成，所述片段与单域抗体在重链或轻链的C-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。
[0075] 在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白质，所述蛋白包含或由对 目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab '片段组成，所述片段与至少一个单域抗体在重链或 轻链的C-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。
[0076] 在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含或由对目 的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab '片段组成，所述片段与两个单域抗体融合，其中各个单 域抗体彼此以线性序列融合（任选地经由连接体），并且所得的单域抗体融合物与Fab或 Fab '片段的轻链或重链的C-末端融合。
[0077] 在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含或由对目 的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab '片段组成，所述片段与两个单域抗体融合，其中一个单 域抗体与Fab或Fab '片段的轻链的C-末端融合且另一个单域抗体与Fab或Fab '片段的重链 的C-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。
[0078]在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包括单域抗体 时，两个单域抗体同一，即具有对相同抗原的相同结合特异性。在一个实例中，它们结合相 同抗原上的相同表位。例如，单域抗体可以都是相同VH dAb，相同VHH dAb或相同VL dAb。
[0079] 优选，当Fab或Fab '片段的重链和轻链各自在C-末端包含单域抗体时，两个单域抗 体是协同结合抗原的互补的VH/VL对，即它们是具有相同结合特异性的互补的VH/VL对。通 常，它们是来源于相同抗体的VH/VL对。
[0080] 在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含两个单域抗体(其是 互补的VH/VL对)时，VH单域抗体与重链恒定区（CH1)的C-末端融合和VL单域抗体与轻链恒 定区（Ck或α)的C-末端融合。在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含 两个单域抗体(其是互补的VH/VL对)时，VL单域抗体与重链恒定区（CH1)的C末端融合和VH 单域抗体与轻链恒定区(Ck或α)的C末端融合。
[0081] 在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含通过一个或多个二硫 键连接的两个单域抗体(例如其为通过一个或多个(例如1或2个)二硫键连接的互补的VH/ VL对的两个单域抗体)时，例如VH单域抗体与重链恒定区（CH1)的C末端融合和VL单域抗体 与轻链恒定区（Ck或α)的C末端融合。可选地，VL单域抗体与重链恒定区（CH1)的C末端融合 和vh单域抗体与轻链恒定区(ck或α)的c末端融合。
[0082] 据信二硫键为构建体提供额外的稳定作用，这可以是有利的。
[0083] 在一个或多个实施方案中，重链和轻链之间（例如CH结构域和CL或CK结构域之间） 的二硫键不存在，例如因为形成键的一个或多个半胱氨酸被取代。可以用例如丝氨酸取代 所述一个或多个半胱氨酸。
[0084] 在一个或多个实施方案中，存在CH结构域和CL或CK结构域之间的重链和轻链之间 的链间^硫键。
[0085]在一个实施方案中，提供F(ab)2片段，其包含一个、两个、三个或四个单域抗体，例 如两个分离的VH/VL对，其可以针对相同或不同的抗原。
[0086] 在本发明的双特异性融合蛋白中，单域抗体与第二抗原结合，所述第二抗原与Fab 或Fab '片段组分所结合的抗原不同。
[0087] 在一个实例中，本发明使用的dAb呈现对补体途径蛋白、CD标志物蛋白或Fc yR的 特异性。在这种情况下，dAb优选对⑶分子特异。最优选，dAb呈现对选自⑶68、CD80、⑶86、 CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和CD35 的 CD 分子的特异性。
[0088] 在优选的实例中，本发明使用的dAb呈现对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或 CD35/CR1的特异性，血清载体蛋白优选是人血清载体蛋白例如甲状腺素结合蛋白、转甲状 腺素蛋白、α?酸糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原或血清白蛋白。最优选，dAb呈现对人血清白 蛋白的特异性。因此在一个实例中，用血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1(例 如人血清白蛋白）免疫兔、小鼠、大鼠、骆驼或美洲驼并且当滴度适当时收集血液。可以通过 单细胞PCR克隆编码dAb的基因，或可以通过EBV转化或通过与永生化细胞系融合来永生化 编码dAb的B细胞。可选地，可以通过上文描述的噬菌体展示获得单域抗体。
[0089] 在一个实施方案中，单域抗体结合人血清白蛋白。在一个实施方案中，单域抗体结 合人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白。
[0090] 在一个实施方案中，结合血清白蛋白的单域抗体是W02005/118642(参见例如图lc 和Id)中提供的dAb或W02004/041862中提供的VHH或例如W02006/122787的表1II中描述的 人源化纳米抗体(nanobody)。
[0091] 在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH单域抗 体，其包含至少一个下列CDR:关于CDR-H1，具有图5(e)SEQ ID N0:56或图5(k)SEQ ID N0: 62中给出的序列的CDR;关于CDR-H2,具有图5(f)SEQ ID N0:57或图5(1)SEQ ID N0:63中给 出的序列的CDR和关于CDR-H3,具有图5(g)SEQ ID N0:58或图5(m)SEQ ID N0:64中给出的 序列的⑶R。
[0092] 在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH抗 体，其中VH结构域的CDR-HUCDR-H2和CDR-H3的至少两个选自下列：SEQ ID N0:56或SEQ ID N0:62所示的CDR-H1 序列，SEQ ID N0:57或SEQ ID N0:63所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 58或SEQ ID NO:64所示的⑶R-H3序列。例如，单域抗体可以包含VH结构域，其中⑶R-Hl具有 SEQ ID N0:56所示的序列和CDR-H2具有SEQ ID N0:57所示的序列。可选地，单域抗体可以 包含VH结构域，其中CDR-H1具有SEQIDN0:56所示的序列和CDR-H3具有SEQIDN0:58所示 的序列。为了避免疑问，应理解，包括所有排列。
[0093] 在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH单域 抗体，其中VH结构域包含SEQ ID N0:56所示的CDR-H1的序列，SEQ ID N0:57所示的CDR-H2 的序列和SEQ ID从):58所示的0)1?-!13的序列。
[0094] 在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH单域 抗体，其中VH结构域包含SEQ ID N0:62所示的CDR-H1的序列，SEQ ID N0:63所示的CDR-H2 的序列和SEQ ID NO:64所示的CDR-H3的序列。
[0095] 在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化重链VH 单域抗体，dAbHl，其具有图5(a)中给出的序列（SEQ ID N0:52)。包含G4S连接体的适合的 CHl-dAbHl融合物的实例在图6中给出（SEQ ID N0:68)。
[0096] 在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化重链VH 单域抗体，dAbH2,其具有图5(c)中给出的序列（SEQ ID N0:54)。包含G4S连接体的适合的 CHl-dAbH2融合物的实例在图6中给出（SEQ ID N0:69)。
[0097] 抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等人设计的系统进行编号。该系统在 Kabat 等人，1987 ，in Sequences of Proteins of Immunological Interest ?US Department of Health and Human Services，NIH，USA(下文"Kabat等人（同上）"）中提出。 除非另外指出，否则本说明书中使用该编号系统。
[0098] Kabat残基命名并非总是与氨基酸残基的线性编号直接对应^与严谨的Kabat编号 相比，实际的线性氨基酸序列可以包含更少或额外的氨基酸，相当于基本可变结构域结构 的结构组分(构架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。通过将抗体序列中的同源残基与〃标 准〃 Kabat编号序列比对，可以对给定的抗体确定正确的残基Kabat编号。
[0099] 根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35 (CDR-H1)，残基50-65 (〇01?-!12)和残基95-102(001?-!13)。然而，根据(：11(^11丨3((：11(^11丨3，(：.和1^81^， A. M.J. Mol. Biol.，196,901-917,（1987))，相当于 CDR-H1 的环从残基 26 延伸至残基 32。因 此，本文使用的"CDR-ΗΓ包含残基26至35,如由Kabat编号系统和Chothia的拓扑学环定义 的组合描述的。
[0100] 根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR_Ll)，残基50-56 (CDR-L2)和残基89-97 (CDR-L3)。
[0101] 在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL单域抗 体，其包含至少一个下列CDR:关于CDR-L1，具有图5(h)SEQ ID N0:59或图5(n)SEQ ID N0: 65中给出的序列的CDR;关于CDR-L2,具有图5(i)SEQ ID N0:60或图5(o)SEQ ID N0:66中给 出的序列的CDR和关于CDR-L3,具有图5(j)SEQ ID N0:61或图5(p)SEQ ID N0:67中给出的 序列的⑶R。
[0102] 在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL抗 体，其中VL结构域的CDR-LUCDR-L2和CDR-L3的至少两个选自下列：SEQ ID N0:59或SEQ ID N0:65所示的CDR-L1 序列，SEQ ID N0:60或SEQ ID N0:66所示的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 61或SEQ ID NO:67所示的⑶R-L3序列。例如，单域抗体可以包含VL结构域，其中⑶R-Ll具有 SEQIDN0:59所示的序列和CDR-L2具有SEQIDN0:60所示的序列。可选地，单域抗体可以 包含VL结构域，其中CDR-L1具有SEQ ID N0:59所示的序列和CDR-L3具有SEQ ID N0:61所示 的序列。为了避免疑问，应理解，包括所有排列。
[0103] 在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL结构 域抗体，其中VL结构域包含SEQ ID N0:59所示的CDR-L1的序列，SEQ ID N0:60所示的CDR-L2的序列和SEQ ID N0:61所示的CDR-L3的序列。
[0104] 在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL结构 域抗体，其中VL结构域包含SEQ ID N0:65所示的CDR-L1的序列，SEQ ID N0:66所示的CDR-L2的序列和SEQ ID从):67所示的0)1?-1^3的序列。
[0105] 在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化轻链VL 单域抗体，dAbLl，其具有图5(b)中给出的序列（SEQ ID N0:53)。包含G4S连接体的适合的 CHl-dAbLl融合物和Ckl-dAbLl融合物的实例在图6中给出（SEQIDN0:70和SEQIDN0: 72) 。
[0106] 在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化轻链VL 单域抗体，dAbL2,其具有图5(d)中给出的序列（SEQ ID N0:55)。包含G4S连接体的适合的 CHl-dAbL2融合物和Ckl-dAbL2融合物的实例在图6中给出（SEQIDN0:71和SEQIDN0: 73) 。
[0107] 在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包含单域抗体， 并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VH dAb是dAbHl(SEQ IDN0:52)和VLdAb是dAbLl(SEQIDN0:53)。
[0108] 在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在c-末端包含单域抗体， 并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VH dAb是dAbH2(SEQ IDN0:54)