。
[0416] 表 13 [04171
[0418] 纯化的 FabB_645Fv( 1_5xG4S)的 Thermof luor 热稳定性分析
[0419] 将样品（ΙμL约lmg/ml的样品，8μ1 PBS和ΙμL Sypro orange荧光染料的30x储备 液)在384孔板中以一式四份运行。使用7900HT快速实时PCR系统将板从20 °C加热至99 °C并 且测量荧光(在490nm处激发，在530nm处发射）。结果在表14和图17中显示。
[0420] 表 14
[0421]
[0422] 实施例16
[0423] Fab-Fv中的Fv的二硫键稳定
[0424] 用于在哺乳动物细胞中表达的FabB_645dsFv(2xG4S)、FabB_648dsFv(2xG4S)、Fab 厶8-645(18?￥(21643)和？3匕八8-648(18?￥(21643)融合质粒
[0425] 通过诱变PCR在Fv的重链和轻链的构架区中在选择的残基处将点突变引入FabB-645Fv (2xG4S)和FabB-648Fv (2xG4S) DNA序列。引入以产生Fv的重链和轻链之间的链间二硫 键的突变为重链G44C和轻链G100C。除了增加半胱氨酸以在Fv中产生链间二硫键外，还通过 诱变PCR通过将半胱氨酸改变为丝氨酸来除去Fab的重链和轻链之间的天然链间二硫键。包 含链间二硫键的Fv称为dsFv，缺少链间二硫键的Fab称为Fab △。然后将所有这些构建体的 DNA克隆入在HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列控制下的哺乳动物表达载体。将相关重链 和轻链质粒配对，用于在哺乳动物细胞中表达。
[0426] FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)和Fab Δ B-648dsFv(2xG4S)的哺乳动物表达
[0427] 根据厂商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转 染HEK293细胞。简言之，将24yg重链质粒+24yg轻链质粒和120μ1 293fectin+4080yl Optimem培养基一起在RT下温育20分钟。然后将混合物添加至60mL悬浮液中的60xl0 6个 HEK293细胞，并且在37°C下振荡温育4天。所有构建体同样良好表达。
[0428] FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)和Fab Δ B-648dsFv (2xG4S)的蛋白G纯化
[0429] 通过离心澄清哺乳动物表达悬浮液并且使用lOkDa分子量截留离心浓缩器将上清 浓缩至约1.8mL。在16000xg下对浓缩的上清离心10分钟以除去任何沉淀物，然后以lml/分 钟将 1.5mL加载至lml HiTrap蛋白G柱（GE Healthcare)。用20mM磷酸盐，40mM NaCl ρΗ7·4 清洗柱子并且用0.1Μ甘氨酸/HC1 ρΗ2.7洗脱结合的物质。收集洗脱峰（2mL)并且用250yL 1M乙酸钠调节pH至约pH5。使用lOkDa分子量截留离心浓缩器，将pH经调节的洗脱液渗滤入 20mM磷酸盐，150mM NaCl pH7.1中并且浓缩至约250yL。所有构建体具有相似的纯化特征并 且终浓度为0.5-0.8mg/ml。
[0430] FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)和Fab Δ B-648dsFv (2xG4S)对白蛋白的亲和力
[0431 ]如在方法中描述的，测定纯化的FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-648dsFv(2xG4S)构建体对人和小鼠白蛋白的亲和力。Fv的二 硫键稳定没有影响或轻微增加 Fv对人或小鼠白蛋白的亲和力。
[0432] 表15
[0433]
[0434] 纯化的FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)和 Fab Δ B-648dsFv(2xG4S)的SDS-PAGE分析
[0435] 在非还原和还原的条件下制备纯化的？8&13-645(18?￥(21643)、？3&13-648(18卩￥ (2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-648dsFv(2xG4S)样品并且在凝胶上分离和染色， 如在方法中描述的。参见图18。
[0436] 纯化的FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)和 Fab Δ B-648dsFv(2xG4S)的尺寸排阻分析
[0437] 在Superdex20010/300GL Tricorn柱（GE Healthcare)上分析纯化的FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-648dsFv(2xG4S) 样品的大小，用20mM磷酸盐150mM NaCl pH7.4的同溶剂梯度以lml/分钟进行。
[0438] 与其中Fv不具有链间二硫键的Fab-Fv相比较，将链间二硫键导入645Fv或648Fv的 Fv增加单体Fab-Fv种类的量。除去来自Fab-Fv的Fab部分的天然链间二硫键对存在的单体 种类的量仅有小的影响。图19。
[0439] 表16
[0440]
[0441 ]纯化的FabB-645dsFv(2xG4S)、FabB-648dsFv(2xG4S)、Fab Δ B-645dsFv(2xG4S)和 Fab Δ B_648dsFv(2xG4S)的Thermofluor热稳定性分析
[0442] 将样品（ΙμL约lmg/ml的样品，8μ1 PBS和ΙμL Sypro orange荧光染料的30x储备 液)在384孔板中以一式四份运行。使用7900HT快速实时PCR系统将板从20 °C加热至99 °C并 且测量荧光(在490nm处激发，在530nm处发射）。
[0443] 与其中Fv不具有链间二硫键的Fab-Fv相比较，将链间二硫键导入645Fv或648Fv的 Fab-Fv的Fv部分增加了Fv的热稳定性。除去来自Fab-Fv的Fab部分的天然链间二硫键降低 Fab-Fv的Fab部分的热稳定性。
[0444] 表17
[0445]
[0446] n. d.=未检测到。分析软件不能解析该拐点。
[0447] 用于 FabD 的 Biacore 方法
[0448] 通过表面等离子共振(SPR)确定Fab-dAb和Fab-didAb构建体的相互作用的结合亲 和力和动力学参数，所述表面等离子共振在使用CM5传感器芯片和HBS-EP(10mM HETOS (pH7.4)，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%v/v表面活性剂P20)运行缓冲液的Biacore T100上 进行。用人F(ab'）2特异性山羊Fab(Jackson ImmunoResearch，109-006-097)或内部产生的 抗人CH1单克隆抗体将人Fab样品捕获至传感器芯片表面。用小鼠 F(ab'）2特异性山羊Fab (Jackson ImmunoResearch, 115-006-072)捕获小鼠 FAb样品。通过标准胺偶联化学实现捕 获抗体的共价固定。
[0449] 各个测定循环由下列步骤组成：首先用1分钟注射捕获Fab-dAb或Fab-didAb构建 体，然后进行由抗原的3分钟注射组成的结合阶段，之后监控解离5分钟。各个循环后，通过 40mM HC1的2x 1分钟注射，随后5mM NaOH的30秒注射来再生捕获表面。使用的流速为10μ1/ 分钟（用于捕获），30μ1/分钟（用于结合和解离阶段），和10μ1/分钟（用于再生）。
[0450]关于动力学测定，进行抗原的滴定(对于人或小鼠血清白蛋白，一般62.5ηΜ-2μΜ; 对于IL-Ιβ，1.25-40ηΜ;对于细胞表面受体D，20-1.25ηΜ)，空白流动池用于参照扣除，且包 括缓冲液空白注射以减去仪器噪音和偏差。
[0451] 使用Biacore Τ100评估软件，通过所得的传感图至标准1:1结合模型的同时全局 拟合，确定动力学参数。
[0452] 为了检验同时结合，在捕获的Fab-dAb上注射5μΜ HSA或100nM IL-Ιβ或5μΜ HSA和 100ηΜ IL-Ιβ的混合溶液的3分钟注射。以相同的方式，使用2μΜ HSA或MSA和20ηΜ小鼠细胞 表面受体D的终浓度评估白蛋白和细胞表面受体D的同时结合。
[0453] 实施例17
[0454] mFabC-md i dAb 和 mFabD-md i dAb 的哺乳动物表达
[0455]根据厂商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转 染HEK293细胞。简言之，将2yg重链质粒+2yg轻链质粒与10μ1 293fectin+340yl Optimem培 养基一起在RT下温育20分钟。然后，将混合物添加至悬浮液中的5xl06个HEK293细胞并且在 37°C在振荡下温育6天。
[0456] ELISA
[0457] 使用夹心ELISA测量mFab-mdidAb的产量。简言之，用抗CH1抗体捕获mFab-mdidAb， 然后用抗κ-HRP显示。
[0458] 表18
[0459]
[0460] 实施例18
[0461 ] 进行进一步的动力学分析以评估血清白蛋白和人0X40与纯化的FabB-didAb，-dAbLl(CK-G4Sx2)&-dAbHl(CHl-G4Sx2)和FabB-didAb，-dAbL2(CK-G4Sx2)&-dAbH2(CHl-G4Sx2)融合物的相互作用（表 lghFabB-didAbrdAbLKCK-GASxSA-dAbHKCHl-GASxS)和 FabB-d i dAb，-dAbL2 (CK-G4Sx2) &-dAbH2 (CHI -G4Sx2)都保留 了原始FabB对人0X40 的亲和力 (表20)。
[0462] 通过下列评估FabB-didAb，-dAbLl (CK-G4Sx2 )&-dAbHl (CHl-G4Sx2)和FabB-didAb ，-dAbL2 (CK-G4Sx2 )&-dAbH2 (CHl-G4Sx2) 构建体 同时结合人或小鼠血清白蛋 白和人 0X40的潜力:将各个Fab-didAb构建体捕获至传感器芯片表面，然后进行2μΜ白蛋白（人或小 鼠）或50ηΜ人0X40,或2μΜ白蛋白和50ηΜ 0X40的混合溶液的分开的3分钟注射。对于每一个 Fab-didAb构建体，都观察到了HSA结合。对于每一个Fab-didAb构建体，对组合的白蛋白/ 0X40溶液观察到的响应几乎与独立的注射的响应的总和相同（概述于表21)。这表明Fab-didAb 能够同 时结合 0X40 和血清 白蛋白 。原始 FabB 仅结合 0X40 ， 没有显 著结合人或小 鼠白蛋 白。
[0463] 表19
[0464]
[0465] 测定的HSA和MSA结合Fab-d i dAb融合物的亲和力和动力学参数。
[0466] 表20
[0467]
[0468] h0X40-Fc结合FabB和FabB-didAb融合物的亲和力和动力学参数。
[0469] 表21
[0470]
[Ckw I」 衣並不<土0Γ力U 仕匀、J ilbAgJCMbA现]!UA4l)-r C，gXJ土匀、J 日、tfj H ig 1=1 C 后，对各个构建体观察到的结合响应(RU)。在各个情况下，终浓度为2μΜ(白蛋白HSA)和50nM (h0X40-Fc)。单独的白蛋白和h0X40-Fc的响应的总和在括号中显示。
[0472] 实施例19
[0473] 进行进一步的动力学分析以评估血清白蛋白和小鼠细胞表面受体0与11^&匕0-md i dAb，-mdAbL 1 (CK-G4Sx2) &mdAbHl (CHI-G4Sx2)和 mFabD-md i dAb，-mdAbL2 (CK-G4Sx2) & mdAbH2(CHl-G4Sx2)的相互作用（表SShmFabD-mdidAb对HSA都表现出相对高的亲和力结合 (分别地 KD = 2.78nM和 8.9711]\〇。11^^^〇11(1丨(^13,11(^乩2(0(-643叉2)&111(^诎2(011-643叉2)还 以相似的亲和力(K D = 22nM)结合MSA，然而没有观察到mFabD-mdidAb，-mdAbLl(CK-G4Sx2)& mdAbHl ( CH1-G4Sx2 )与MSA的结合。2个mFabD-mdidAb都保留了原始mFabD对小鼠细胞表面受 体D的亲和力(表23)。
[0474] 通过下列评估 rnFabD-mdidAb，_mdAbLl (CK_G4Sx2)&mdAbHl (CH1_G4Sx2)和 mFabD-mdidAb，-mdAbL2 (CK-G4Sx2) &mdAbH2 (CHI-G4Sx2)同时结合人或小鼠血清白蛋白和小鼠细胞 表面受体D的潜力:将各个mFab-mdidAb构建体捕获至传感器芯片表面，然后进行2μΜ白蛋白 (人或小鼠）或20ηΜ小鼠细胞表面受体D，或2μΜ白蛋白和20ηΜ细胞表面受体D的混合溶液的 分开的3分钟注射。再次，对于2种mFab-mdidAb构建体，都观察到HSA结合，而仅mFabD-mdidAb，-mdAbL2(CK-G4Sx2)&mdAbH2(CHl-G4Sx2)结合 MSA。对于每一个 mFab-mdidAb 构建体， 对组合的白蛋白/细胞表面受体D溶液观察到的响应几乎与独立的注射的响应的总和相同 (概述于表24)。这表明mFab-mdidAb能够同时结合细胞表面受体D和血清白蛋白。原始mFabD 仅结合细胞表面受体D，没有显著结合人或小鼠白蛋白。
[0475] 表22
[0476]
[0477] 测定的HSA 和 MSA 结合 mFabD-mdidAb，-mdAbLl (CK-G4Sx2 )&mdAbHl ( CH1-G4Sx2 )和 mFabD-md i dAb，-mdAbL2 (CK-G4Sx2) &mdAbH2 (CH1 -G4Sx2)的亲和力和动力学参数。
[0478] 表23
[0479]
[0480] 小鼠细胞表面受体D_Fc结合mFabD，mFabD-mdidAb，-mdAbLl (CK_G4Sx2)&mdAbHl (CHI-G4SX2)和 mFabD-mdidAb，-mdAbL2(CK-G4Sx2)&mdAbH2(CHl-G4Sx 2)的亲和力和动力学 参数。
[0481] 表24
[0482]
[0484] 上表显示在分别注射HSA或MSA或小鼠细胞表面受体D-Fc，或注射预混合的白蛋白 和小鼠细胞表面受体D-Fc后，对各个构建体观察到的结合响应(RU)。在各个情况下，终浓度 为2μΜ(白蛋白HSA)和20nM(小鼠细胞表面受体D-Fc)。单独的白蛋白和小鼠细胞表面受体D-Fc的响应的总和在括号中显示。
[0485] 实施例20
[0486] 进行进一步的分析以评估 rnFabD-mdidAb，-mdAbLl (CK_G4Sx2)&mdAbHl (CH1_G4Sx2) 或 mFabD-md i dAb，_mdAbL2 ( CK_G4Sx2 ) &mdAbH2 (CHI _G4Sx2 )与血清白蛋白和细胞表面上表达 的小鼠细胞表面受体D的同时的相互作用。2种mFabD-mdidAb都能够同时结合FITC标记的 HSA和活化的小鼠 T细胞的细胞表面上表达的细胞表面受体X(图11) ^FabD能够结合活化的 小鼠 T细胞的细胞表面上表达的细胞表面受体X(数据未显示），但不结合FITC标记的HSA。
[0487] 本说明书还包括下列内容：
[0488] 1.多价抗体融合蛋白，其包含具有针对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部 分，例如Fab或Fab'片段，并且还包含具有针对第二目的抗原的特异性的两个单域抗体 (dAb)，其中所述两个单域抗体通过二硫键连接。
[0489] 2.根据实施方式1的多价抗体融合蛋白，其中所述第一抗原和第二抗原是不同的 实体。
[0490] 3.根据实施方式1或2的多价抗体融合蛋白，其中所述两个单域抗体是Vh/W对。 [0491] 4.根据实施方式4的多价抗体融合蛋白，其中所述Vh dAb直接或间接地连接至Fab 或Fab'的重链。
[0492] 5.根据实施方式4或5的多价抗体融合蛋白，其中所述VL dAb直接或间接地连接至 Fab或Fab'的轻链重链。
[0493] 6.根据实施方式4的多价抗体融合蛋白，其中所述Vh dAb直接或间接地连接至Fab 或Fab'的轻链。
[0494] 7.根据实施方式4或6的多价抗体融合蛋白，其中所述Vl dAb直接或间接地连接至 Fab或Fab'的重链。
[0495] 8.根据实施方式1至7任一项的多价抗体融合蛋白，其中所述第二抗原是白蛋白。
[0496] 9.根据实施方式8的多价抗体融合蛋白，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
[0497] 10.双特异性抗体融合蛋白，其包含具有针对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋 白部分，例如Fab或Fab'片段，并且还包含具有针对第二目的抗原的特异性的单域抗体 (dAb)，所述单域抗体结合人血清白蛋白并且其中所述单域抗体是包含至少一个下列CDR的 重链VH单域抗体：用于CDR-H1的具有图5(e)SEQ ID N0:56或图5(k)SEQ ID N0:62中给出的 序列的CDR;用于CDR-H2的具有图5(f)SEQIDN0:57或图5(l)SEQIDN0 :63中给出的序列 的CDR;和，用于CDR-H3的具有图5(g)SEQ ID N0:58或图5(m)SEQ ID N0:64中给出的序列的 CDR 〇
[0498] 11.双特异性抗体融合蛋白，其包含具有针对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋 白部分，例如Fab或Fab'片段，并且还包含具有针对第二目的抗原的特异性的单域抗体 (dAb)，所述单域抗体结合人血清白蛋白并且其中所述单域抗体是包含至少一个下列CDR的 轻链VL单域抗体：用于CDR-L1的具有图5(h)SEQ ID N0:59或图5(n)SEQ ID N0:65中给出的 序列的CDR;用于CDR-L2的具有图5(i)SEQ ID N0:60或图5(o)SEQ ID N0:66中给出的序列 的CDR;和，用于CDR-L3的具有图5(j)SEQ ID N0:61或图5(p)SEQ ID N0:67中给出的序列的 CDR 〇
[0499] 12.双特异性抗体融合蛋白，其包含具有针对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋 白部分，例如Fab或Fab'片段，并且还包含具有针对第二目的抗原的特异性的单域抗体 (dAb )，所述单域抗体结合人血清白蛋白并且其中所述单域抗体包含选自下列的1、2、3、4、5 或6个CDR:具有SEDIDN0.56所示的序列的CDRH1 ;具有SEDIDN0.57所示的序列的CDRH2; 具有SEDIDN0.58所示的序列的CDRH3;具有SEDIDN0.59所示的序列的CDRL1;具有SED IDN0.60所示的序列的CDRL2 ;和，具有SEDIDN0.61所示的序列的CDRL3。
【主权项】
1. 多价抗体融合蛋白，其 包含具有针对目的抗原的第一特异性的Fab或Fab '片段，并且还 包含具有针对第二目的抗原的特异性的两个单域抗体(dAb)， 其中所述两个单域抗体通过二硫键连接，所述两个单域抗体是互补的VH/VL对， 其中Vh dAb直接或间接地连接至Fab或Fab'的重链， 其中Vl dAb直接或间接地连接至Fab或Fab '的轻链； 其中所述VH单域抗体包含： 用于⑶R-H1的由图5(k)SEQ ID N0:62中给出的序列组成的⑶R; 用于⑶R-H2的由图5(1)SEQ ID N0:63中给出的序列组成的⑶R;和 用于⑶R-H3的由图5(m)SEQ ID N0:64中给出的序列组成的⑶R;且 其中所述VL单域抗体包含： 用于CDR-L1的由图5(n)SEQ ID N0:65中给出的序列组成的CDR; 用于CDR-L2的由图5(o)SEQ ID N0:66中给出的序列组成的CDR;和 用于CDR-L3的由图5(p)SEQ ID N0:67中给出的序列组成的CDR。2. 根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中所述Fab或Fab'片段针对其具有第一特异 性的目的抗原和所述两个单域抗体针对其具有特异性的第二目的抗原是不同的实体。3. 根据权利要求1或2的多价抗体融合蛋白，其中所述两个单域抗体针对其具有特异性 的第二目的抗原是白蛋白。4. 根据权利要求3的多价抗体融合蛋白，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
【专利摘要】本发明涉及一种生物产品。一种多价抗体融合蛋白，其包含具有针对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fabˊ片段)，并且还包含具有针对第二目的抗原的特异性的2个单域抗体(dAb)，其中两个单域抗体通过二硫键连接。还提供具体的双特异性抗体融合蛋白，其包含Fab或Fabˊ片段和可以通过其间的二硫键进行稳定的一个或多个单域抗体。
【IPC分类】C07K16/46
【公开号】CN105601745
【申请号】CN201610114944
【发明人】R·亚当斯, L·汉库克, S·P·海伍德
【申请人】Ucb医药有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2009年9月25日
【公告号】CA2737241A1, CN102164965A, CN102164965B, EP2334705A1, US20110184152, WO2010035012A1, WO2010035012A9