和VLdAb是dAbL2(SEQIDN0:55)。
[0109] 在另一个方面中，本发明提供白蛋白结合抗体或其片段，其包含一个或多个上文 提供和在图5(e-p)中的CDR，特别地包含具有SED ID N0.56所示的序列的CDRH1，具有SED IDN0.57所示的序列的CDRH2，具有SEDIDN0.58所示的序列的CDRH3，具有SEDIDN0.59 所示的序列的CDRL1，具有SEDIDN0.60所示的序列的CDRL2，和/或具有SEDIDN0.61所示 的序列的CDRL3。在一个实施方案中，白蛋白结合抗体或其片段包含具有SED ID N0.62所示 的序列的CDRH1，具有SED ID NO.63所示的序列的CDRH2,具有SED ID NO.64所示的序列的 CDRH3，具有SEDIDN0.65所示的序列的CDRL1，具有SEDIDN0.66所示的序列的CDRL2，和/ 或具有SED ID NO.67所示的序列的⑶RL3。所述⑶R可以并入任何适合的抗体构架和并入任 何适合的抗体形式。此类抗体包括完整的抗体和具有功能活性的其片段或衍生物，其可以 是但不限于单克隆、人源化、完全人或嵌合抗体。因此，此类白蛋白结合抗体可以包含具有 全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，和可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、F (ab '）2、Fv、单域抗体、scFv、二、三或四价抗体、双-scFv、双抗体、三抗体(triabody)、四抗 体（tetrabody)和任何上述的表位结合片段（参见例如Hoi 1 iger和Hudson，2005Nature Biotech.23(9):1126_1136;Adair和Lawson，2005，Drug Design Reviews-Online 2(3)， 209-217)。用于产生和制备这些抗体片段的方法是本领域公知的（参见例如Verma等人， 1998，Journal of Immunological ]^1:11〇(18,216，165-181)。多价抗体可以包含多特异性或 可以是单特异性的（参见例如W0 92/22853和W005/113605)。应当理解，本发明的这方面还 延伸至这些白蛋白结合抗体的变体。
[0110] 应理解，此类白蛋白结合抗体，特别是单域抗体可以与任何其他抗体或蛋白或其 他分子缀合，如在任何其他适合的背景中期望或使用的。在一个实例中，如上所述和在图5 (a_d)中所示的单域抗体dAbHl、dAbLl、dAbH2、dAbL2可以并入任何适合的抗体形式或在任 何适合的背景中（例如融合或缀合)用作单域抗体。
[0111] 在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5 (e)中给出的CDR-H1的序列， 图5 (f)给出的CDR-H2的序列和图5 (g)中给出的CDR-H3的序列。
[0112] 在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5 (k)中给出的⑶R-H1的序列， 图5 (1)给出的CDR-H2的序列和图5 (m)中给出的CDR-H3的序列。
[0113] 在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5 (h)中给出的⑶R-L1的序列， 图5 (i)给出的CDR-L2的序列和图5 (j)中给出的CDR-L3的序列。
[0114] 在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5 (η)中给出的⑶R-L1的序列， 图5(〇)给出的CDR-L2的序列和图5(ρ)中给出的CDR-L3的序列。
[0115] 在下列抗体形式中，来自本文序列表的各个序列可以位于对应于天然位置或非天 然位置的位置。天然位置针对所列的标记的CDRH1位置Η1中的相关序列、针对所列的标记的 ⑶RH2位置Η2中的相关序列、所列的标记的⑶RH3位置Η3中的相关序列、所列的标记的⑶RL1 位置L1中的相关序列、所列的标记的CDRL2位置L2中的相关序列、和所列的标记的CDRL3位 置L3中的相关序列。还设想其组合例如Η1和Η2，Η1和Η3，Η1和LI，Η1和L2，Η1和L3，Η2和LI，Η2 和L2，Η2和L3，Η2和Η3，Η3和LI，Η3和L2，Η3和L3，Η1 和Η2和Η3，Η1 和Η2和LI，Η1 和Η2和L2，Η1 和 Η2和L3，Η2和Η3和LI，Η2和Η3和L2，Η2和Η3和L3，Η3和L1 和L2，Η3和L1 和L3，Η3和L2和L3，L1 和 L2和L3，Η1 和Η2和Η3和LI，Η1 和Η2和Η3和L2，Η1 和Η2和Η3和L3，Η2和Η3和L1 和L2，Η2和Η3和L1 和L3，和Η2和Η3和L2和L3，Η3和L1和L2和L3，H1和Η2和Η3和L1和L2，H1和Η2和Η3和L2和L3，H1 和H2和H3和L1和L3，L1和L2和L3和HI和H2，L1和L2和L3和HI和H3，L1和L2和L3和H2和H3，H1 和H2和H3和L1和L2和L3。
[0116]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣:88至93的1、2、3、4、5或6个序列。
[0117]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣:94至99的1、2、3、4、5或6个序列。
[0118]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣:100至105的1、2、3、4、5或6个序列。
[0119]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣:106至111的1、2、3、4、5或6个序列。
[0120]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：112至117的1、2、3、4、5或6个序列。
[0121]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：118至123的1、2、3、4、5或6个序列。
[0122]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：124至129的1、2、3、4、5或6个序列。
[0123]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：130至135的1、2、3、4、5或6个序列。
[0124]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：136至141的1、2、3、4、5或6个序列。
[0125]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：142至147的1、2、3、4、5或6个序列。
[0126]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：148至153的1、2、3、4、5或6个序列。
[0127]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣:154至159的1、2、3、4、5或6个序列。
[0128]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：160至165的1、2、3、4、5或6个序列。
[0129]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：166至171的1、2、3、4、5或6个序列。
[0130]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣:172至177的1、2、3、4、5或6个序列。
[0131]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：178至183的1、2、3、4、5或6个序列
[0132]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：184至189的1、2、3、4、5或6个序列。
[0133]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：190至195的1、2、3、4、5或6个序列。
[0134]在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列，例如选自Sequence ID 吣：196至201的1、2、3、4、5或6个序列。
[0135] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:202。
[0136] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:203。
[0137] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:202和203。
[0138] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:204。
[0139] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:205。
[0140] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:204和205。
[0141] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:206。
[0142] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:207。
[0143] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含Sequence ID N〇:206和207。
[0144] 当本发明的双特异性融合蛋白的单域抗体与白蛋白结合时，单域抗体对白蛋白的 结合亲和力将足以延长Fab或Fab'的体内半衰期。已报道，对白蛋白的小于或等于2.5μΜ的 亲和力将延长体内半衰期（Nguyen，Α·等人（2006)Protein Engineering，Design& Selection，19(7)，291-297)。本发明的单域抗体分子优选具有适用于它们的目的和它们结 合的抗原的结合亲和力。在一个实例中，单域抗体具有高结合亲和力，例如pM(picomolar)。 在一个实例中，单域抗体具有针对抗原的结合亲和力，其为nM或μΜ。可以使用本领域已知的 任何适合的方法测量亲和力，包括本文实施例中描述的使用天然或重组抗原的BIAcore。
[0145] 优选本发明的结合白蛋白的单域抗体分子具有大约2μΜ或更好的结合亲和力。在 一个实施方案中，本发明的单域抗体分子具有大约ΙμΜ或更好的结合亲和力。在一个实施方 案中，本发明的单域抗体分子具有大约500ηΜ或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本 发明的单域抗体分子具有大约200nM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的域 抗体分子具有大约InM或更好的结合亲和力。应当理解，可以使用本领域已知的任何适合的 方法改变本发明提供的和本领域已知的单域抗体的亲和力。因此，本发明还涉及本发明的 结构域抗体分子的变体，其具有针对白蛋白的改进的亲和力。此类变体可以通过大量亲和 力成熟方案获得，包括突变CDR(Yang等人，J.MoL· Biol.，254,392-403,1995)，链改组 (Marks等人，Bio/Technology，10,779-783,1992)，使用大肠杆菌的突变株（Low等人， J.Mol .Biol ·，250,359_368,1996)，DNA改组（Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol ·，8,724_ 733,1997)，噬菌体展示（Thompson等人，J.Mol .Biol · ,256,77-88,1996)和有性PCR (Crameri等人，Nature ,391,288-291，1998)。Vaughan等人（同上）论述了这些亲和力成熟方 法。
[0146] 双特异性融合蛋白的单域抗体可以根据需要提供为单体、二聚体或三聚体。想要 的产品可以通过调整材料所经历的下游加工步骤获得。在一个实施方案中，经加工的材料 以基本上均质的单体形式提供。在一个实施方案中，经加工的材料以基本上均质的二聚体 形式提供。在一个实施方案中，经加工的材料以基本上均质的三聚体形式提供。
[0147] 本发明还提供编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的分离的DNA序列。本发明的 DNA序列可以包含合成的DNA(例如通过化学加工产生的），cDNA，基因组DNA或其任何组合。
[0148] 可以通过本领域技术人员公知的方法获得编码本发明的双特异性抗体融合蛋白 的DNA序列。例如编码抗体片段、连接体和/或dAb的部分或全部的DNA序列可以如期望的从 确定的DNA序列或根据对应的氨基酸序列合成。
[0149] 分子生物学的标准技术可以用于制备编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA 序列。想要的DNA序列可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成。需要时，可使用定点 诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
[0150] 本发明还涉及包含本发明的一个或多个DNA序列的克隆或表达载体。因此，提供包 含一个或多个编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列的克隆或表达载体。在一个 优选实施方案中，克隆或表达载体包含编码完整双特异性抗体融合蛋白的单个DNA序列。因 此，克隆或表达载体包含DNA，其依次编码转录单元以便产生翻译融合蛋白。
[0151]事实上，本领域技术人员理解，本发明的融合蛋白可在N-末端或C-末端具有dAb， 因此编码转录单元的dAb DNA将分别在编码翻译融合物的DNA序列内的最前或最后。因此， 翻译融合物可以包含N-末端dAb和C-末端Fab或Fab'。此外，翻译融合物可以包含N-末端Fab 或Fab '和C_末端dAb。
[0152] 应理解，Fab或Fab '的重链和轻链可以并入相同或不同的载体。在一个实施方案 中，一个载体可以包含翻译融合物，所述翻译融合物包含Fab或Fab '重链和C-末端dAb，并且 另一个载体可以包含翻译融合物，所述翻译融合物包含Fab或Fab '轻链和C-末端dAb。
[0153] 例如，当想要产生在抗体片段的N-末端具有dAb部分的双特异性抗体融合蛋白时， 载体将按以下顺序包含DNA转录单元:编码dAb部分的DNA转录单元，任选地编码连接体序列 的DNA转录单元，和编码抗体片段的DNA转录单元。当想要产生在抗体片段的C-末端具有dAb 部分的双特异性抗体融合蛋白时，载体将按以下顺序包含DNA转录单元:编码抗体片段的 DNA转录单元，任选地编码连接体序列的DNA转录单元，和编码dAb部分的DNA转录单元，所述 dAb部分对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子，或CD35/CR1，例如人血清白蛋白具有特异 性。因此，本发明的翻译融合物可以以不同的构建形式存在，包括，例如但不限于，dAb-连接 体-Fab，Fab-连接体-dAb，dAb-Fab，Fab-dAb，Fab ' -dAb，dAb-Fab '，dAb-连接体-Fab '，Fab ' -连接体-dAb。当使用两个载体时，例如第一载体可以包含与dAb融合的Fab或Fab '的重链和 第二载体可以包含与dAb融合的Fab或Fab'的轻链。
[0154] 如本领域技术人员公知的，包含在本发明的翻译融合物内的抗体片段的DNA编码 可以作为构建体中的转录单元整合入载体，例如转录单元可以包含轻链编码，接着是重链 编码，或反之亦然；参见，特别地，Humphreys等人，2002，Protein Expression and Purification，26:309-320。
[0155] 优选，根据本发明的载体包含合适的前导序列，例如抗体前导序列。此类前导序列 是本领域公知的。
[0156] 构建载体的一般方法，转染和转化方法和培养方法是本领域技术人员公知的。在 这方面，可参考〃Current Protocols in Molecular Biology〃，1999，F.M.Ausubel(ed)， Wiley Inter science, New York 和Cold Spring Harbor Publishing 生产的Maniatis Manual〇
[0157] 还提供包含一个或多个克隆或表达载体的宿主细胞，所述载体包含一个或多个编 码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。任何适合的宿主细胞/载体系统都可以用于 表达编码双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。可以使用细菌，例如大肠杆菌及其他微生物系 统或还可以使用真核（例如哺乳动物）宿主细胞表达系统。适合的哺乳动物宿主细胞包括 NS0、CH0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。因此，在一个实施方案中，本发明的融合蛋白在大肠杆菌中 表达。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白在哺乳动物细胞中表达。
[0158] 本发明还提供用于产生双特异性抗体融合蛋白的方法，其包括在适于从编码所述 双特异性抗体融合蛋白的DNA序列表达蛋白的条件下，培养包含本发明的载体的宿主细胞。 本发明进一步提供用于分离双特异性抗体融合蛋白的方法。
[0159] 在生产上，可以纯化本发明的双特异性抗体融合蛋白，必要时，使用本领域已知的 任何适合的方法。可使用例如，但不限于层析技术，例如离子交换、尺寸排阻、蛋白G或疏水 作用层析。
[0160]可以通过本领域已知的常规方法例如尺寸排阻层析和非还原性SDS-PAGE证实双 特异性抗体融合蛋白的大小。可以使用此类技术以例如证实蛋白不是二聚化的和/或未丢 失部分，例如dAb部分。如果检测到二聚体并且需要均质的单体产品，那么可以使用如上所 述的常规层析技术从二聚体种类中纯化单体双特异性抗体融合蛋白。
[0161] 本发明的双特异性抗体融合蛋白可用于治疗疾病或病症，包括炎性疾病和病症， 免疫疾病和病症，纤维化病症和癌。
[0162] 术语"炎性疾病"或"病症"和"免疫疾病或病症"包括类风湿性关节炎、银肩病性关 节炎、斯蒂尔病(still's disease)、Muckle Wells病、银肩病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、 SLE (系统性红斑狼疮）、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、多发性硬化、脉管炎、I型糖尿病、移 植和移植物抗宿主病。
[0163] 术语"纤维化病症"包括特发性肺纤维化（IPF)、系统性硬化(或硬皮病）、肾纤维 化、糖尿病性肾病、IgA肾病、高血压、终末期肾病、腹膜纤维化(持续非卧床腹膜透析）、肝硬 化、年龄相关的黄斑变性(ARMD )、视网膜病、心肌反应性纤维化、疤痕、瘢痕疙瘩、烧伤、皮肤 溃疡、血管成形术、冠状动脉架桥术、关节形成术和白内障手术。
[0164] 术语〃癌〃包括由上皮引起的恶性新赘生物（在皮肤或更通常地身体器官例如乳 房、卵巢、前列腺、肺、肾、胰腺、胃、膀胱或肠的内衬中发现）。癌倾向于侵袭邻近的组织并且 扩散(转移)至远端器官，例如:至骨、肝、肺或脑。
[0165] 因此，根据本发明的另外的方面，提供了药物组合物，其包括与一个或多个药学上 可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合的本发明的抗体融合物。还提供本发明的抗体融合蛋 白用于制备用于治疗疾病或病症的药物的用途。最优选的，所述疾病或病症是炎性疾病或 病症。
[0166] 根据本发明的药物组合物可以采取适于口服、口腔、胃肠外、皮下、经鼻、局部、眼 睛或直肠施用的形式，或适于通过吸入或喷射施用的形式。
[0167] 需要时，例如如果抗体融合蛋白的单域抗体与白蛋白结合，那么可能期望使用本 领域已知的任何适合的方法将人或重组血清白蛋白与双特异性融合蛋白一起预配制。
[0168] 当药物制剂是液体，例如溶液或悬浮液时，所述制剂可以进一步包含白蛋白例如 人血清白蛋白，特别地重组白蛋白例如重组人血清白蛋白。适合的量可以在小于总制剂的 2 % w/w的范围内，特别地小于1、0.5或0.1 % w/w。这可以有助于稳定制剂中的抗体组分。药 物组合物可以进行冻干以用于随后用水性溶剂重构。
[0169] 在一个实施方案中，提供单位剂量容器，例如小瓶，其包含根据本发明的冻干的〃 抗体"。
[0170] 关于口服施用，药物组合物可以采取例如片剂、锭剂或胶囊的形式，其通过传统方 法使用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙 基甲基纤维素）；填充物(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙）；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石 粉或二氧化硅）；崩解剂(例如马铃薯淀粉或乙醇酸钠）；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)来 制备。可以通过本领域公知的方法包被片剂。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、 糖浆或悬浮液的形式，或它们可以以干的产品的形式存在，所述产品在使用之前用水或其 他适合的媒介物重构。此类液体制剂可以通过传统方法用药学上可接受的添加剂，例如悬 浮剂、乳化剂、非水性媒介物或防腐剂制备。制剂还可以视情况包含缓冲盐、增香剂、着色剂 或甜味剂。
[0171] 用于口服施用的制剂可以适当地进行配制以控制释放活性化合物。
[0172] 关于口腔施用，组合物可以采取以传统方法配制的片剂或锭剂的形式。
[0173] 本发明的双特异性抗体可以配制用于通过注射(例如通过弹丸注射或输注)肠胃 外施用。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在玻璃安瓿瓶或多剂量容器(例如 玻璃小瓶）中。用于注射的组合物可以采取例如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂 的形式，并且可以包含配制剂例如悬浮剂、稳定剂、防腐剂和/或分散剂。可选地，活性成分 可以以粉末形式存在，其在使用之前用适合的媒介物(例如无菌无热原水)构建。
[0174] 除上述制剂之外，本发明的双特异性抗体还可以配制为长效制剂。此类长效制剂 可以通过植入或通过肌内注射施用。
[0175] 关于经鼻施用或通过吸入施用，根据本发明的化合物可以方便地以气雾剂形式递 送，其用加压包装或喷雾器喷射，借助于适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、一氟三氯甲烷、 二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体或气体混合物。
[0176] 需要时，组合物可以置于包装或分配装置(其可以包含一个或多个包含活性成分 的单位剂量形式）中。包装或分配装置可以附有施用说明书。
[0177] 关于局部施用，根据本发明的化合物可以方便地配制到适合的软膏中，所述软膏 包含悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体的活性组分。特别的载体包括例如，矿 物油、液态石油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡和水。可选地，根据本发明的化合物可 配制到适合的洗液中，所述洗液包含悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体的活性 组分。特别的载体包括例如，矿物油、山梨聚糖单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、 鲸蜡硬脂醇、苯甲醇、2_辛基十二烷醇和水。
[0178] 在一个实施方案中，制剂作为用于局部施用(包括吸入)的制剂提供。
[0179]适合的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含推进气体的计量气雾剂