转移与否、复发与否等。 [0064] 2、肺鳞癌转移组织RNA的获取
[0065] 使用Trizol-步法提取肺鳞癌转移组织总RNA，通过Nanodrop ND-1000读取260nm 和280nm处的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射 光下观察，检测RNA的完整性。
[0066] 3、基因芯片杂交及扫描
[0067] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美 国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h，然后 洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0068] 4、芯片数据处理与分析
[0069] 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0070] 5、统计学处理
[0071] 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P〈 0.05差异有显著性意义。
[0072] 6、结果
[0073]结果显示(如图1所示），与未发生转移的肺鳞癌组织相比，已发生转移的肺鳞癌组 织中VSIG10L基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0074] 实施例2 VSIG10L蛋白的差异表达 [0075] 1、研究对象同实施例1。
[0076] 2、提取组织总蛋白
[0077]按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0078] 3、Western blot检测
[0079] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、 显色。
[0080] 4、统计学处理
[0081 ]将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将VSIG10L蛋 白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具有统 计学意义。
[0082] 5、结果
[0083]结果如图2所示，与未发生转移的肺鳞癌组织相比，已发生转移的肺鳞癌组织中 VSIG10L蛋白的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0084] 实施例3 VSIG10L基因在肺鳞癌细胞系中的表达 [0085] 1、细胞培养
[0086] 将肺鳞癌细胞株 NCI-H520，NCI-H596，NCI-H2170、NCI-H226 于 DMEM 培养基和 10% 胎牛血清中培养，将人肺上皮细胞株BEAS-2B于BEGM培养液和10 %胎牛血清中培养，置于37 °C、5%C〇2培养箱中。
[0087] 2、QPCR
[0088] 2.1细胞总RNA提取:利用QINGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按 照说明书指示进行。
[0089] 2.2逆转录
[0090] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
[0091] 2.3QPCR
[0092] (1)引物设计
[0093] 根据Genbank中VS IG10L基因和GATOH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0094] VSIG10L 基因：
[0095] 正向引物为5'-CCCTGGTTCTGAAGTATT-3'（SEQ ID N0.3);
[0096] 反向引物为5'-GGTCTTAACAGTGAAGGA-3'（SEQ ID N0.4)，
[0097] GATOH基因：
[0098] 正向引物为5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0099] 反向引物为5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0100] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0101 ] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0102] 表1 PCR反应体系
[0103]
[0104]
[0105] (3)PCR反应条件：95°C10min，（95°C15s，60°C40s)*45个循环。以SYBR Green作为 荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确 定目的条带，△△ CT法进行相对定量。
[0106] 2.4统计学方法
[0107] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰VSIG10L基因表达组与对照组之间的差异 采用t检验，认为当P〈0.05时具有统计学意义。
[0108] 2.5结果
[0109] 如图3所示，与人肺上皮细胞株BEAS-2B相比，肺鳞癌细胞株NCI-H520，NCI-H596， NCI-H2170、NCI-H226 中 VSIG10L 基因表达明显升高(Ρ〈0·05)。
[0110] 实施例4抑制VSIG10L基因表达
[0111] l、siRNA 设计合成
[0112] 针对 VSIG10L 的 siRNA 序列：
[0113] siRNAl-VSIGlOL：
[0114] 正义链为5'-AAAUAUCAGGAAAUACUUCAG-3'（SEQ ID N0.7);
[0115] 反义链为5'-GAAGUAUUUCCUGAUAUUUCG-3'（SEQ ID N0.8)，
[0116] siRNA2-VSIG10L：
[0117] 正义链为5'-AGAGUUUAAGAUCCAUAUCAU-3'（SEQ ID N0.9);
[0118] 反义链为5'-GAUAUGGAUCUUAAACUCUCU-3'（SEQ ID N0.10)，
[0119] siRNA3-VSIG10L：
[0120] 正义链为5'-UUUUUCUCAGGAGUCUUUCCA-3'（SEQ ID N0.11);
[0121] 反义链为5'-GAAAGACUCCUGAGAAAAAGA-3'（SEQ ID N0.12)
[0122] 阴性对照siRNA序列(siRNA-NC):
[0123] 正义链为5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（SEQ ID N0.13);
[0124] 反义链为5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（SEQ ID N0.14)。
[0125] 2、肺鳞癌转移细胞的培养与转染
[0126] 培养NCI-H520细胞，步骤同实施例3。
[0127] 将NCI-H520细胞按1 X 104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%C02培养箱中 细胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000 (购自于Invi trogen公司）的说明书转染，实验 分为阴性对照组和实验组(20nM)，其中，阴性对照组siRNA与VSIG10L基因的序列无同源性， 浓度为20nM/孔，同时分别转染。
[0128] 3、利用QPCR实验检测s iRNA的干扰效率。
[0129] 步骤同实施例3。
[0130] 结果如图 4 所示，与 siRNAl-VSIG10L、siRNA3-VSIG10L 相比，siRNA2-VSIG10L 能够 更有效的抑制VSIG10L基因的表达，差异具有统计学意义(P〈0.05)，使用siRNA2-VSIG10L进 行后续的实验。
[0131] 4、Western blot实验检测siRNA2-VSIG10L的干扰效率
[0132] 步骤同实施例2。
[0133] 结果如图5所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA2-VSIG10L的细胞中VSIG10L 蛋白的含量明显降低，差异具有统计学意义(P