〈〇.05)。
[0134] 实施例5研究VSIG10L基因表达对肺鳞癌细胞粘附能力的影响
[0135] 1、细胞培养与转染同实施例4。
[0136] 2、细胞粘附实验
[0137] 将转染48h的NCI-H520细胞使用0.25%胰酶消化成细胞悬液，以5X104个/ml接种 于96孔细胞培养板，每孔0. lml，60min后，37°CPBS洗去未粘附的细胞，MTT法测各孔490nm波 长光吸收值。用光吸收值大小代表粘附活细胞的相对数量。
[0138] 3、结果
[0139] siRNA2-VSIG10L组相对光密度值为0.148 ±0.056, siRNA-NC组相对光密度值为 1.527±0.132。与siRNA-NC组相比，siRNA2-VSIG10L组光吸收值显著下降(P〈0.05)。上述实 验结果表明抑制VSIG10L表达能够显著抑制NCI-H520细胞粘附能力，同时表明VSIG10L有利 于NCI-H520细胞粘附。
[0140] 实施例6研究VSIG10L基因表达对肺鳞癌细胞迀移、侵袭能力的影响
[0141] 1、细胞培养与转染同实施例4。
[0142] 2、迀移实验
[0143] 转染48h的NCI-H520细胞使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mL EP管中， 加入200yL无血清培养基重悬细胞，加入transwell小室中，下层小室加入10%胎牛血清的 DMEM培养基，放入37°C，5 %C02孵箱培养24h。取transwel 1小室，用棉签擦除里面的细胞，并 用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
[0144] 3、侵袭实验
[0145] 转染48h的NCI-H520细胞使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mL EP管中， 加入200yL无血清培养基重悬细胞，加入经过铺基质胶的transwell小室中，下层小室加入 10%FBS的DMEM培养基，放入37°C，5%C0 2孵箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦除里面 的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
[0146] 4、结果
[0147] 迀移实验：与siRNA-NC组相比，siRNA2_VSIG10L组穿过transwell小室基底膜的细 胞减少了约78 %。
[0148] 侵袭实验：与siRNA-NC组相比，siRNA2-VSIG10L组穿过已经铺过基质胶的 transwell小室基底膜的细胞减少了72% 〇
[0149] 上述实验结果表明，抑制VSIG10L表达能够显著抑制NCI-H520细胞迀移、侵袭能 力，同时表明VSIG10L基因表达有利于NCI-H520细胞的迀移和侵袭。
[0150] 实施例7肺鳞癌细胞抗体中和实验
[0151] 1、细胞培养同实施例4。
[0152] 2、迀移实验
[0153] 将细胞分为两个处理组，
[0154] 实验组1(对照组）:NCI_H520细胞中加入无关单抗(1:50);
[0155] 实验组2: NCI-H520细胞中加入抗人VSIG10L单抗(1:50)。
[0156] 将NCI-H520细胞在37°(：、5^^02培养箱孵育作用24小时后，使用胰酶消化并计数， 取1〇 5个细胞置于1.5mL EP管中，加入200yL无血清培养基重悬细胞，加入transwel 1小室 中，下层小室加入10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37°C，5%C02孵箱培养24h。取 transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微 镜下取8个随机视野进行计数。
[0157] 3、侵袭实验
[0158] 将细胞分为两个处理组，
[0159] 实验组1(对照组）：NCI_H520细胞中加入无关单抗(1:50);
[0160] 实验组2:NCI-H520细胞中加入抗人VSIG10L单抗(1:50)。
[0161] 将NCI-H520细胞在37°(：、5^^02培养箱孵育作用24小时后，使用胰酶消化并计数， 取1〇 5个细胞置于1.5mL EP管中，加入200yL无血清培养基重悬细胞，加入经过铺基质胶的 transwell小室中，下层小室加入10%FBS的DMEM培养基，放入37°C，5%C02孵箱培养24h。取 transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微 镜下取8个随机视野进行计数。
[0162] 4、结果
[0163] 迀移实验：与对照组相比，抗人VSIG10L单抗的细胞组穿过transwell小室基底膜 的细胞减少了约64 %。
[0164] 侵袭实验：与对照组相比，抗人VSIG10L单抗的细胞组穿过已经铺过基质胶的 transwell小室基底膜的细胞减少了68%。
[0165] 上述实验结果表明，抑制VSIG10L蛋白功能能够显著抑制NCI-H520细胞迀移、侵袭 能力，同时表明VSIG10L蛋白有利于NCI-H520细胞的迀移和侵袭。
[0166] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测VSIG10L基因表达的产品在制备诊断肺鳞癌转移的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、 免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测VSIG10L基因表达以诊断肺鳞癌转移的产 品；所述用RT-PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括一对特异扩增VSIG10L基因的引物;所述 用实时定量PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括一对特异扩增VSIG10L基因的引物;所述用 免疫检测诊断肺鳞癌转移的产品包括:与VSIG10L蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交 诊断肺鳞癌转移的产品包括:与VSIG10L基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断肺鳞 癌转移的产品包括:蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与VSIG10L蛋白特异性结合 的抗体，基因芯片包括与VSIG10L基因的核酸序列杂交的探针。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断肺鳞癌转移的产 品至少包括的一对特异扩增VSIG10L基因的引物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。4. 一种诊断肺鳞癌转移的工具，其特征在于，所述工具包括检测VSIG10L基因表达的试 剂;所述试剂包括检测VSIG10L基因 mRNA的引物和/或探针、检测VSIG10L蛋白的抗体。5. 根据权利要求4所述的工具，其特征在于，所述检测VSIG10L基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。 6. VSIG10L基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗肺鳞癌转移的药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制VSIG10L基因表达的 试剂、和/或抑制VS IG10L基因表达产物的试剂。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制VSIG10L基因表达产物的试剂包 括抑制针对VS IG 10L基因的s iRNA、和/或VS IG 10L蛋白的抗体。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述针对VSIG10L基因的siRNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。10. -种用于治疗肺鳞癌转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要 求6-9中任一项所述的抑制剂。
【专利摘要】本发明公开了一种基因标记物，该基因标记物是VSIG10L。VSIG10L可用于判断肺鳞癌是否发生转移或者预判肺鳞癌转移风险。另外，VSIG10L还可以用于制备抑制肺鳞癌转移或预防肺鳞癌转移的药物。本发明为临床在分子水平上诊断肺鳞癌转移提供了新的诊断方法，同时为肺鳞癌转移的基因治疗提供了新的药物靶点。
【IPC分类】G01N33/574, A61K45/00, G01N33/68, A61P35/02, C12Q1/68
【公开号】CN105648103
【申请号】
【发明人】杨承刚, 孙耀兰, 林慧芳
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月31日