专利名称：真空渗透辅助大豆原位丛生芽转化的方法
技术领域：
本发明涉及一种真空渗透辅助大豆原位丛生芽转化的方法，是一种生物培养的工艺，属于生物技术和现代农业技术领域。
为实现这样的目的，本发明的技术方案中，采用农杆菌转化腋芽分生组织区的方式，在大豆转化过程中辅助采用真空渗透法，来达到提高转化率的效果。本发明先将大豆种子消毒后放在萌发培养基上萌发五天，去除顶芽，并造成表皮分生细胞损伤，作为外植体放在预培养基上预培养，再进行真空条件下农杆菌感染，放在共培养基上共培养。通过在0.06-0.08MPa真空压力条件下、处理10～20分钟后，放在含有卡那霉素的除菌培养基上除菌，放在芽伸长培养基上筛选不定芽，然后在生根培养基上诱导生根移栽，得到较多的再生苗和转化的大豆植株。
本发明的具体方法包括如下步骤1、大豆种子经过消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天，去顶芽并制造伤口，得到外植体，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基预培养一天。
2、在0.06-0.08MPa真空压力条件下，农杆菌感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上共培养3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L(PH5.8)培养基上除菌2周。
3、除菌后的外植体放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH5.8)培养基上，每2周转接一次，进行筛选至出现不定芽。伸长到1～2cm时切除子叶，至伸长到3～4cm。
4、切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆直至获得转化植株产生的种子。
本发明的方法简单易行，具有突质性特点和显著进步，与用子叶、子叶节等外植体相比，用本发明的外植体进行转化，在一定的超声波条件下、一定的时间处理后，进行共培养转化更易再生不定芽。这些再生不定芽能更易伸长成植株，具有较高的转化率；培养时间80～110天，能缩短20～30天。与普通农杆菌介导的方法相比，转化率更是大幅度提高。
种子消毒后接种在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天；去顶芽制造伤口得到外植体；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上预培养1天；在0.06MPa真空压力条件下，感染具有B.t.基因农杆菌10分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培养基上共培养3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L培养基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培养基上每2周转接一次，筛选至出现不定芽，长至1～2cm时切除子叶，至伸长到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培养基上诱导生根15天；移栽到大盆，获得转B.t.基因的大豆植株合丰35号71株。
种子消毒后接种在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天；去顶芽制造伤口得到外植体；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上预培养1天；在0.08MPa真空压力条件下，感染具有gna.基因农杆菌15分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培养基上共培养3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L培养基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培养基上每2周转接一次，筛选至出现不定芽，长至1～2cm时切除子叶，至伸长到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培养基上诱导生根18天；移栽到大盆，获得转gna基因的大豆植株合丰35号77株。
种子消毒后接种在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天；去顶芽制造伤口得到外植体；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上预培养1天；在0.07MPa真空压力条件下，感染具有pta基因农杆菌20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培养基上共培养3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L培养基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培养基上每2周转接一次，筛选至出现不定芽，长至1～2cm时可切除子叶，至伸长到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培养基上诱导生根20天；移栽到大盆，获得转pta基因的大豆植株合丰35号74株。
本发明的方法适合于大豆转各种基因，能快速、较高频率得到大豆转化植株。
权利要求
1.一种真空渗透辅助大豆原位丛生芽转化的方法，其特征在于包括如下具体步骤1)大豆种子经过消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天，去顶芽并制造伤口，得到外植体，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基预培养一天；2)在0.06-0.08MPa真空压力条件下，农杆菌感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上共培养3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L(PH5.8)培养基上除菌2周；3)除菌后的外植体放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH5.8)培养基上，每2周转接一次，进行筛选至出现不定芽，伸长到1～2cm时切除子叶，至伸长到3～4cm；4)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆直至获得转化植株产生的种子。
全文摘要
一种真空渗透辅助大豆原位丛生芽转化的方法，将种子经过消毒放在萌发培养基上萌发，取去除顶芽后的外植体，放在预培养基上预培养，在真空条件下进行一定时间的农杆菌感染处理后，放在共培养基上共培养。取出后放在含有卡那霉素的除菌培养基上除菌，放在芽伸长培养基上筛选不定芽，然后诱导生根移栽。本发明采用农杆菌转化腋芽分生组织区的方式，在感染过程中采用真空渗透的方法，从而提高转化率，得到较多的转化植株。
文档编号A01H3/00GK1411704SQ0215077
公开日2003年4月23日 申请日期2002年11月28日 优先权日2002年11月28日
发明者武天龙, 马晓红, 邱承祥, 唐冬梅 申请人:上海交通大学