专利名称：大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，是一种利用真空渗透辅助手段将外源基因导入大豆，从而改良大豆的遗传性状的的操作方法，属于生物技术和现代农业技术领域。
为实现这样的目的，本发明在大豆转化过程中辅助采用真空渗透法，在农杆菌介导BT基因对大豆茎尖转化的过程中，采用大豆种子消毒后萌发、去除顶芽，并造成表皮分生细胞损伤，作为外植体，在0.06MPa-0.08MPa真空压力条件下处理10～20分钟，进行农杆菌感染，在萌发培养基上进行共培养，用80mg/L硫酸卡那霉素加入芽伸长培养基和50mg/L硫酸卡那霉素加入生根培养基进行筛选，能得到较多的再生苗和转化的大豆植株。
本发明的具体方法包括如下步骤1)取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗4～5次，然后将种子置于无菌水中浸泡18～24小时，使种子萌发。
2)剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
3)在0.06MPa-0.08Mpa的真空压力条件下，农杆菌感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，侵染完毕，将材料取出，用无菌滤纸吸干，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
4)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
5)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2～3cm。
6)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
本发明采用真空渗透法在外植体上制造微小伤口，充分的提高了农杆菌入侵的机会，明显的提高了农杆菌的感染效率，有效的提高了出芽数量和转化苗的数量。达到出芽多，再生苗能力强，形成高频的转化植株的效果。与普通农杆菌介导的方法相比，转化率大幅度提高。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗4次，然后将种子置于无菌水中浸泡18小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
将预培养的茎尖取出，置于0.06MPa真空压力条件下，农杆菌感染10分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转按一次，至不定芽出现伸长到2cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株东43号36株。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗5次，然后将种子置于无菌水中浸泡24小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
将预培养的茎尖取出，置于0.08MPa真空压力条件下，农杆菌感染15分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到3cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株吉林27号36株。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗5次，然后将种子置于无菌水中浸泡19小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
将预培养的茎尖取出，置于0.07MPa真空压力条件下，农杆菌感染20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根18天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株合丰35号35株。
用本发明的方法能适合于大豆转各种基因，能快速得到较高频率的大豆转化植株。
权利要求
1.一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，其特征在于包括如下步骤1)大豆种子冲洗后放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗后将种子置于无菌水中浸泡18～24小时，使种子萌发；2)剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时；3)在0.06-0.08MPa真空压力条件下，农杆菌感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，然后放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天；4)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基；5)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固体)每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2～3cm；6)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
全文摘要
一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，在农杆菌介导BT基因对大豆茎尖转化的过程中，采用大豆种子消毒后萌发、去除顶芽，并造成表皮分生细胞损伤，作为外植体，在真空压力条件下进行农杆菌感染处理，在萌发培养基上进行共培养，用一定量的硫酸卡那霉素加入芽伸长培养基和生根培养基进行筛选，能得到较多的再生苗和转化的大豆植株。本发明采用真空渗透法在外植体上制造微小伤口，充分的提高了农杆菌入侵的机会，明显的提高了农杆菌的感染效率，有效的提高了出芽数量和转化苗的数量。
文档编号A01C1/00GK1412307SQ0215077
公开日2003年4月23日 申请日期2002年11月28日 优先权日2002年11月28日
发明者武天龙, 邱承祥, 马晓红 申请人:上海交通大学