专利名称：一种用生物反应器培养葛仙米的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种利用生物反应器生产培养葛仙米的方法。
背景技术：
葛仙米是一种蓝藻，原名“天仙米”，学名拟球形念珠藻(Nostoc sphaeroides)，是蓝藻纲，念珠藻科，念珠藻属的一个种。葛仙米是席上珍品，食疗珍品，药膳珍品。它甚称天下佳肴，名贵山珍。我国人民食用蓝藻的文字记载是世界上历史最悠久的，对葛仙米的认识也以有2000年了。据世界名著《本草纲目》记载“葛仙米，生湖广沿溪山穴石上，遇大雨冲开穴口，此米随流而出。土人捞取，初取时如小鲜木耳，紫绿色，以醋拌之，肥绝可食。土名天仙菜，干则天仙米……。晋葛洪(注东晋人，医学家，炼丹家，道教伦理家)隐此乏粮，采以为食，故名”。据鄂西先民世代传颂的传说，晋朝葛洪南贬途径走马患疾，迫灾荒采葛仙米以食之，奇获身疾康复之功效。后，洪入朝歌，以此奉献皇上，体弱多病的太子食之，病除体壮，皇帝娘娘食之，四处求医无法治愈的夜盲症病除，皇感洪恩，随将“天仙米”赐名“葛仙米”。葛仙米营养丰富，蛋白质含量高(52-56％)，氨基酸组分齐全，含有丰富的生物活性多糖(8-12％)，维生素含量是猕猴桃的3倍以上，比柑橘高15倍，其含量接近鲜枣；富含不饱和脂肪酸和多种矿质元素如P.S.K.Ca.Fe.Se等十分丰富。因此，葛仙米具有强身健体和许多医疗保健等功效。据《全国中草药汇编》介绍“葛仙米性寒、味淡，可以清热、收敛、益气、明目。主治夜盲症、脱肛，外用可治烧伤，烫伤。”由于葛仙米的生态生境比较特殊，葛仙米的生长对自然条件的选择极为严格。它的生长繁殖受生态条件所限制，因而在国内，仅在我国个别山区的少数稻田中生长。葛仙米要求的生长条件是多种多样的，如矿质营养，温度，光照，水的酸碱度，以及有无有害气体、农药、自然天敌等。全球气候变暖，环境变化和污染已不是短期内凭一部分人的意志可以改变的，欲求粮食的丰收，农药与化肥的使用也不可避免。于是矛盾就出来了，一方面是葛仙米产量下降，产品质量逐步降低；而人们的需求上升，另一方面是产地减少，加上大量采收，自然生态遭到破坏，使得本来就贫乏葛仙米的产量不断下降。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用生物反应器培养葛仙米的方法，此方法易行，操作方便，适宜工业化生产；解决了葛仙米生长快，产量高、成本低的问题。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施A、培养液配制将称好或配制好的贮藏液加入水中的顺序是按每升水中加入硫酸镁0.07-0.08g、氯化钙0.03-0.042g、柠檬酸0.005-0.007g、柠檬铁铵0.005-0.007g、乙二酸四乙酸二钠盐(EDTA)0.001-0.002g、碳酸钠0.03-0.05g、微量元素A51mL、磷酸氢二钾0.07-0.09g，即可得培养液。
B、葛仙米种子制备1)一级种子由试管原种接到小三角瓶(150ml)，静止培养或通气培养；培养到出现细微小颗粒后转入二级种子培养。
2)二级种子由一级种子接到500-1000ml培养瓶通气培养，达到微小圆珠状后进入三级种子培养。
3)三级种子由二级种子接入到5-10L培养瓶进行养殖，葛仙米颗粒达到小颗粒状时，转入规模化养殖容器中(10L以上容器)进行生产。
4)二或三级培养物得到的球形体长到约直径0.8-1.2mm的培养物就可作为大量培养的接种种源；也可用收获物中通过筛滤出的直径在1-1.5mm的葛仙米小球体作为种子继续培养。
C、生物反应器培养(普通生物反应器)1)采用一般生物反应器该装置可以控制温度、光强、营养液及通气条件等；控制温度28-30℃，光强80-100μE.m-2.s-1，容积180-240l/个。
2)培养场地与培养器可在室内或塑料大棚中，有条件的地方也可在玻璃温室安置光生物反应器。并配备一个孔径约0.5cm的不锈钢筛，用来筛选合格的球形体。
3)接种与培养按每升培养液0.5-2g湿重的比例接种于光生物反应器中。用空气充气泵通气(通气起到搅动和提供CO2的作用)以5-10L/min的速度从通气口通气。为了减少气体对培养物的污染，进入反应器之前，将气体以棉花过滤。通气量由阀门控制。
D、监控建立的监控条件和标准。温度25-30℃；光强700-800μE.m-2.s-1pH8.0-8.5；其它细菌(主要有粘细菌)、真菌(主要为霉菌类)和杂藻(主要有小球藻等单细胞绿藻)检测(1)涂平板法将培养液涂布在细菌培养的基本培养基上，37℃温培24小时后，观察是否由菌落出现；(2)显微观察取少量培养液，加入DAPI(一种荧光染料)至终浓度1μg/ml染色5分钟，在荧光显微镜下用紫外光激发观察。若发现有蓝绿运动亮点，即为杂菌污染。(3)显微镜下直接观察是否有杂藻存在。营养盐浓度检测方法参看美国出版的Standard Methods for Water and Waste Water一书。
若检测的值不在上述范围内，则需通过相应的措施解决。如温度可通过调节室内温度控制；光强度光生物反应器内光强较稳定(700-800μE.m-2.s-1)；pH通过酸或碱调节。微生物污染严重时则需彻底更换培养液，并对反应器进行灭菌处理。营养不足时则注入新鲜培养液或添加营养盐等。
E、收获将欲收获葛仙米培养物通孔略小于0.5cm的不锈钢筛子过筛。直径0.5cm左右的球形体留在筛子上，这些就是所要获得的葛仙米产品。筛下来的葛仙米小群体和培养液经处理后继续作种子培养。
F、提高葛仙米球形体的机械强度将过筛后直径大于0.5cm的葛仙米球形体通过下面任一途径提高机械强度。一种是在培养液中加入1.5g/L的碳酸钠，将球形体转移到这种含有新鲜培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天，收获即可；另一种是将合格的球形体静置于原培养液中，于低温下(1-10℃)静置10-15小时。并注意，在静止时，要将反应器置于少于10μE.m-2.s-1的光强下以防止球形体的裂解。
G、干燥收获的球形体若不及时干燥，就会腐烂变质。干燥时，由于球形体胞外具有的多糖有高粘性，因此极易与盛放器皿黏结在一起。因此在干燥时把藻体放在绢布或丝网上就可避免黏结。干燥的方法有筛干，风干或烘干。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果方法易行、设备简单、操作方便、产量高，产品质量好、无污染、安全性高、生长过程短，可广泛适用于城乡大规模的工业化生产。葛仙米培养的过程中吸收二氧化碳，并向大气中排放出氧气，可起到净化空气的作用，不产生有害或有毒物质，培养液盐度低，酸碱度接近于自然水体，可循环利用。生长过程短，葛仙米生长快，10天就可完成对数生长，效率高，适量接种的培养物，20天后产量可达2-2.5g(干重)/l，每立方米培养液可收获2kg干藻。
具体实施例方式
利用生物反应器培养葛仙米方法的具体实施步骤如下1、培养液配制将称好或配制好的贮藏液加入水中的顺序是按每升水这加入硫酸镁0.075g、氯化钙0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬铁铵0.006g、乙二酸四乙酸二钠盐(EDTA)0.001g、碳酸钠0.03g、微量元素A51ml、磷酸氢二钾0.07g。
2、葛仙米种子制备2.1一级种子制备由试管原种接到小三角瓶(150ml)，放置在培养架(或箱)上，在光照10μE.m-2.s-1，温度28℃条件下静止培养或通气培养；培养到出现细微小颗粒后转如二级种子培养。
2.2二级种子制备由一级种子接到500-1000ml培养瓶，放置在培养架(或箱)上，在光照50μE.m-2.s-1，温度28℃条件下通气培养，达到微小圆珠状后进入三级种子培养。
2.3三级种子制备由二级种子接入到5-10L培养瓶进行养殖，在光照80μE.m-2.s-1，温度28℃条件下通气培养，葛仙米小颗粒达到约直径在1mm左右时，为制备好的规模化生产所用的种子。
3.接种培养(生物反应器培养)3.1生物反应器可以控制温度、光强、营养液及通气条件等；控制温度28-30℃，光强100μE.m-2.s-1，容积180L/个。
3.2培养场地与培养器可在室内或塑料大棚中，有条件的地方也可在玻璃温室安置光生物反应器。并配备一个孔径约0.5cm的不锈钢筛，用来筛选合格的球形体。
3.3接种与培养按每升培养液0.5-2g湿重的比例接种于光生物反应中。用空气充气泵通气(通气起到搅动和提供CO2的作用)以5-10L/min的速度从通气口通气。为了减少气体对培养物的污染，进入反应器之前，将气体以棉花过滤。通气量由阀门控制。
4、监控建立的监控条件和标准。温度28℃；光强800μE.m-2.s-1pH8.0；其它微生物如细菌，真菌和杂藻检测(1)涂平板法将培养液涂布在细菌培养的基本培养基上，37℃温培24小时以上后，观察是否由菌落出现；(2)显微观察取少量培养液，加入DAPI(一种荧光染料)至终浓度1μg/ml染色5分钟，在荧光显微镜下用紫外光激发观察。若发现有蓝绿运动亮点，即为污染微生物。(3)显微镜下直接观察是否有杂藻存在。营养盐浓度检测方法参看美国出版的Standard Methods for Water and Waste Water一书。若检测的值不在上述范围内，则需通过相应的措施解决。如温度可通过调节室内温度控制；光强度光生物反应器内光强较稳定(700-800μE.m-2.s-1)；pH通过酸或碱调节。微生物污染严重时则需彻底更换培养液，并对反应器进行灭菌处理。营养不足时则注入新鲜培养液或添加营养盐等等。
5、收获将欲收获葛仙米培养物通孔略小于0.5cm的不锈钢筛子过筛。直径0.5cm左右的球形体留在筛子上，这些就是我们所要获得的葛仙米产品。筛下来的葛仙米小群体和培养液经处理后继续作种子培养。
6、提高葛仙米球形体的机械强度将过筛后直径大于0.5cm的葛仙米球形体通过下面任一途径提高机械强度。一种是在培养液中加入1.5g/L的碳酸钠，将球形体转移到这种含有新鲜培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天，收获即可；另一种是将合格的球形体静置于原培养液中，于低温下(1-10℃)静置10-15小时。并注意，在静止时，要将反应器置于少于10μE.m-2.s-1的光强下以防止球形体的裂解。
7、干燥收获的球形体若不及时干燥，就会腐烂变质。干燥时，由于球形体胞外具有的多糖有高粘性，因此极易与盛放器皿黏结在一起。因此在干燥时把藻体放在绢布或丝网上就可避免黏结。干燥的方法有筛干，风干或烘干。
权利要求
1.一种用生物反应器培养葛仙米的方法，包括下列步骤A、培养液配制按每升水加入硫酸镁0.07-0.08g、氯化钙0.03-0.042g、0.001-0.002g、碳酸钠0.03-0.05g、微量元素A51ml、磷酸氢二钾0.07-0.09g；B、葛仙米种子制备一是一级种子制备，由试管原种接到三角瓶，放置在培养架上，在光照10μE.m-2.s-1，温度25-30℃条件下静止培养，培养到小颗粒后转二级种子培养；二是二级种子制备，由一级种子接到培养瓶，放置在培养架上，在光照10μE.m-2.s-1，温度25-30℃条件下通气培养，达到圆珠状后进入三级种子培养；三是三级种子制备，由二级种子接入到培养瓶进行养殖，在光照10μE.m-2.s-1，温度25-30℃条件下通气培养，葛仙米颗粒直径在0.8-1.2mm时，为制备好的规模化生产所用的种子；C、生物反应器培养一是采用生物反应器控制温度28-30℃，光强80-100μE.m-2.s-1，容积180-240L/个；二是培养场地与培养器在室内或塑料大棚中，有条件的地方也可在玻璃温室安置光生物反应器；三是接种与培养按每升培养液0.5-2g湿重的比例接种于光生物反应中，用空气充气泵通气，以5-10L/min的速度从通气口通气，进入反应器之前，将气体灭菌以棉花过滤，通气量由配气阀门控制；D、监控建立的监控条件和标准为，温度28-30℃，光强700-800μE.m-2.s-1，pH8.0-8.5；E、收获将收获葛仙米培养物通孔小于0.5cm的不锈钢筛子过筛，直径0.5cm的球形体留在筛子上，为葛仙米产品，筛下来的葛仙米小群体和培养液经处理后继续作种子培养；F、提高葛仙米球形体的机械强度将过筛后直径为0.5cm的球形体在培养液中加入1.5g/L的碳酸钠，将球形体转移到含有新鲜培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天，收获即可；G、干燥干燥时把藻体放在绢布或丝网上就可避免黏结，干燥有筛干，风干或烘干。
全文摘要
本发明公开了一种用生物反应器培养葛仙米的方法，1.培养液配制，采用硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬铁铵、乙二酸四乙酸二钠盐、碳酸钠、微量元素液A5、磷酸氢二钾按比例配制；2.藻种制备，二或三级培养物得到的球形体的培养物作为培养的接种种源；3.生物反应器培养，控制温度、光强、培养液通气条件；4.制备接种物；5.培养；6.监控；7.收获；8.提高葛仙米球形体的机械强度；9.干燥。本发明方法易行、设备简单、操作方便、产量高，产品质量好、无污染、安全性高、生长过程短，广泛适用于城乡大规模的工业化生产。
文档编号A01H13/00GK1528127SQ20031011121
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月10日 优先权日2003年10月10日
发明者沈银武, 刘永定, 吴国樵, 李敦海, 刘其芳, 丘昌强 申请人:中国科学院水生生物研究所