专利名称：白蚁的生物防治方法
技术领域：
本发明涉及白蚁的生物防治方法，尤其是利用人工培养的病原细菌Xenorhabdusnematophilus或Photorhabdus luminescens与人工培养的病原真菌金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)组合，防治家白蚁(Coptotermes formosanus)的方法。
背景技术：
家白蚁是危害性很强的社会性昆虫。目前，控制白蚁的常用方法有两类一是白蚁预防；二是白蚁防治。白蚁预防是利用化学药剂处理土壤或木结构，以趋避和防止白蚁危害；或利用物理障碍物或药剂障碍带，使白蚁不能入侵各类建筑物和目标危害物。白蚁防治是使用各种化学药剂处理被白蚁危害的位置；或者设置诱导箱诱导白蚁，然后使用各种化学药剂施用于诱导箱中，被药剂感染的白蚁可重复感染与其接触的其它白蚁。为了维持白蚁的预防和防治效果，通常使用高毒性和高残留的化学药剂，如毒死蜱、氯丹及拟除虫菊，砒霜(三氧化二砷)和灭蚁灵(有机氯杀虫剂)等。
许多专利涉及到使用化学药剂或物理障碍物预防和防治白蚁的方法(US Patent No.6397516)。使用高毒性和高残留的化学药剂带来的众所周知的副作用是污染环境以及威胁人畜安全。因此，对环境友好以及对人畜安全的生物制剂已被用于白蚁防治。
白蚁的自然天敌包括捕食性的鸟类、蜘蛛，蜥蜴，蜈蚣，蚂蚁；寄生性的寄生螨、寄生蝇、寄生性线虫等。几种病原微生物已发现可感染白蚁。Sugiura et al(US Patent No.5728573，1998)利用一种病原真菌Beauveria brongniartii防治白蚁。Metarhizium属和Beauveria属病原真菌也用于防治白蚁(US Patent No.5141744；US Patent No.5512280；US Patent No.5595746；US Patent Application No.20010006632)。Metarhizium属的金龟子绿僵菌从寄主昆虫的表皮侵入昆虫体内，并在昆虫体内发育，导致昆虫死亡。侵染昆虫时，首先是病原真菌的分生孢子附着在昆虫体表，孢子萌发后产生入侵菌丝，最后导致寄主死亡。
Xenorhabdus和Photorhabdus属共生细菌分别分离于昆虫病原斯氏属Steinernema与异小杆属Heterorhabditis线虫。这两个属的昆虫病原线虫是新型生物杀虫剂。这类线虫之所以致死昆虫是由于Xenorhabdus和Photorhabdus属共生细菌的作用。线虫以感染期虫态(infectivejuveniles，IJ)随寄主食物或从昆虫的自然开口(如肛门、气孔)、节间膜进入昆虫体内，随后释放肠腔中携带的Xenorhabdus和Photorhabdus属共生细菌。共生细菌分泌的毒素(毒性因子)导致昆虫死亡。原先，科学家们认为，Xenorhabdus属和Photorhabdus属的共生细菌只有被线虫携带或注射进入昆虫体内时才发挥杀虫作用(Akhurst.Journal of GeneralMicrobiology，1980，121303-309；Bedding.Annals of Applied Biology，1984，104117-120；Forst & Nealson.Microbiological Review，1996，6021-43)。最近发现，共生细菌可通过口服单独致死昆虫(李素春等.第六届全国杀虫微生物学术讨论会论文摘要集.1995.43；Dudney R.US Patent No.488820，1997；Jarrett et al.PCT Patent No.98/08388，1998；Ragni etal.PCT Patent No.98/05212，1998)，从共生菌中可分离出蛋白质毒素(Ensign et al.PCT PatentNo.97/17432，1997；Bowen et al.Science，1998，2802129-2132；Ensign et al.US Patent No.072264，2000)。这类细菌已用于防治火蚁(US Patent No.5616318)和白蚁(US PatentApplication No.20030082147)。
尽管Xenorhabdus和Photorhabdus属细菌，以及Metarhizium anisopliae(金龟子绿僵菌)病原真菌已经被应用于防治白蚁，但是一起施用这两类生物制剂防治白蚁的工作未见报道。
发明内容
本发明的目的在于开发一种白蚁的生物防治的方法。
本发明作者发现，Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus luminescens病原细菌与Metarhizium anisopliae病原真菌协同使用对家白蚁防治具有增效作用，从而开发出一种有效的白蚁生物防治方法，实现了本发明的目的。
本发明白蚁的生物防治方法，其特征在于使家白蚁染上Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus luminescens病原细菌与Metarhizium anisopliae病原真菌。
本发明可以通过将含有所述病原细菌的制剂和含有所述病原真菌的制剂分别施用于同一白蚁群或施用于同一白蚁诱导箱中，使家白蚁先后直接或间接染上所述病原细菌和所述的病原真菌；也可以通过将含有所述病原细菌的制剂和含有所述病原真菌的制剂混合后施用于白蚁群或施用于白蚁诱导箱中，使家白蚁同时染上所述病原细菌和所述的病原真菌。所述制剂的施用采用常规的方法，例如以常规喷雾器或其它施用工具(如注射、灌溉等)应用于白蚁巢或白蚁活动的场所或白蚁诱导箱中。
本发明所述Xenorhabdus nematophilus和Photorhabdus luminescens细菌分别归属Xenorhabdus和Photorhabdus属，分别分离自斯氏科Steinernematidae斯氏属Steinernema与异小杆科Heterorhabditidae异小杆属Heterorhabditis昆虫病原感染期线虫，目前在分类上归属于Enterobacteriaceae科。
本发明所述的Xenorhabdus nematophilus和Photorhabdus luminescens细菌的人工培养采用常规的、已有的技术，分离、纯化后，以人工培养基(如蛋白胨水培养基或其它能够培养这类细菌的培养基)体外培养，包括以发酵罐或反应器系统培养后，所获得的菌液可直接或经分离、提取和提纯得到的有效组分用作本发明所用制剂的组分，在本发明中施用。
本发明所述的Metarhizium anisopliae(金龟子绿僵菌)病原真菌的人工培养采用常规的、已有的技术，以人工培养基(如常用的马铃薯葡萄糖培养基或其它能够培养这类真菌的培养基)体外培养，包括以发酵罐或反应器系统培养后，所获得的孢子可用作本发明所用制剂的组分，在本发明中施用。
本发明所述制剂可以是适用于生物制剂的一切剂型，如液剂、可湿性粉剂等，也可加入辅助剂，如吸附剂、湿润剂、防腐剂、粘着剂、引诱剂、保护剂和增效剂等配置成不同的剂型。
所述制剂中所述的病原细菌和病原真菌的含量没有特别的要求，与通常的生物制剂一样，为了得到好的效果，其含量要足够，根据白蚁的发生情况和数量，液剂中所述的病原细菌一般为每毫升105～108数量级菌体范围，最佳为每毫升107～108数量级菌体，所述的病原真菌一般为每毫升105～109数量级孢子的范围，最佳为每毫升107～109数量级孢子；粉剂中所述的病原细菌一般为每克105～109数量级菌体的范围，最佳为每克107～109数量级菌体，所述的病原真菌一般为每克105～109数量级孢子的范围，最佳为每克107～109数量级孢子。
本发明所述制剂以常规喷雾器或其它施用工具(如注射、灌溉等)应用于白蚁巢或白蚁活动的场所或白蚁诱导箱中。
所述的白蚁诱导箱采用常规的和已有的技术设置，由白蚁喜爱的木材(如杉木)或纤维素类物质组成，也可加入白蚁诱导剂(如蔗糖等糖类溶液、与白蚁共生真菌的分泌物等)。诱导箱一般放置于白蚁巢附近或白蚁活动场所，引诱白蚁取食诱导箱的木材或纤维素类物质，或引诱白蚁在诱导箱中活动。白蚁接触到生物制剂后，受到感染，被感染的白蚁又可交叉感染其它白蚁个体，引起整巢白蚁的感染，从而达到防治白蚁的目的。
本发明由于协同使用了所述的病原细菌和所述的病原真菌，对白蚁的杀灭效果明显优于单独使用所述细菌和真菌的时候，详见实施例。
具体实施例方式
下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。
实例1Xenorhabdus nematophilus和Photorhabdus luminescens细菌，以及金龟子绿僵菌的培养和剂型配制，用于实施例2～7。
Xenorhabdus和Photorhabdus属细菌的培养和剂型配制于500mL三角瓶中加入100mL液体培养基(1％蛋白胨，0.5％NaCl)，121℃下高压消毒30分钟；然后接入1mL X.nematophilus或P.luminescens初生型共生菌菌种，置于25℃、150r/min下摇床培养48小时，所获得菌液(约每毫升107～108菌体)可作为水剂，施用于防治白蚁。这类细菌也可以发酵罐或反应器大量培养。使用细菌菌液时，本专业领域的人员可根据白蚁的发生情况和数量，将菌液稀释成每毫升105～108菌体范围，然后施用于防治白蚁。但是，最佳的菌液浓度为每毫升107～108菌体。
所培养的菌液经过离心机离心后，收获细菌体，然后加入填充剂(如木屑、玉米粉、硅藻土等)，可配制成粉剂。使用细菌粉剂时，本专业领域的人员可根据白蚁的发生情况和数量，将粉剂制成每克105～109菌体的范围，然后施用于防治白蚁。但是，最佳的粉剂浓度为每克107～109菌体。
金龟子绿僵菌的培养和剂型配制金龟子绿僵菌以马铃薯葡萄糖培养基(PDA)或蒸熟的大米作为培养基于25℃培养室中培养7～10天后，培养平板或培养盒中长满菌丝并产生孢子。所长的孢子和菌丝可用水洗下，制成液剂，直接施用于白蚁。使用金龟子绿僵菌菌液时，本专业领域的人员可根据白蚁的发生情况和数量，将菌液稀释成每毫升105～109孢子的范围，然后施用于防治白蚁。但是，最佳的孢子浓度为每毫升107～109孢子。
如加入填充剂(如硅藻土、玉米粉等)后，可制成粉剂再施用于防治白蚁。使用金龟子绿僵菌粉剂时，本专业领域的人员可根据白蚁的发生情况和数量，将粉剂制成每克105～109孢子的范围，然后施用于防治白蚁。但是，最佳的粉剂浓度为每克107～109孢子。
实例2混合使用病原细菌菌液以及病原真菌孢子液防治家白蚁。
X.nematophilus细菌或P.luminescens细菌于液体培养基(1％蛋白胨，0.5％NaCl)中培养后，得到菌液(约每毫升5×108菌体)。金龟子绿僵菌以马铃薯葡萄糖培养基(PDA)于25℃培养室中培养10天后，平板上长满菌丝并产生孢子。平板中所长的孢子用无菌水洗下，制成液剂(约每毫升5×107孢子)。于每个高压消毒的平板(直径＝9cm)中加入一层中速滤纸和1克含水量为10％的木屑(也经高压消毒)，取0.5毫升细菌菌液和0.5毫升真菌孢子液混匀，然后加入木屑中，再于平板中加入20头未被细菌和真菌感染的的工蚁。于平板中仅加入细菌菌液，或仅加入真菌孢子液，或未接触生物制剂的白蚁置于同样的培养皿中作为对照。每个处理设4个平板的重复。将所有的平板以封口膜封口，置于25℃下。每天检查白蚁的死亡情况，记录白蚁死亡数。
测定后第五天，各菌株及菌株组合对家白蚁的防治效果见表1。从表1可以看出，混合使用细菌和真菌孢子液对家白蚁的防治效果大于单独使用细菌菌液或真菌孢子液。
表1混合使用病原细菌菌液以及病原真菌孢子液防治家白蚁的防治效果
实例3混合使用病原细菌以及病原真菌粉剂防治家白蚁。
于每个高压消毒的平板(直径＝9cm)中加入一层中速滤纸和1克含水量为10％的木屑(也经高压消毒)，根据实例一所述配制的粉剂，取0.5克细菌粉剂(约含每克108菌体)和0.5克真菌孢子粉剂(约含每克108孢子)混匀，然后加入木屑中，再于平板中加入20头未被细菌和真菌感染的的工蚁。于平板中仅加入细菌粉剂，或仅加入真菌孢子粉剂，或未接触生物制剂的白蚁置于同样的培养皿中作为对照。每个处理设4个平板的重复。将所有的平板以封口膜封口，置于25℃下。每天检查白蚁的死亡情况，记录白蚁死亡数。
测定后第五天，各菌株及菌株组合对家白蚁的防治效果见表2。从表2可以看出，混合使用细菌和真菌孢子粉剂对家白蚁的防治效果大于单独使用细菌粉剂或真菌孢子粉剂的防治效果。
表2混合使用病原细菌粉剂以及病原真菌孢子粉剂防治家白蚁的防治效果
实例4分别施用病原细菌菌液以及病原真菌粉剂使家白蚁先后直接染上细菌和真菌。
于每个高压消毒的平板(直径＝9cm)中加入一层中速滤纸和1克含水量为50％的木屑(也经高压消毒)，然后于木屑中混入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens细菌菌液(约每毫升5×108菌体)。再于平板中加入20头已经在涂有真菌粉剂(约每克109孢子)的平板中爬动一分钟的工蚁。在真菌平板中爬动一分钟的工蚁身上带有真菌孢子。于平板中仅加入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens细菌菌液，或仅加入20头已经在长有真菌的平板中爬动一分钟的工蚁，或未接触真菌孢子的白蚁置于同样的培养皿中作为对照。每个处理设4个平板的重复。将所有的培养皿以封口膜封口，置于25℃下。每天检查白蚁的死亡情况，记录白蚁死亡数。
测定后第五天，各菌株及菌株组合对家白蚁的防治效果见表3。从表3可以看出，单独使用各种菌株对家白蚁的防治效果不如组合使用细菌菌株和真菌菌株的防治效果。家白蚁取食混有X.nematophilus或P.luminescens细菌菌液后，这些细菌产生的毒性物质对家白蚁有致死作用，或者破坏家白蚁的免疫系统使真菌易于发挥作用。
表3分别施用病原细菌菌液以及病原真菌粉剂使家白蚁先后直接染上细菌和真菌的防治效果
实例5分别施用病原细菌菌液以及病原真菌孢子液使家白蚁扩散(间接)染上细菌和真菌。
于每个高压消毒的平板(直径＝9cm)中加入一层中速滤纸和1克含水量为50％的木屑(也经高压消毒)，然后于木屑中混入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens细菌菌液(约每毫升107菌体)。再于平板中加入19头工蚁，和1头已经在涂有真菌液(约每毫升109孢子)的平板中爬动一分钟的工蚁。在真菌平板中爬动一分钟的工蚁身上带有真菌孢子。通过接触，带有真菌孢子的白蚁可将孢子传染给其它健康白蚁个体，引起交叉感染。于平板中仅加入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens细菌菌液，或仅加入1头已经在长有真菌的平板中爬动一分钟的工蚁，或未接触真菌孢子的白蚁置于同样的培养皿中作为对照。每个处理设4个平板的重复。将所有的培养皿以封口膜封口，置于25℃下。每天检查白蚁的死亡情况，记录白蚁死亡数。
测定后第五天，各菌株及菌株组合对家白蚁的防治效果见表4。从表4可以看出，1头带有真菌孢子的家白蚁需要时间去交叉感染平板中的其它白蚁个体，但是，测定后第五天的检查结果也表明，单独使用各种菌株对家白蚁的防治效果不如组合使用细菌菌株和真菌菌株的防治效果。
表4分别施用病原细菌菌液以及病原真菌孢子液使家白蚁扩散染上细菌和真菌的防治效果
实例6分别使用病原细菌粉剂以及病原真菌粉剂使家白蚁先后真接染上细菌和真菌。
于每个高压消毒的平板(直径＝9cm)中加入一层中速滤纸和1克含水量为50％的木屑(也经高压消毒)，根据实例1所述配制的粉剂，取0.5克X.nematophilus或P.luminescens细菌粉剂(约含每克107菌体)。再于平板中加入20头已经在涂有真菌粉剂(约每克107孢子)的平板中爬动一分钟的工蚁。在真菌平板中爬动一分钟的工蚁身上带有真菌孢子。于平板中仅加入0.5克X.nematophilus或P.luminescens细菌粉剂，或仅加入20头已经在涂有真菌的平板中爬动一分钟的工蚁，或未接触真菌孢子的白蚁置于同样的培养皿中作为对照。每个处理设4个平板的重复。将所有的培养皿以封口膜封口，置于25℃下。每天检查白蚁的死亡情况，记录白蚁死亡数。
测定后第五天，各菌株及菌株组合对家白蚁的防治效果见表5。从表5可以看出，单独使用各种菌株对家白蚁的防治效果不如组合使用细菌菌株和真菌菌株的防治效果。家白蚁取食混有X.nematophilus或P.luminescens细菌菌液后，这些细菌产生的毒性物质对家白蚁有致死作用，或者破坏家白蚁的免疫系统使真菌易于发挥作用。
表5分别使用病原细菌粉剂以及病原真菌粉剂使家白蚁先后直接染上细菌和真菌的防治效果
实例7分别施用病原细菌粉剂以及病原真菌液剂使家白蚁扩散(间接)染上细菌和真菌。
于每个高压消毒的平板(直径＝9cm)中加入一层中速滤纸和1克含水量为50％的木屑(也经高压消毒)，然后于木屑中混入0.5克X.nematophilus或P.luminescens细菌粉剂(约每克109菌体)。再于平板中加入19头工蚁，和1头已经在涂有真菌液(约每毫升109孢子)的平板中爬动一分钟的工蚁。在真菌平板中爬动一分钟的工蚁身上带有真菌孢子。通过接触，带有真菌孢子的白蚁可将孢子传染给其它健康白蚁个体，引起交叉感染。于平板中仅加入0.5克X.nematophilus或P.luminescens细菌粉剂，或仅加入1头已经在涂有真菌的平板中爬动一分钟的工蚁，或未接触真菌孢子的白蚁置于同样的培养皿中作为对照。每个处理设4个平板的重复。将所有的培养皿以封口膜封口，置于25℃下。每天检查白蚁的死亡情况，记录白蚁死亡数。
测定后第五天，各菌株及菌株组合对家白蚁的防治效果见表6。从表6可以看出，1头带有真菌孢子的家白蚁需要时间去交叉感染平板中的其它白蚁个体，但是，测定后第五天的检查结果也表明，单独使用各种菌株对家白蚁的防治效果不如组合使用细菌菌株和真菌菌株的防治效果。
表6分别施用病原细菌粉剂以及病原真菌孢子液使家白蚁扩散染上细菌和真菌的防治效果
权利要求
1.一种白蚁的生物防治方法，其特征在于使家白蚁染上Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus luminescens病原细菌与Metarhizium anisopliae病原真菌。
2.根据权利要求1所述的白蚁的生物防治方法，其特征在于通过将含有所述病原细菌的制剂和含有所述病原真菌的制剂分别施用于同一白蚁群或施用于同一白蚁诱导箱中，使家白蚁先后直接或间接染上所述病原细菌和所述的病原真菌。
3.根据权利要求1所述的白蚁的生物防治方法，其特征在于通过将含有所述病原细菌的制剂和含有所述病原真菌的制剂混合后施用于白蚁群或施用于白蚁诱导箱中，使家白蚁同时染上所述病原细菌和所述的病原真菌。
4.根据权利要求2或3所述的白蚁的生物防治方法，其特征在于所述的制剂为液剂或粉剂；所述的液剂中含有所述的病原细菌107～108数量级菌体/毫升，含有所述的病原真菌107～109数量级孢子/毫升；所述的粉剂中含有所述的病原细菌107～109数量级菌体/克，含有所述的病原真菌107～109数量级孢子/克。
全文摘要
本发明涉及白蚁的生物防治方法。其特征在于使家白蚁染上Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus nematophilus病原细菌和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae病原真菌。将含有所述病原细菌的制剂和含有所述病原真菌的制剂分别或混合后直接施用于白蚁群(白蚁巢或白蚁活动的场所)或施用于同一白蚁诱导物(如纤维素类物质)上，使家白蚁先后或同时染上所述病原细菌和所述的病原真菌。由于所述病原细菌和所述病原真菌的协同效应，对家白蚁的杀灭有明显的增效作用。本发明是防治白蚁的有效方法。
文档编号A01N63/04GK1623399SQ20031011243
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月4日 优先权日2003年12月4日
发明者韩日畴, 曹莉, 刘秀玲, 陈镜华, 何向阳 申请人:广东省昆虫研究所