专利名称：使用动物模型预测药物不良反应的方法
技术领域：
本发明一般地涉及制药工业中的目标确证的过程。
背景技术：
由于发现对人的毒效应，制药工业在临床研发的早期阶段会放弃许多化合物。因为在对人实验之前有数年的动物实验，这是昂贵的损失。为了减少花费，理想的是较早地鉴别出有不良作用的化合物，并在进一步的研究中排除它们。另外，如果能较早地鉴别出不良作用，则可以在较早的阶段设计比较安全的化合物，从而显著地加快开发出安全且有效的药物所需的时间。识别潜在问题的一个早期阶段是在选择将被新药物抑制或刺激的分子目标期间。该过程称作“目标确证”。
目前的药物开发途径的一个问题是，实验动物被保持在均一的、仔细地控制的环境中。尽管这使得能收集到可再现的且科学上准确的数据，但它不能精确地模拟人的情形，其中的人处于并发疾病、心理应激、外伤损伤、营养问题和其它的常见生理紊乱中。
在这里，我们提出了一种方法，其中目标确证可以使用限定的紊乱在动物中有效地测试，还提出了一种清楚地定义的、可测量的快速分析结果的方法。
引用的文献1.Brayton，C.，M.Justice，和C.A.Montgomery.2001.Evaluating mutant miceAnatomic pathology.VeterinaryPathology 381-19.
2.Campbell，K.H.S.，J.Mcwhir，W.A.Ritchie，&I Wilmut，1996.Sheep Cloned by Nuclear Transfer from a Cultured Cell Line，Nature 38064-66.
3.Gavaghan，C.L.，E.Holmes，E.Lenz，1.D.Wilson，和J.K.Nicholson.2000.An NMR-based metabonomic approach toinvestigate the biochemical consequences of genetic straindifferencesapplication to the C57BL10J and AlpkApfCD mouse.FEBS Letters 484169-174.
4.Griebel，G.，J.Simiand，R.Steinberg，M.Jung，D.Gully，P.Roger，M.Geslin，B.Scatton，J.P.Maffrand，和P.Soubrie.2002.4-(2-氯-4-甲氧基-5-甲基苯基)-N-[(1S)-2-环丙基-1-(3-氟-4-甲基苯基)乙基]5-甲基-N-(2-丙炔基)-1，3-噻唑-2-胺盐酸盐(SSR125543A)，一种有效的且选择性的促肾上腺皮质激素-释放因子(1)受体拮抗剂.II.Characterization in rodent models ofstress-related disorders.Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics 301333-345.
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8.Warren，T.K.，K.A.Mitchell，和B.P.Lawrence.2000.Exposure To 2，3，7，8-tetraclorodibenzo-p-dloxin(TCDD)suppresses the humoral and cell-mediated immune responses toinfluenza A virus without affecting cytolytic activity in thelung.Toxicological Sciences 56114-123.
9.Wilmut，I.，A.E.Schnieke，J.Mcwhir，A.J.Kind，& K.H.S.Campbell，1997.Viable Offspring Derived From Fetal andAdult Mammalian Cells.Nature，385810-813.
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12.Ward，J.M.，J.F.Mahler，R.R.Maronpot，和J.P.Sundberg.2000.Pathology of genetically engineered mice，第1版.Iowa State University Press，Ames，Iowa.
专利13.美国专利号5,523,222发明概述本发明在一方面包含一种通过评估动物模型的反应来预测对针对目标基因的药物的不良反应的方法，该方法包括(a)提供遗传工程的非人哺乳动物，其中所述的哺乳动物表现出目标基因的过量表达或表达不足；(b)使所述的哺乳动物发生预选定的紊乱，在哺乳动物中造成期望的生理应激；和(c)此后通过测定哺乳动物的metabonomic profile评价所述遗传工程的哺乳动物的反应，其中所述的metabonomic profile表明对作用于目标的药物的不良反应，与预选定紊乱有关。
本发明还包括一种测定对针对目标基因的药物的不良反应的方法，包括(a)对比至少两组的反应，每组是基本上相同的非人的哺乳动物，其中的一组由表现出所述目标基因的过量表达或表达不足的遗传工程哺乳动物组成，而其中的另一组表现出所述目标基因的基本正常的表达，也就是说，既非实质上过量表达也非表达不足；(b)使所述的哺乳动物发生实质上相同的预选定的紊乱，这在所述的哺乳动物中造成期望的生理应激；(c)检测所述的哺乳动物的metabonomic profile，和(d)此后对比所述profile，以评价与目标基因的表达和预选定的紊乱相关的不良反应。
除了前面的内容以外，本发明还包括其它方面，即以任何方式比上面具体提到的变体范围窄的本发明的所有实施方案。
发明详述提供的前述内容用于进一步易化理解申请人的发明，但无意限制申请人的发明的范围。
定义术语“遗传工程的非人的哺乳动物”(为了方便，在下面有时称作“工程动物”)是指除人以外的哺乳动物纲的所有成员，其基因组已经通过人为干预进行了改变，以改变特定的预定基因产物的表达水平或模式。在本发明中使用的遗传工程的非人的哺乳动物包括但不限于农场动物(猪、山羊、绵羊、牛、马、兔子等)、啮齿类动物(例如大鼠和小鼠)和驯养的宠物(例如猫和狗)。啮齿类动物有时是优选的，因为它们尺寸小。
术语“遗传工程的非人的哺乳动物”包括敲除的和转基因的动物，它们改变了特定基因产物的表达水平。本领域的技术人员熟知遗传操作哺乳动物以改变基因表达的方法。还包括非人的哺乳动物，其中已经改变了对特定的预定基因产物在时间上或空间上的控制，如下面进一步描述的。
可以通过多种方式将核酸分子导入胚胎，生成工程动物。例如，可以通过微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染或通过其它方式转化全能性的或多能性的干细胞。然后可以将转化的细胞导入胚胎，并掺入其中形成工程动物。在一种方法中，可以用逆转录病毒载体感染发育的胚胎，并可以从感染的胚胎形成工程动物。而在另一种方法中，将本发明的DNA分子注射入胚胎，优选地在单细胞阶段，让其发育成成熟的工程动物。但是，本发明不限于这些方法中的任一种，可以使用其它的制备工程动物的方法，例如L.M.Houdebine在Transgenic Animal Generation and use，HarwoodAcademic Press，1997中所述。还可以使用核转移或使用胚胎的或成年的细胞系进行克隆的方法生成工程动物，例如在Campbell等，Nature 38064-66(1996)和Wihnut等，Nature 385810-813(1997)中所述。还可以使用其它的利用DNA的细胞质注射的技术，如美国专利号5,523,222所述。
术语对工程动物“测定metabonomic profile”是指测定从动物得到的生物液体中示踪分子的图谱，典型地使用高分辨1H核磁共振(NMR)或质谱，结合图谱识别技术。该技术已经由Robertson等描述。该技术所应用的生物液体包括但不限于尿、乳汁、血浆和血清。
我们在这里描述了一种方法，其中使工程动物处于一组紊乱中，并通过对尿、血清或血浆的metabonomic profiling分析，定量地评估它们对紊乱的反应。
在目标确证(药物开发的一个早期阶段)期间，用工程动物(经常是啮齿类动物)来模拟药物的作用，并评价药物安全性(Brayton，等；Sundberg，等；Ward，等)。例如，敲除的哺乳动物(即其中缺失特定基因的哺乳动物)可以用于预测能阻止特定基因产物(目标)的功能的抑制性药物的作用。也就是说，其中缺失了感兴趣的目标基因的敲除的哺乳动物是预测给予药物来抑制目标分子的动物的效果(包括不良副作用)的模型。类似地，过量表达特定基因的转基因的非人哺乳动物可以用于预测激动剂药物的作用，所述药物能使特定基因产物的功能增加。另外，可以使制备的工程动物仅仅在特定时间(时间上控制)或者在特定器官或组织(空间上控制)表达不足或过量表达感兴趣的基因(Tymms，等)。将工程动物用于该目的的优点是，甚至在合成出有效的化合物或药物之前就可以检查和测试它们。
但是，重要的是，这种分析或“表型化”工程动物的常规方法是在除此以外健康的、未受应激的动物中进行。从这些实验得到的结果可能不能预测在人类中的安全性，人类经常遭受多种疾病和各种应激、营养问题和有害的生活方式选择。
我们提出了两种方案来从工程动物获取关于药物作用的更好的信息。
1.通过用各种活性剂或条件攻击工程动物，或使其紊乱，而不是检查仅仅处于非紊乱状态的非人的哺乳动物。例如，低剂量的脂多糖(LPS)(革兰氏阴性茵的外膜组分)刺激细菌感染的许多效应，包括发热和炎症。通过动物行为攻击可以引起许多对心理应激的生理反应，所述的攻击包括暴露于闪烁的频闪灯，通过在晚间开灯且在日间关灯造成亮/暗周期的颠倒，在塑料管中拘束20分钟，暴露于猫或大鼠的气味，足部休克10秒钟(Griebel，等)。通过饲喂丁硫堇磺基肟(buthionine sulfoximine)(一种能抑制谷胱甘肽的化合物)，可以诱导氧化应激，这是同时进行的药物治疗、某些营养不足或疾病的常见效应(Robertson等)。使用对人不致病的且通常在小鼠中仅仅诱发最小病变的流感病毒的高度减毒株进行实验性的感染，可以测试病毒感染(Warren，等)。
2.一些变化仅仅在对疾病有遗传倾向性的个体中具有不良作用。例如，个体对氧化应激、癫痫发作和细菌或病毒疾病的敏感性不同。通过将工程动物与对发生特定疾病敏感性提高的品系进行繁殖，可以测试药物对具有疾病倾向性的个体的作用。然后，后代会同时具有原始的遗传修饰(例如，缺失特定的感兴趣基因)和对特定疾病的提高敏感性。揭示这些杂交的非人的哺乳动物中的表型异常可以指示潜在的不良作用。
当将一系列实验扩展至对工程动物进行时，非常理想的是加速评价测试的方式。评价反应的一种快速且全面的方式是通过metabonomics分析。Metabonomics的优点是，它能以非特异性的方式同时检测生物液体中的一系列分子大小的所有内源性化学物质。结果是定量的，可以在动物中对比，并可以作为全面的图谱(通过称作“图谱识别分析”的方法)而不是通过个别化学物质进行检查。通过将非人的哺乳动物置于代谢笼中收集尿，其中尿与粪便和洒落的食物分离，并转移到冷却的收集罐中。或者，可以用血清或血浆进行metabonomics分析。使用1H-核磁共振(NMR)谱或质谱测试体液。通过图谱识别分析和基本组分分析，分析光谱(Robertson，等)。metabonomic分析的一个优点是，它是没有偏见的且宽泛的。也就是说，它可以检测尿、血清或血浆中多种机体内源性化学物质的变化，即使这些化学物质先前不被认为是感兴趣的。
可以预见，大多数工程动物品系的metabonomic图谱会与野生型不同(Gavaghan，等)。在紊乱分析中，会评估紊乱后的metabonomic图谱与基础图谱之间的区别。可以鉴别工程动物品系，认为具有下述对紊乱的metabonomic反应的动物是异常的它(a)比相应的野生型非人的哺乳动物的metabonomic反应显著增加或降低，或(b)与野生型非人的哺乳动物的metabonomic反应是不同的方向(见
图1)。该筛选实验的目的是，鉴别出对紊乱具有异常反应的具有特定基因改变的工程动物。这可以较早地预测被设计用来抑制或刺激特定基因(即改变的基因)生成的靶蛋白的药物可能在有些人中在通常遇到的生理紊乱情形下是不安全的。也就是说，工程动物会被用于模拟在个体中的效果，所述个体在处于应激或紊乱状态的同时接受药物。
在得到筛选实验的结果后，还可以进行更详细的特定分析物或机理的实验，以更好地证实或理解该结果。
清楚的是，除了按照在前面的说明书和实施例中的具体描述以外，本发明还可以以其它方式实施。
参考上述教导，可以对本发明进行许多修改和变化，因此它们也在本发明的范围内。
在本文中引用的所有文献的全部内容都在这里引作参考。
权利要求
1.一种通过评估动物模型的反应来预测对作用于目标的药物的不良反应的方法，该方法包括(a)提供遗传工程的非人哺乳动物，其中所述的哺乳动物表现出目标基因的过量表达或表达不足；(b)使所述的哺乳动物发生预选定的紊乱，在哺乳动物中造成期望的生理应激；和(c)此后通过测定哺乳动物的metabonomic profile来评价所述遗传工程的哺乳动物的反应。
2.根据权利要求1的方法，其中所述遗传工程的非人的哺乳动物是啮齿类动物。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的评价是通过对比遗传工程的哺乳动物的metabonomic profile与经受过相同预选定紊乱的实质上相同的非工程哺乳动物的metabonomic profile来完成的。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用尿测定的。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用血清测定的。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用血浆测定的。
7.根据权利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用乳汁测定的。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的预选定紊乱是低剂量的脂多糖。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的预选定紊乱是暴露于闪烁的频闪灯。
10.根据权利要求1的方法，其中所述的预选定紊乱是亮暗周期的颠倒。
11.根据权利要求1的方法，其中所述的预选定紊乱是拘束。
12.根据权利要求1的方法，其中所述的预选定紊乱是氧化应激。
13.根据权利要求13的方法，其中所述的氧化应激包括饲喂丁硫堇磺基肟。
14.根据权利要求1的方法，其中所述的预选定紊乱是病毒感染。
15.根据权利要求1的方法，其中所述的预选定紊乱是导入遗传物质，其导致发生特定疾病的敏感性提高。
全文摘要
本发明一般地涉及制药工业中的目标确证的过程。公开了一种用于确证分子目标的方法。
文档编号A01K67/027GK1754172SQ200380102043
公开日2006年3月29日 申请日期2003年10月16日 优先权日2002年10月29日
发明者G·H·坎托, M·杰普特 申请人:法玛西雅厄普约翰有限责任公司