一种脆弱拟杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物、药品、保健品、食品及日化产品
技术领域：
，特别是涉及一种新的脆弱拟杆菌菌株及其在预防和/或治疗抗生素相关性腹泻中的应用。
背景技术：
：随着抗生素的广泛应用，抗生素相关性腹泻(antibioticassociateddiarrhea，简称AAD)日益受到关注。抗生素相关性腹泻是指应用抗生素后继发腹泻，为较常见的药物不良反应，其发生率视不同抗生素而异，约为5％～39％。按AAD的病情程度不同，抗生素相关性腹泻包括单纯腹泻、结肠炎或伪膜性结肠炎。伪膜性结肠炎(pseudomembranouscolitis，简称PMC)指病情严重，在结肠粘膜有伪膜形成的特殊类型，如不及时给予合理治疗，可引起并发症，死亡率高达15％～24％。对于AAD的发生，目前较为一致的看法是抗生素破坏了肠内菌群的自然生态平衡，即生理性细菌明显减少，而需氧性菌及兼性厌氧菌数量增加，其中与PMC发病有关的主要是艰难梭菌(Clostridiumdifficile，简称CD)，其他细菌尚有产气荚膜芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯杆菌和沙门菌属。凡能对抗细菌的药物，几乎均可引起AAD，以林可霉素(lincomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、氨苄西林(ampicallin)多见。目前对于中重型AAD患者，需选用对艰难梭菌敏感的抗生素，临床上多选用甲硝唑或万古霉素。这些药物虽然有一定的疗效，但是却会使细菌产生耐药性，耐药性一旦产生，药物的疗效就明显下降。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。为了保持抗生素的有效性，应减少其使用。因此亟需开发出更为安全的替代治疗方案。研究表明，AAD通常是肠道正常菌群失调的结果，微生态制剂在AAD中的应用日益受到重视。益生菌在AAD治疗中的作用因其安全性优越、无毒副作用的特点而日益被重视，但目前所报道的益生菌，如嗜酸乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、双歧杆菌、长双歧杆菌、粪肠球菌、嗜热链球菌等的疗效尚无法达到理想状态。选择全新的菌株成为益生菌治疗AAD的关键。人体胃肠道内菌群数量庞大，迄今为止，哺乳动物与寄居于其体内的数以亿计的微生物保持着一种动态平衡，这种平衡不仅有利于微生物的生存和繁衍，也有利于机体自稳态的形成，使机体免于某些疾病。益生菌制剂是指根据微生态理论研制的含有益生菌及其代谢产物的生物制剂，通过调节、维持机体内的微生态平衡，达到提高机体健康水平的目的。截至目前，已发现的益生菌大致分为三类：(1)乳杆菌类，如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等；(2)双歧杆菌类，如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌和嗜热双歧杆菌等；(3)革兰氏阳性球菌，如粪链球菌、乳球菌等。国外已经开发出了数以百计的益生菌制剂，针对疾病的治疗取得了非常显著的效果并带来了巨大的经济效益。在国内，随着人们健康意识的增强，有关益生菌制剂的研究和生产也有了较快的发展。经过近半个世纪的实践，欧洲、北美、日本、中国都在应用益生菌调节剂作为酸奶发酵菌饮料、保健食品和药品，这已是普遍公认的事实，然而这些制剂中主要包含双歧杆菌和乳杆菌，经过长期、大范围应用后发现其临床疗效越来越弱，所以亟需加大开发研究力度，进一步丰富益生菌品种。脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)是革兰氏阴性厌氧细菌中拟杆菌属的成员，属于拟杆菌门，完全不同于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等。拟杆菌属有25个菌种，仅来自人类的有10个菌种，仅来自动物的有10个菌种，来自人和动物的有5个菌种。脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌，依培养基的不同和生长阶段的不同，菌体形态呈现多形性，一般条件下菌体为杆状、两端顿圆、着色深，中间色浅且不均匀，有荚膜、无芽胞、无动力，有些有空泡，菌体长短不一。依据能否合成、分泌脆弱拟杆菌肠毒素BFT(Bacteroidesfragilistoxin)可将其分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(EnterotoxigenicBacteroidesfragilis，ETBF)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌(NontoxigenicBacteroidesfragilis，NTBF)。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中。此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。脆弱拟杆菌作为一种条件致病菌，当宿主粘膜受损时，可侵犯粘膜下层，引起感染，也可经血液流动，引起身体其它器官，如肠道、腹腔、肝、肺、脑组织、软组织、骨髓等的化脓性感染并伴发脓肿。本领域已经对脆弱拟杆菌进行了大量研究。张季阶从发育良好的婴儿或低龄动物肠道中分离出一种拟杆菌菌株BF839，将其制成活菌制剂后能够增加儿童生长发育，对防治急慢性肠炎、菌群失调、上呼吸道感染和神经官能症等较好疗效(参见申请号为“90102847.9”，名称为“一株有益菌株及其应用”的中国发明专利申请；张季阶，等.脆弱拟杆菌(BF839)菌液的临床应用研究.中国生物制品学杂志，1995年，第8卷，第2期，第63-65页)。再如，申请号为“201310095126.7”，名称为“具有益生菌特性的脆弱拟杆菌”；申请号为“201310085744.3”，名称为“脆弱拟杆菌在制备治疗急性放射性肠炎组合物中的应用”；申请号为“201310085716.1”，名称为“脆弱拟杆菌在制备治疗炎症性肠病组合物中的应用”的中国发明专利申请所公开的脆弱拟杆菌，为在2012年从婴儿粪便中分离出一种具有益生菌特性的脆弱拟杆菌菌株(保藏编号为CGMCCNO.7280)，可用于治疗炎症性肠病、腹泻等。此外，通过对该菌株的进一步鉴定，发现该菌株(Bd312)在细菌形态、培养特性、生理生化反应结果与脆弱拟杆菌相似，经BLASTN序列比对，所分离菌株与脆弱拟杆菌标准株ATCC25285同源性达99％，药敏实验提示，菌株Bd312对头孢拉定、阿莫西林、庆大霉素、磺胺甲嗯唑、甲氧苄啶不敏感，急慢性毒性试验提示无毒性(刘洋洋，等.健康婴儿体内的无毒脆弱拟杆菌的分离及鉴定.中华医学杂志，2014年，第94卷，第30期，第2372-2374页)。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种新的脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)菌株及其在预防和/或治疗抗生素相关性腹泻中的应用。为了实现上述目的，本发明提供了一种脆弱拟杆菌菌株ZY-312，保藏号为CGMCCNo.10685。为了更好地实现上述目的，本发明还提供了上述脆弱拟杆菌在制备用于预防和/或治疗抗生素相关性腹泻的药物中的应用。上述的脆弱拟杆菌应用，其中，所述抗生素相关性腹泻为艰难梭菌感染性腹泻。为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗抗生素相关性腹泻的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312。上述的药物组合物，其中，所述药物组合物为胶囊、溶液、悬乳液、袋装粉剂或颗粒剂。上述的药物组合物，其中，每一单一剂量为106-1011个所述脆弱拟杆菌ZY-312菌株细胞。为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗抗生素相关性腹泻的食品，其中，所述食品含有脆弱拟杆菌ZY-312。为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗抗生素相关性腹泻的保健品，其中，所述保健品含有脆弱拟杆菌ZY-312。为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗抗生素相关性腹泻的食品添加剂，其中，所述食品添加剂含有脆弱拟杆菌ZY-312。本发明的技术效果在于：本发明的脆弱拟杆菌ZY-312属于拟杆菌门，完全不同于属于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等，经过实验证实，与现有的脆弱拟杆菌菌株相比，其耐受胆盐、胃酸的能力更强，对抗生素相关性腹泻疗效显著，益生特性显著优于现有的脆弱拟杆菌菌株。因此，脆弱拟杆菌ZY-312可作为继乳酸杆菌、双歧杆菌之后的第三代益生菌，为疾病的预防和治疗提供新的思路和前景。以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。附图说明图1为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312厌氧培养后菌落形态图；图2为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312革兰氏染色镜检图(1000×)；图3为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312扫描电镜观察图(30000×)；图4为本发明的PCR产物凝胶电泳结果对比图；图5为本发明的PCR产物凝胶电泳结果对比图；图6根据全基因组序列比较建立的系统发育树；图7为治疗抗生素相关性腹泻粪便绝对含水量变化结果对比图；图8为治疗艰难梭菌感染性腹泻粪便绝对含水量变化结果对比图。本发明的脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)ZY-312已于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.10685。具体实施方式下面结合附图对本发明的结构原理和工作原理作具体的描述：本发明的实施方式包括：本发明的新菌株脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)ZY-312，保藏号为CGMCCNo.10685。是在对脆弱拟杆菌进行了更广泛和更深入的研究基础上，对更多来自健康婴儿的粪便进行筛选，并筛选到活性或生理特性更好的脆弱拟杆菌菌株，可提高脆弱拟杆菌对疾病的治疗效果。本发明的新菌株脆弱拟杆菌ZY-312从健康婴儿粪便中分离获得。该菌株可以调节肠道菌群、减轻腹泻症状等，对抗生素相关性腹泻具有治疗作用，效果优于其他益生菌。本发明的脆弱拟杆菌ZY-312可以制备成药物组合物。该药物组合物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312。此外，所述药物组合物还可以含有合适的药物载体。本发明的药物组合物可以为胶囊、溶液或可饮用悬乳液、袋装粉剂、颗粒剂等形式，每一单一剂量一般约为106-1011个脆弱拟杆菌ZY-312细胞。本发明的脆弱拟杆菌ZY-312还可以制备成食品、保健品或食品添加剂的形式。所述食品、保健品或食品添加剂含有脆弱拟杆菌ZY-312。这些食品、保健品或食品添加剂可用于预防和/或治疗抗生素相关性腹泻，提高食用者的健康水平。本发明是从大量脆弱拟杆菌菌株中筛选出的一株新的脆弱拟杆菌ZY-312，经证实不含肠毒素基因bft，是一株无毒株，经过发酵培养、染色镜检及生理生化特性分析及动物实验发现：与现有的其他脆弱拟杆菌菌株相比，脆弱拟杆菌ZY-312具有突出的耐胆盐、耐胃酸等益生特性，可以有效克服现有脆弱拟杆菌在消化道中容易失活等缺点，是新一代益生菌制品的优选菌株。下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需要指出的是，由本发明中的用于预防和/或治疗抗生素相关性腹泻的脆弱拟杆菌或含有本发明的脆弱拟杆菌的药物组合物、食品、保健品和食品添加剂在施用于受试者后，都可以应用于上文所述的适应症并展现出上文所述的功能，在本发明范围内的所有剂型均已测试，下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。除非特殊说明，否则本发明中所使用的试剂都是市售可购买的。实施例1脆弱拟杆菌ZY-312分离、纯化试剂和仪器：(1)培养基A：类杆菌-胆汁-七叶苷(BBE)琼脂(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB7028)基础上加入改良配方，具体成分如下表一：表一(2)培养基B：类杆菌-胆汁-七叶苷(BBE)琼脂(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB7028)基础上加入改良配方，具体成分如下表二：表二(3)培养基C：布氏肉汤(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB0241)中加入胎牛血清，加入量为5％(v/v)(浙江天杭生物科技股份有限公司，品牌：四季青，货号：HB0205)。(4)实验仪器2.5L密封培养罐(三菱瓦斯化学株式会社，C-31)恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHP-9082)显微镜(尼康仪器(上海)有限公司，型号：E100)PCR仪(赛默飞世尔科技公司，型号：AppliedPCR系统9700)电泳仪(北京市六一仪器厂，型号：DYCP-32B)(5)试剂厌氧产气袋(三菱瓦斯化学株式会社，货号：C-1)细菌DNA提取试剂盒(BacterialDNAKit(细菌DNA提取试剂盒)OMEGA，货号：D3350-01)Taq酶(生物工程(大连)有限公司，货号：DR100A)琼脂糖(品牌：Biowest，货号：91622)磺胺甲恶唑(西格玛奥德里奇公司(sigma)，货号：S7507-106)甲氧苄啶(西格玛奥德里奇公司(sigma)，货号：T7883-5G)维生素K1(青岛日水生物科技有限公司，货号：21005)DL1000DNAMarker(宝生物工程(大连)有限公司，货号：D526A)脆弱拟杆菌产肠毒素株(南方医院消化科孙勇老师提供，分离自临床腹泻患者)脆弱拟杆菌标准株ATCC25285(购自广东省微生物研究所)脆弱拟杆菌菌株Bd312(保藏号为CGMCCNo.7280，由广州知光生物科技有限公司提供)BF839菌株(分离自图腾益生液)(6)培养基配置培养基A配置：称取BBE培养基61.5克，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，加入过滤除菌的磺胺甲嗯唑1g、甲氧苄啶4g和无菌脱纤维羊血50mL，混匀，倾入无菌平皿，备用。培养基B配置：称取BBE培养基61.5克，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，加入过滤除菌的磺胺甲嗯唑1g、甲氧苄啶4g，混匀，倾入无菌平皿，备用。培养基C配置：称取布氏肉汤培养基28.1g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，备用。使用前，加入5％的胎牛血清。布氏肉汤配置：称取布氏肉汤培养基28.1g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，备用。方法：1、分离纯化取新鲜的婴儿粪便0.5g，置于盛有4.5mL布氏肉汤的三角瓶中，振荡1分钟。取0.1mL滴于培养基上，划线后，置于厌氧罐中，37℃、培养48小时。挑取典型菌落于布氏肉汤培养基24h，进行革兰氏染色。显微镜下观察形态，选取革兰氏阴性菌的菌液，划线接种于血平皿，厌氧培养48h。根据平板上菌落形态特征及镜下观察菌体的染色特性、大小、球杆状和分布情况，判断是否纯化。如细菌不纯，则继续以上步骤，反复多次分离传代，直至得到纯化的菌株。2、菌落特征脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm，参见图1。3、显微镜下形态脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。4、电镜下形态固定液固定，扫描电镜观察。镜下可见，脆弱拟杆菌ZY-312大小在0.5～0.8×1～4.5μm，无鞭毛，无芽孢，参见图3。5、生化鉴定表三维生化鉴定结果，其中+为阳性，-为阴性表三测定反应底物结果色氨酸-脲素-葡萄糖+甘露醇-乳糖+蔗糖+麦芽糖+柳醇-木糖+阿拉伯糖-明胶-七叶灵+甘油-纤维二糖-/+甘露糖+松叁糖-棉子糖+山梨醇-鼠李糖-海藻糖-API20A(生化反应鉴定板，法国生物梅里埃股份有限公司)生理生化反应结果显示：脆弱拟杆菌ZY-312可发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、七叶灵、甘露糖、棉子糖，符合脆弱拟杆菌的特征。实施例2脆弱拟杆菌ZY-312鉴定聚合酶链式反应(PCR)引物(由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)序列如下：引物对1：正向引物：5’-ACGCTTGCACCCTCCGTATTA-3’反向引物：5’-GCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’引物对2：正向引物：5’-TGGGTGGTTGCTGCCTGGACACA-3’反向引物：5’-CATCCGGGTATGGATATGAA-3’引物对3：正向引物：5’-GATGCTCCAGTTACAGCTTCCATTG-3’反向引物：5’-CGCCCAGTATATGACCTAGTTCGTG-3’bft基因引物对：正向引物：5’-GACGGTGTATGTGATTTGTCTGAGAGA-3’反向引物：5’-ATCCCTAAGATTTATTATCCCAAGTA-3’1、PCR鉴定(PCR即聚合酶链式反应，是常用的快速扩增基因的方法)(1)16SrRNA序列测定取上述菌株接种于培养基A上，37℃、厌氧培养48h。取单一菌接种于液体培养基中，37℃、厌氧培养48h。DNA提取试剂盒提取细菌DNA(天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP302-02)，作为PCR模板DNA。16SrRNA基因序列的扩增：引物对1扩增片段大小约为531bp；引物对2扩增片段大小为518bp；引物对3扩增片段大小约为970bp。采用20μLPCR反应体系：Taq酶10μL、模板DNA2μL、正向反向引物各1μL、无菌去离子水6μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、30个循环、72℃延伸10min。PCR产物在2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100V、15min。PCR产物凝胶电泳结果如图4所示，其中1、2泳道分别为引物对1、引物对2扩增产物；4、5泳道分别为引物对1、引物对2扩增产物(重复PCR的结果)；3、6泳道为引物对3扩增产物；7泳道为DNA分子量标准物(DL1000DNAmarker)。分离菌株DNA采用引物对1进行PCR扩增后产物大小为531bp，采用引物对2进行PCR扩增后产物大小为518bp，采用引物对3进行PCR扩增后产物大小为970bp，符合预期，所分离菌株为脆弱拟杆菌。将PCR产物进行核苷酸序列测定(由深圳华大基因科技有限公司进行测定)，测序结果在Genbank(美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库)上进行BLAST比对(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，见表四。结果表明分离到为一株脆弱拟杆菌。表四为16SrRNA序列BLAST比对结果(部分)表四(2)PCR检测bft基因将测序筛选到的菌株接种于培养基C中，37℃、厌氧培养48小时。取培养菌液2mL，用细菌DNA提取试剂盒提取DNA，作为PCR模板DNA。bft基因的扩增采用bft基因引物，扩增片段大小应为294bp。采用20μLPCR反应体系：Taq酶10μL、模板DNA2μL、上下引物各1μL、无菌去离子水6μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s，55℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100V、15min。结果参见图5，其中1、2、3、4泳道为分离菌株ZY-312电泳结果；5、6、7为产肠毒素株脆弱拟杆菌电泳结果；8泳道为DL1000DNAmarker。4、5泳道为bft基因引物对扩增产物；1、7泳道为引物对2扩增产物；2、6为引物对1扩增产物；3泳道为引物对3扩增产物。结果表明，脆弱拟杆菌ZY-312为一株脆弱拟杆菌，且不含有肠毒素bft基因，为一株新的无毒株。2、全基因组测序分析鉴定对脆弱拟杆菌ZY-312进行全基因组测序(深圳华大基因科技有限公司)，测序结果与已发表的菌株序列相互比对，利用treebest软件(该软件可在sourceforge网站上免费下载，下载链接为：http：//treesoft.svn.sourceforge.net/viewrc/treesoft/)采用邻接法构建NJ-tree或利用软件PhyML采用最大似然法构建最大似然树。系统发育树显示(参见图6)，脆弱拟杆菌ZY-312与脆弱拟杆菌标准株ATCC25285(即NCTC9343)在同一分支上，表明检脆弱拟杆菌ZY-312为一株新的脆弱拟杆菌，与ATCC25285同源。对全基因组测序结果进行毒力基因分析，验证其是否含产毒素bft基因。结果显示，脆弱拟杆菌ZY-312全基因组中不含bft基因，为一株不产肠毒素的新的脆弱拟杆菌。实施例3脆弱拟杆菌ZY-312对胃酸的耐受性(1)人工胃液配制(根据2010年《中国药典》人工胃液配制方法)23.4mL浓HCl溶解于100mL纯化水中，即得稀盐酸。取8.2mL稀盐酸，加入400mL纯化水与5g胃蛋白酶(猪源，1∶15000)，定容到500mL。于37℃、磁力搅拌过夜，即得人工胃液。(2)菌体准备收集菌液，离心，弃上清，生理盐水重悬后，再次离心，弃上清，菌体备用。(3)加入人工胃液测定活菌数向菌体中加入人工胃液，重悬，分别测定0、1、2、3h活菌数。活菌计数采用10倍系列稀释法：取100μL菌液加入900μL布氏肉汤培养基中，逐步梯度稀释至合适浓度。每个平板点4个浓度梯度，每个梯度重复点样3次，每次点样20μL。37℃、厌氧培养48h，数菌落数(取菌落数为3-30的浓度梯度计数)。活菌数(CFU/mL)＝三个点样菌落总和/3×50×稀释度，其中，CFU(Colony-FormingUnits)，菌落形成单位，指单位体积中的活菌个数。表五为不同菌株胃酸耐受实验结果(表中数据为活菌浓度log值，h为小时)表五益生菌必须进入人体的胃肠道并达到一定浓度才能发挥其功能。从口腔到肠道过程中，益生菌首先必须以活菌状态通过胃才有可能进入肠道。食物(尤其是流体)通过胃的时间一般为1-2h。根据饮食结构的不同，人体胃液的pH值波动很大，通常在pH3.0左右，空腹或食用酸性食品时可达pH1.5，食用碱性食品时可达pH4-5，胃液的这种酸性环境可以激活胃蛋白酶原，从而杀死随食物进入胃内的细菌。益生菌如果要在人体内发挥益生作用，就必须具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶的能力。结果表明，与脆弱拟杆菌种其他菌株相比，脆弱拟杆菌ZY-312在3h后活菌浓度仍然较高，而其他菌株的活菌浓度随时间降低很快，说明ZY-312对胃酸耐受性较好，具有很好的益生潜力和应用前景。实施例4脆弱拟杆菌ZY-312对胆盐耐受实验1、实验材料胰蛋白胨大豆肉汤(简称TSB，品牌：OXOID，货号：CM0129B)胰蛋白胨大豆琼脂(简称TSA，品牌：OXOID，货号：CM0131B)牛胆粉(生物工程上海(股份)有限公司，货号：ON1210)胎牛血清(美国MPBiomedicals公司，货号：2916754)2、菌株和试剂的准备胆粉溶液：在TSB中加入牛胆粉，设置三个终浓度，分别为10g/L(1％牛胆粉)、20g/L(2％牛胆粉)和40g/L(4％牛胆粉)。灭菌后加入血清(终浓度50mL/L)待用。同时，以不加胆粉的TSB作为对照。菌株培养与收集：菌株(ZY-312、Bd312、BF839、ATCC25285)于37℃、厌氧液体静态培养至对数生长后期(约14-16小时)，分装至离心管中，每管分装3ml菌液，室温、4000rpm离心5分钟。再用0.01MPBS洗菌1次(室温、4000rpm离心5分钟)，弃上清，沉淀待用。3、人工胆粉培养基中培养用上述胆粉溶液将洗涤后的细菌重悬，用含胆粉溶液调整初始菌液浓度为1×108CFU/mL。并在37℃、厌氧培养1、2、4小时，涂板计数活菌数目的变化，0小时细菌数目作为对照。实验平行做3次。4、计算细菌耐受胆粉情况将上述三个时间点涂板结果，与对应的0小时结果进行比较，即可得到菌株在人工胆粉溶液中作用不同时间后其耐受胆粉的结果，以均数±标准差及统计结果说明。表六为SK08菌株耐胆粉实验结果(n＝3)表六结果如表六所示，0-4h观察，ZY-312在1％、2％、4％浓度胆粉中均可正常生长，随着胆粉浓度升高其活菌数越高，ZY-312活菌数显著高于其他菌株组。结果表明ZY-312耐受胆盐，并显著优于其他菌株。胆盐是肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合形成的钠盐或钾盐，它是胆汁参与消化和吸收的主要成分。胆盐排到小肠后，大部分由小肠黏膜吸收入血，再入肝脏组成胆汁。人体小肠中胆盐的质量浓度在0.03～0.3g/100mL的范围波动。对于活细胞来说，胆盐能破坏细胞膜，因此对胆盐的耐受性是评价益生菌的重要指标之一。益生菌可产生胆盐水解酶，此酶可将甘氨酸和牛磺酸结合的胆盐催化水解为氨基酸残基和游离胆盐。具有胆汁盐解离能力的菌株可以降低高胆固醇人群的血清胆固醇水平和防止正常人高胆固醇血症的发生。消化道中胆盐的浓度不是固定不变的，在进食消化的开始1h，其质量浓度为15～20g/L，之后其质量浓度降为3g/L左右。益生菌必须在通过胃肠过程中，可以在正常的胆盐浓度下存活，如要在小肠中定殖，必须耐受胆盐的抑制作用。因此，相对于脆弱拟杆菌的其他菌株，ZY-312具有更好的应用前景。实施例5脆弱拟杆菌ZY-312对抗大肠杆菌内毒素，保护IEC6细胞细胞：ICE6细胞(大鼠小肠隐窝上皮细胞，南方医科大学微生物学系提供)对数生长期的ICE6细胞以3×104/mL，每孔100μL接种于96孔培养板，37℃，5％CO2孵育24h后，吸弃培养液，加入10μg/mL的大肠杆菌内毒素。不同组分别加入磷酸盐缓冲液(PBS)、1×106CFU/mL的ZY-312菌液、ZY-312菌液超声粉碎液、Bd312菌液、BF839菌液及ATCC25285菌液200μL，每组5个复孔，培养44h后，每孔加入5g/L的MTT20μL，继续孵育12h。然后用LDH法测定各组细胞毒性。表七为脆弱拟杆菌ZY-312对抗大肠杆菌内毒素结果，其中，*标识和阴性对照组相比有统计学差异；△表示和阳性对照组有统计学差异表七该结果说明，脆弱拟杆菌ZY-312活菌和超声粉碎液对IEC6细胞起到保护作用，不受大肠杆菌内毒素LPS的毒害，其疗效显著优于其他脆弱拟杆菌菌株。而大肠杆菌是菌群失调中比较常见的致病菌，故ZY-312具有治疗抗生素相关性腹泻潜力，其代谢产物和细菌分泌蛋白也有保护上皮细胞的功能。实施例6脆弱拟杆菌ZY-312对抗生素相关性腹泻疗效用三联抗生素(克林霉素、氨苄西林、链霉素)联用构建抗生素相关性腹泻模型，随后分别用含1×109CFU/mL活菌数的ZY-312、Bd312、BF839及ATCC25285菌液治疗，观察疗效。实验动物：SD大鼠。实验分组：取40只大鼠随机分为4组，ZY-312组、Bd312组、BF839组、ATCC25285组。动物模型构建：三联抗生素(克林霉素、氨苄西林、链霉素)联用灌胃。具体操作步骤：腹腔注射给予150mg/kg的三联抗生素0.2mL，每天1次，共7天；第8天不同组分别给予109CFU/mL的ZY-312、Bd312、BF839、ATCC25285菌液治疗7天，每天观察临床症状并称量粪便干湿重。治疗结束后解剖大鼠，病理观察。主要实验结果参见表八及图7：表八为治疗前后各组的软便动物数/动物总数变化，其中*代表和模型对照组相比有统计学差异：表八表八显示，各组动物每天腹泻动物的只数，从表中可以看出ZY-312组从治疗期第5天开始，腹泻动物只数明显减少，与其他组具有显著性差异，并一直持续到实验结束；Bd312组动物数也有所减少，但减少程度不及ZY-312组，且症状有反复，说明ZY-312治疗抗生素相关性腹泻效果最显著。图7表明，ZY-312组、Bd312组的动物粪便含水量存在下降趋势，ZY-312组下降趋势最明显并且有统计学差异，证实ZY-312能显著降低粪便中的含水量，起到止泻效果。综上所述，ZY-312在治疗第5天的腹泻率就明显降低，其他组的腹泻率直到恢复期都无明显降低，ZY-312对于抗生素相关性腹泻具有很好的治疗作用。实施例7脆弱拟杆菌ZY-312对艰难梭菌感染腹泻疗效实验动物：C57BL/6小鼠。实验分组：取40只小鼠随机分为4组，ZY-312组、Bd312组、BF839组、ATCC25285组。动物模型构建：克林霉素腹腔注射联合艰难梭菌灌胃。具体操作步骤：腹腔注射给予50mg/kg的克林霉素0.2mL，每天1次，共3天；第4天灌胃给予艰难梭菌菌液造成艰难梭菌性腹泻模型。第5天不同组分别给予109CFU/mL的ZY-312、Bd312、BF839、ATCC25285菌液治疗7天。第8天解剖，病理观察。病理评分标准如下(参考TalamisuTSUKAHARA，YoshieIWASAKI，KeizoNAKAYAMAetal.Microscopicstructureofthelargeintestinalmucosainpigletsduringanantibiotic-associateddiarrhea(抗生素相关性腹泻仔猪小肠黏膜的显微结构).J.vet.Med.Sci，2003，65(3)：301-306.)：(1)水肿，0分：无水肿；1分：只有少量(＜2X)多发性黏膜下扩张的轻微性水肿；2分：中量(2～3X)多发性黏膜下扩张的中度水肿；3分：大量(＞3X)多发性黏膜下扩张的重度水肿；4分：弥漫性黏膜下扩张的重度水肿。(2)炎性细胞浸润，0分：无炎症；1分：少量多灶性中性粒细胞浸润；2分：中度多灶性中性粒细胞浸润(累及更多的黏膜下层)；3分：大量多灶性甚至聚集性中性粒细胞浸润(累及更多的黏膜下层及肌层)；4分：病灶累及同3分，但出现了脓肿或更广泛的肌层受累。(3)肠上皮损伤，0分：无肠上皮损伤改变；1分：少量多灶性浅表上皮损伤(空泡出现，个别细胞凋亡，绒毛顶端衰减/坏死)；2分：中量多灶性浅表上皮损伤(空泡出现，个别细胞凋亡，绒毛顶端衰减/坏死)；3分：大量多灶性上皮损伤空泡出现，个别细胞凋亡，绒毛顶端衰减/坏死)±伪膜形成(管腔内有含中性粒细胞，脱落上皮的纤维性渗出)；4分：在3分基础上出现更明显的伪膜或者上皮溃疡(病灶处上皮完全性脱落)。主要实验结果(参见表九、表十及图8)：表九为腹泻率的变化结果，*代表和模型对照组相比有统计学差异表九表十为病理评分结果，*代表和模型对照组相比有统计学差异表十表九、表十和图8表明，ZY-312组在治疗第5天开始能显著降低小鼠腹泻率及粪便含水量，治疗7天病理评分显著低于其他各组，说明ZY-312组的炎症明显减轻，其治疗效果显著优于其他脆弱拟杆菌菌株，证明ZY-312可有效治疗艰难梭菌感染性腹泻。本发明的脆弱拟杆菌ZY-312属于拟杆菌门，完全不同于属于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等，经过实验证实，与现有的脆弱拟杆菌菌株相比，其耐受胆盐、胃酸的能力更强，对抗生素相关性腹泻疗效显著，益生特性显著优于现有的脆弱拟杆菌菌株。当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。当前第1页1 2 3