专利名称：海洋微生物来源的杀虫化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杀虫化合物，特别涉及一种从海洋放线菌南海8号的菌丝体中提取分离的杀虫化合物ST及其制备方法和应用。
背景技术：
甜菜夜蛾(spoptera exigua Hubner)已成为一种世界性害虫，由于食性杂，可广泛为害蔬菜、花卉、药用作物、牧草等栽培作物，已知寄主多达170种以上。近年来，该虫的危害逐渐加重，尤其在高温期为害十分突出，已成为农业生产上的一种重要害虫。甜菜夜蛾每年可繁殖数代，如福建省每年可繁殖8代，在宾川地区一年发生6～7代，世代重叠。由于在对甜菜夜蛾的防治上仍然主要依赖于大量使用化学农药，加上操作上的不规范，使甜菜夜蛾普遍产生了抗药性，其中对有机磷、拟除虫菊酯类杀虫剂普遍产生抗药性，而且抗性发展较快，抗性水平也相对较高，对氨基甲酸酯类杀虫剂也表现出较高的抗性。甜菜夜蛾对多种药剂产生的抗药性问题是不容忽视的，已在国际上引起了广泛的重视。
寻找新的农用抗生素是当今生物农药研究领域的一个重要课题，从海洋微生物中寻找有杀虫活性的抗生素更是研究的热点。杀虫抗生素作为农用抗生素中最为重要的一个部分在农用抗生素的研究中占据了重要地位。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种海洋微生物来源的杀虫化合物ST。该杀虫化合物ST为通过大量的活性筛选从海洋放线菌南海8号菌体中分离纯化得到的活性组分。
本发明的另一目的在于提供上述杀虫化合物ST的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述杀虫化合物ST的应用，该杀虫化合物ST对甜菜夜蛾的较高的生物活性。
本发明所用菌种为海洋放线菌南海8号(Strptomyces sp.GDPPRA NH8)，链霉菌属(Streptomyces)，学名为Streptomyces sp，菌种在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏时间为2006年9月5日，保藏号为CCTCC NoM 206087。
GDPPRA NH8的形态特征为在高氏一号琼脂培养基上，基丝乳白至黄白色，气丝灰褐色，无可溶性色素。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种海洋微生物来源的杀虫化合物的制备方法，包括如下步骤(1)海洋放线菌南海8号的种子培养将高氏一号培养基装入茄子瓶中，121℃高压灭菌30mins，取出摆斜面，冷却凝固后在无菌条件下接入菌种，在28℃下培养4～6d，即菌丝和孢子生长成熟。
(2)海洋放线菌南海8号的的发酵培养将斜面中培养好的菌株制成浓度约为1×107个/ml的孢子悬浮液，取0.2ml孢子悬浮液接入50ml发酵培养基中，30℃160转/分钟连续培养96小时后，将培养好的发酵液过滤，收集菌丝体。
(3)在室温(28±1℃)下将海洋放线菌南海8号的菌丝体用70％乙醇按照W菌丝体∶V70％乙醇为1∶2的比例分别浸提两次，所得菌丝浸取液浓缩至固体浸膏。
(4)将固体浸膏用乙酸乙酯按照W浸膏∶V乙酸乙脂为1∶2比例分别萃取两次，将萃取得到溶液浓缩后得到萃取物。
(5)对萃取物进行真空液相层析(硅胶H，100～200目)，通过甲醇溶剂体系进行洗脱。
(6)将真空液相层析后得到的组分进行硅胶柱层析(硅胶H，100～200目)，通过V甲醇∶V三氯甲烷为1∶4进行洗脱，纯化得到淡黄色片状结晶，即为杀虫化合物。
所述菌种为海洋放线菌南海8号(Strptomyces sp.GDPPRA NH8)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏时间为2006年9月5日，保藏号为CCTCC NoM206087。
所述高氏一号培养基优选组成为可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，海水精 3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O1.03g，琼脂16g，PH7.2～7.4，水1000ml。
所述的发酵培养基组成为大豆蛋白粉30g，蔗糖40g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，PH7.2～7.4，水1000ml；在121℃高压灭菌半小时。
一种杀虫化合物ST就是通过上述制备方法制备而成。
上述杀虫化合物ST在制备防治甜菜夜蛾的药剂中的应用，该杀虫化合物ST对甜菜夜蛾具有较高的生物活性。
本发明与现有技术相比，其优点和有益效果在于1)本发明杀虫化合物ST作为一种新型的杀虫抗生素，对甜菜夜蛾表现出较高的生物活性；并比较系统地研究了对甜菜夜蛾生物活性，为生产上应用提供了理论依据。本发明提取过程简单，为工业提取奠定了基础。
2)本发明杀虫化合物ST本身为一种生物农药，对环境无污染。
本发明的试验证明，杀虫化合物ST对甜菜夜蛾表现出较高的胃毒和拒食活性，同时也有较好的触杀活性。甜菜夜蛾各龄幼虫的胃毒毒力测定结果2龄幼虫24h、48h和72h的LC50分别为3.02ug/mL、2.34ug/mL和1.42ug/mL，3龄幼虫24h、48h和72h的LC50分别为6.40ug/mL、5.00ug/mL和2.73ug/mL，4龄幼虫24h、48h和72h的LC50分别为10.10ug/mL、5.06ug/mL和3.66ug/mL。ST对甜菜夜蛾3龄幼虫的拒食活性表明浓度为5ug/mL时拒食率在75％以上，对3龄幼虫的触杀活性表明在浓度为100ug/mL时24h、48h和72h死亡率都在90％以上，同时试验结果还表明杀虫化合物ST对三龄幼虫的生长发育有明显的抑制作用。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的介绍，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1杀虫化合物ST的提取制备a.海洋放线菌南海8号的种子培养改良的高氏一号培养基，其组成为可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，海水精 3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O1.03g，琼脂16g，PH7.2～7.4，水1000ml；上述培养基配好装入茄子瓶中，121℃高压灭菌30mins，取出摆斜面，冷却凝固后在无菌条件下从菌种保藏砂土小试管中接入菌种(海洋放线菌南海8号)，放在28℃下培养4～6d，即菌丝和孢子生长成熟。
b.海洋放线菌南海8号的发酵培养基大豆蛋白粉30g，蔗糖40g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，PH7.2～7.4，水1000ml；高压灭菌锅121℃下灭菌半小时。
c.海洋放线菌南海8号的发酵培养将斜面中培养好的菌株(海洋放线菌南海8号)制成孢子悬浮液(浓度约为1×107)，取0.2ml孢子悬浮液接入250ml三角瓶，内装50ml发酵培养基，30℃160转每分钟在摇床上连续培养96小时后取出。
d.将上述培养好的发酵液过滤，收集菌丝体。
e.在室温(28±1℃)下将海洋放线菌南海8号的菌丝体用70％乙醇按照W菌丝体∶V70％乙醇为1∶2的比例分别浸提两次，所得菌丝浸取液浓缩至固体浸膏。
f.将固体浸膏用乙酸乙酯按照W浸膏∶V乙酸乙脂为1∶2比例分别萃取两次，将萃取得到溶液浓缩后得到萃取物。
g.应用砂芯漏斗和真空泵组成真空液相层析仪，对萃取物进行真空液相层析(硅胶H，100～200目)，通过2000ml甲醇溶剂体系进行洗脱。
i.将真空液相层析后得到的组分进行硅胶柱层析(硅胶H，100～200目)，通过V甲醇∶V三氯甲烷为14进行洗脱，纯化得到淡黄色片状结晶，即为杀虫化合物ST。
实施例2本发明的杀虫化合物ST通过试验，表明杀虫化合物ST对甜菜夜蛾表现出较高的胃毒和拒食活性，同时也有较好的触杀活性。
杀虫化合物ST用丙酮稀释，然后再用V丙酮∶V水＝3∶7进行对半稀释至所需浓度。采用鳞翅目幼虫胃毒毒力测定方法测定对各龄幼虫的活性，采用叶碟法测定拒食活性，采用点滴法测定对甜菜夜蛾的触杀活性。结果如表1、表2和表3所示。
表2杀虫化合物ST对甜菜夜蛾3龄幼虫的触杀活性
表1杀虫化合物ST对甜菜夜蛾各龄幼虫的胃毒作用
表3杀虫化合物ST对甜菜夜蛾3龄幼虫的拒食活性
实施例3采用胃毒作用方法在低剂量下观察杀虫化合物ST对甜菜夜蛾三龄幼虫生长发育状况，成虫采用10％蜂蜜和不同浓度化合物ST粗品稀释液饲喂，观察对成虫的影响。
试验结果表明杀虫化合物ST能明显降低甜菜夜蛾的化蛹率，并随着浓度的增加其雌雄性比明显增高。杀虫化合物ST对甜菜夜蛾成虫产卵量和雌雄成虫寿命有显著的抑制作用。结果如表4和表5所示。
表4杀虫化合物ST对三龄幼虫化蛹、蛹重、羽化及雌雄性比的影响
表5杀虫化合物ST对成虫产卵量和寿命的影响
从试验结果看出，本发明的杀虫化合物ST通过试验表明对甜菜夜蛾表现出较高的胃毒和拒食活性，同时也有较好的触杀活性。杀虫化合物ST能明显降低甜菜夜蛾的化蛹率，并随着浓度的增加其雌雄性比明显增高。杀虫化合物ST对甜菜夜蛾成虫产卵量和雌雄成虫寿命有显著的抑制作用。甜菜夜蛾为蔬菜上重要害虫，杀虫化合物ST作为一种新颖的活性化合物对甜菜夜蛾表现较高的生物杀虫活性，是一种新型的特效生物农药。
权利要求
1.一种海洋微生物来源的杀虫化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)海洋放线菌南海8号的种子培养将高氏一号培养基装入茄子瓶中，121℃高压灭菌30mins，取出摆斜面，冷却凝固后在无菌条件下接入菌种，在28℃下培养4～6d；(2)海洋放线菌南海8号的的发酵培养将斜面中培养好的菌株制成浓度为1×107个/ml的孢子悬浮液，取0.2ml孢子悬浮液接入50ml发酵培养基中，30℃160转/分钟连续培养96小时后，将培养好的发酵液过滤，收集菌丝体；(3)在室温下将海洋放线菌南海8号的菌丝体用70％乙醇按照W菌丝体∶V70％乙醇为1∶2的比例分别浸提两次，所得菌丝浸取液浓缩至固体浸膏；(4)将固体浸膏用乙酸乙酯按照W浸膏∶V乙酸乙脂为1∶2比例分别萃取两次，将萃取得到溶液浓缩后得到萃取物；(5)对萃取物进行真空液相层析，通过甲醇溶剂体系进行洗脱；(6)将真空液相层析后得到的组分进行硅胶柱层析，通过V甲醇∶V三氯甲烷为1∶4进行洗脱，纯化得到淡黄色片状结晶，即为杀虫化合物。
2.根据权利要求1所述的一种海洋微生物来源的杀虫化合物的制备方法，其特征在于，所述菌种为海洋放线菌南海8号即Strptomyces sp.GDPPRA NH8，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏时间为2006年9月5日，保藏号为CCTCCNoM 206087。
3.根据权利要求1所述的一种海洋微生物来源的杀虫化合物的制备方法，其特征在于所述高氏一号培养基的组成为可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，海水精3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，琼脂16g，PH7.2～7.4，水1000ml。
4.根据权利要求1所述的一种海洋微生物来源的杀虫化合物的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基组成为大豆蛋白粉30g，蔗糖40g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，PH7.2～7.4，水1000ml；121℃高压灭菌半小时。
5.一种海洋微生物来源的杀虫化合物通过权利要求1所述的制备方法制备而成。
6.权利要求5所述的海洋微生物来源的杀虫化合物在制备防治甜菜夜蛾的药剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种海洋微生物来源的杀虫化合物及其制备方法和应用。该化合物是从海洋放线菌南海8号的菌体中提取分离而得到。该杀虫化合物对甜菜夜蛾表现出较高的胃毒和拒食活性，同时也有较好的触杀活性。本发明杀虫化合物对甜菜夜蛾表现出较高的生物活性；并比较系统地研究了对甜菜夜蛾生物活性，为生产上应用提供了理论依据。本发明提取过程简单，为工业提取奠定了基础。
文档编号A01P7/04GK1923008SQ20061012227
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月21日 优先权日2006年9月21日
发明者林壁润, 沈会芳, 蒲小明, 潘群英, 李晓刚 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所