用于改良免疫性的益生肠道球菌的制作方法

专利名称：用于改良免疫性的益生肠道球菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物营养物及其在免疫应答方面的作用。具体地，本 发明利用益生生物向动物施用，从而改良先天和适应性的免疫并增强动物 中的疫苗效能。
背景技术：
本说明书中引用了多种出版物，包括专利、公开的应用、技术文献和 学术文献。这些出版物在此处以其整体引用作为参考。在说明书中没有完 全引用的出版物在说明书末尾列出。益生菌的定义为活的微生物，当其以适当量施用时，具有使宿主健康的作用。(Schrezenmeir J等人(2001))。理论上益生菌可以通过增加粘膜表 面对病原菌定居的抗性(抗移植性)(Sanders ME (2003))或通过对消化道联 合淋巴组织(GALT)直接起作用，来行使其有益健康的作用，从而产生免疫 调节物质。(Isolauri E等人(2001a);和Macpherson AJ等人(2004))。益生菌在人药物中曾用于调控多种传染性疾病的过程。(Isolauri E (2001b))。相反，在兽医学方面的研究很少，大多数兽医学研究在大型动 物中进行，其中益生菌用于尝试改变粪便病原体的释放(Kim LM等人 (2001))或改良生产参数(例如体重增加、饲料转换率和死亡率的减少)。在 一个动物研究中，将粪肠球菌(五"te coccMs/"ed"附)菌林SF68 (NCIMB 10415)喂给一组接种过犬痘热病毒(CDV)的狗，并与只接受接种过疫苗的 安慰剂组进行比较。(Benyacoub J等人(2003))。与对照狗相比较，补充SF68 的狗具有增加的血清和粪便的总IgA浓度、增加的CDV-特异性IgG和IgA 血清浓度、和增加的循环B淋巴细胞百分数，证明此种益生菌可以诱导免疫增强效应。猫痙病毒(FPV)是一种病毒，可导致病毒血症，随后导致严重的胃肠 疾病；适当接种的小猫具有消除性免疫。(Richards J等人(2001))。然而， 在猫医学方面，病毒上呼吸道感染仍然是一个主要问题。(Sykes JE等人 (1999))。猫鼻气管炎病毒(FHV-1)和猫杯状病毒(FCV)是综合征中涉及的两 种病毒病原体。而在接种病原激发菌林以后，与未接种对照相比较，接种 FCV疫苗诱导>95%的相对效能，接种FHV-1疫苗只诱导约60%的相对 效能。(Lappin MR等人2002)。因此，尽管FHV-1是广泛普及的疫苗， 其仍然具有显著的问题。(Sykes JE等人(1999))。先前的改良疫苗效能方面 的尝试包括产生更大副作用的鼻内给药，(Scott FW等人(1999))，和降低 疾病严重度但不降低病原携带状态传播的有毒菌抹的基因操作(SlaterE等 人(1976))。病原携带状态可以导致宿主复发或再感染，以及传播给同住者。 曾经尝试过慢性FHV-1感染的多种疗法，包括干扰素a、环钻术、抗病毒 药物、鼻切开术、糖皮质激素、局部解充血剂和针对二次细菌感染的抗生 素(VanPeltDR等人(1994))。然而，这些都不能清除慢性病毒感染；因此 常见病毒释放和临床疾病的复发。在预防和控制a疱渗病毒感染的过程中， 细胞介导和IgA粘膜免疫应答都是很重要的(Lappin MR等人(2002);和 Slater E等人(1976))。改良FHV-1疫苗或接种应答必需减少该病原体所诱 导的发病率。发明内容本发明一方面特征在于以在动物中调控免疫或增强疫苗效能的有效量 的一种或多种益生生物组成的组合物。调控免疫应答和增强疫苗效能用于 保护动物和减少病原体诱导的发病率和死亡率。在某些实施方案中，组合物是宠物或动物食品组合物、饮食添加物、 或为人消耗配制的食物产品。在多种实施方案中，益生生物包括至少一种 单独的肠道球菌属(五"紐/v"cc附^p.)，或与其他益生生物，例如链球菌属 (5W/7tococc附5/^.)、 乳軒菌属(丄"ctoAfl"7/附s萍)、乳球菌属(Lflrctocwcw515/7/ .)、芽孢杆菌属(5"d//ws 5p/ ,)、双歧杆菌属(BiyMMacfenYi/w 5/ / .)或酵母 菌属(5Vicc^"fWMj;c"印/;.)组合。在优选实施方案中，益生生物是粪肠球菌 NCIMB 10415 (SF68)。组合物可能包含附加成分。例如包括一种或多种能 够进一步增强免疫性的化合物，例如7-氧代脱氢表雄酮。在特定实施方案中，为陪伴动物，例如猫配制组合物。在其他实施方 案中，为非陪伴动物，尤其是猫科成员配制组合物。在其他实施方案中， 为人消耗配制组合物。本发明的另一方面是在动物中调控免疫性的方法，包含基于常规J^出 以有效量给动物施用如上所述由一种或多种益生生物组成的组合物，从而 调节动物的免疫性。在特定实施方案中，本方法应用于陪伴动物，例如猫。 在另外实施方案中，本方法应用于非陪伴动物，尤其是猫科成员。在其他 实施方案中，本方法应用于人。本发明的另一方面是增强动物中疫苗效能的方法，包含基于常规基础 以有效量给动物施用如上所述由一种或多种益生生物组成的组合物，从而 增强动物中的疫苗效能。在优选实施方案中，疫苗是猫鼻气管炎病毒(feline rhinotracheitis vims)、 猫杯状病毒(feline calcivirus)或猫瘋病毒(feline panleukopenia virus)。在特定实施方案中，本方法应用于陪伴动物，例如 猫。在另外实施方案中，本方法应用于非陪伴动物，尤其是猫科成员。在 其他实施方案中，本方法应用于人。本发明的另 一方面是如上所述一种或多种益生生物作为调控动物免疫 性的医药产品或組合物的用途。在特定实施方案中，组合物是功能性食品 或饮食添加物。組合物可以作为陪伴动物，例如猫的饲料。在其他实施方 案中，组合物可以应用于非陪伴动物，尤其是猫科成员。在其他实施方案 中，本用途可以应用于人。本发明的另一方面是如上所述一种或多种益生生物作为增强动物疫苗 效能的医药产品或组合物的用途。在特定实施方案中，组合物是功能性食 品或饮食添加物。基于常规标准给动物施用有效量的组合物，从而增强动 物中的疫苗效能。在优选实施方案中，疫苗是猫鼻气管炎病毒、猫杯状病毒或猫瘋病毒。在特定实施方案中，组合物可以应用于陪伴动物，例如猫。 在其他实施方案中，组合物应用于非陪伴动物，尤其是猫科成员。在其他 实施方案中，组合物可以应用于人。通过参考如下附图、发明详述和实施例将会使本发明的其他特征和优 势清楚显示。附图简述


图1 ，每天补充150 mg鸡肉消化液PO (安慰剂，n-9)或150 mg混合 5xl08 cfu/天的粪肠球菌菌林SF68 (治疗，n-9)的鸡肉消化液的小猫，从 第7周龄开始到27周龄的体重(a)和粪便评分(b)。在第9和12周龄给小猫 皮下接种商业上可获得的减毒活FHV-1疫苗d。盒和虛线代表最小、最大、 中间值以及25百分比和75百分比(25th and 75th percentiles)。在所有时间 点p>0.05。图2，从补充(治疗)或未补充(安慰剂)SF68的小猫血清(a)和唾液(b)中 获得的FHV-1特异性的IgA。盒和虚线代表最小值、最大值、中间值以及 25百分比和75百分比。在所有时间点p>0.05。图3 ，从补充(治疗)或未补充(安慰剂)SF68的小猫血清中获得的FHV-1 特异性的IgG。盒和虚线代表最小值、最大值、中间值以及25百分比和 75百分比。在所有时间点p>0.05。图4，从补充(治疗)或未补充(安慰剂)SF68的小猫中获得的FCV特异 性的IgG。盒和虛线代表最小值、最大值、中间值以及25百分比和75百 分比。在所有时间点p>0.05。图5，从补克(治疗)或未补充(安慰剂)SF68的小猫中获得的FPV特异 性的IgG。盒和虛线代表最小值、最大值、中间值以及25百分比和75百 分比。在所有时间点p>0.05。图6，补充(治疗)或未补充(安慰剂)SF68的小猫粪l更提取物中的总IgG (a)和IgA(b)。盒和虚线代表最小值、最大值、中间值以及25百分比和75 百分比。在所有时间点p>0.05。图7，通过流式细胞计数得到的补充(治疗)或未补充(安慰剂)SF68的 小猫外周血中CD4(a)和CD8(b)阳性门控淋巴细胞的百分数。盒和虛线代 表最小值、最大值、中间值以及25百分比和75百分比。*表示治疗组显著 高于安慰剂组的时间点。说明性实施方案的详述 .说日/语。这些术语除非另外说明均为其在本领域内的常用意义。其他特殊定义 的术语以此处给出的定义进行解释。在说明书和实施例中可能用到的缩写如下FHV-1，猫鼻气管炎病毒; FCV,猫杯状病毒；FPV，猫瘋病毒；spp.，种；ELISA，酶联免疫吸附测定; DM，干物质；CFU，菌落形成单位；kg，千克；BW，体重。"有效量"指在此处描述为有效达到特定生物学结果的化合物、材料 或组合物的量。此类结果包括(但是不限于)在动物中改良免疫性或增强疫 苗效能。此类有效活性可以例如通过向动物施用本发明的组合物来实现。在本说明书中，术语"约"解释为任选加或减20。/。，更优选任选加或 减10%,甚至更优选任选加或减5%，甚至更优选任选加或减2%，最优 选任选加或减1%。"包含"解释为"包括，在其他事物之中"，并非意指"仅包括"。"适应性免疫"或"适应性免疫应答"可以互换使用，并且此处为广 义使用，指对抗原激发的免疫应答，包括免疫记忆的发生。适应性免疫应 答包括(不限于)体液和细胞免疫。"体液免疫"或"体液免疫应答"在此处可以互换使用，指应答抗原 激发而产生免疫球蛋白分子。"细胞免疫"或"细胞免疫应答"或"细胞介导免疫"在此处可以互 换使用，指应答抗原激发而激活细胞毒素或辅助T淋巴细胞、单核细胞和 细胞因子。术语包含所有不能转化为具有抗体的天然接受者的适应性免疫。"先天免疫"指机体对抗病原的非特异性机制，其并不由于特定抗原的后来的刺激而增强。"调控免疫"或"免疫的调控"指任意增强或抑制机体对抗原激发产 生先天或适应性免疫应答的能力，其可以通过本领域内任意合适方法测量。"疫苗效能"指疫苗在动物上针对特异性病原产生预期治疗或保护效 应的能力。"增强的疫苗效能"指疫苗在动物上针对特异性病原产生预期治 疗或保护效应的能力方面的任意改良，其通过本领域内任意合适的方法测 量。"益生生物"指对宿主动物发挥有益作用(例如增加健康或对抗疾病) 的任意生物，尤其是微生物。益生生物可以展现一种或多种如下非限制性特征对宿主无病原性或无毒性；以有活力的细胞存在，优选以大量数目 存在；在消化道环境中能够存活、代谢和持续(例如抵抗低pH和胃酸和分 泌物)；黏附于上皮细胞，尤其是胃肠道上皮细胞；有对病原细菌的杀微生 物或杀菌活性或效应；抗癌活性；免疫调控活性，尤其是增强免疫性；对 内源菌群的调控活性；增强泌尿生殖道健康；在创伤或创伤周围的抗菌活 性和促进创伤愈合；减少腹泻；减少过敏反应，减少新生儿坏死性小肠结 肠炎；减少炎症性肠疾病；和减少肠渗透性。(Reid G等人(2003); Drisko JA 等人(2003);和Oyetayo VO等人(2004))本发明涉及任意的动物，优选哺乳动物，并且在一个实施方案中的陪 伴动物。"陪伴动物"是任意家养的动物，包括(不限于)猫、狗、兔、豚鼠、 雪貂、仓鼠、小鼠、沙鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、驴、猪等等。最优选 狗和猫，并且此处以猫作为例证。在特定实施方案中，"动物，，可以是人。 在其他实施方案中，本发明涉及陪伴动物以外的动物。特别地，本方法涉 及猫家族猫科成员，本发明可以应用于例如可以有效实现将益生组合物施 用于猫的情况(例如在动物园、兽医实验室、野生动物保护区等等)。除家 养的猫以外，猫科猫属包括的成员有(l)猎豹属(Acinonyx)，例如猎豹(A. jubatus)， (2)云豹属，例如云豹(N. nebulosa), (3)豹属，例如狮(P. leo)和美 洲虎(P. onca)、豹(P.pardus)、虎(P. tigris); (3)Uncia,例如雪豹(U. uncial); (4)美洲狮(puma)，例如美洲豹、山狮或美洲狮(P. concolor)和(5)多种非家猫属(Felis)，包括(但不限于)婆罗洲金猫(F. badia)、山猫(F. caracal)、中 国山猫(F. bieti)、丛林猫(F. chaus)、沙猫(F. margarita)、黑足猫(F. nigripes)、 野猫(F. sylvestris， F. lybica)、豹猫(F. yagouraroimdi)、虎猫(F. pardalis)、 小斑虎猫(R tigrina)、长尾猫(F. widdi)、薮猫(F. servat)、猞猁(F. lynx)、 短尾猫(F. rufus)、南美草原猫(F. colocolo)、乔氏猫(F. geoffroyi)、安第斯 山猫(F. jacobita)、兔狲(F manul)、南美林猫(F guigna)、美洲豹猫(F. bengalensis， F. iriomotensis)、扁头猫(F. planiceps)、锈斑猫(F. rubiginosus)、 渔猫(F.viverrina)和非洲金猫(Faurata)。除非另外说明，此处所用术语"猫 科"或"猫科动物"指所有猫科成员。此处所用术语"宠物食品"、"宠物食品组合物"、"动物食品"或"动 物食品组合物"指由动物，优选陪伴动物计划摄取的组合物。"完全和营养 平衡的宠物或动物食品"是含有基于动物营养领域^H人权威所推荐的合适 量的所有已知的必需营养素，和因此其可以作为维持生命或促进生产的饮 食摄入的唯一来源，而不需附加补充的营养来源。营养平衡的宠物食品和 动物食品组合物是本领域已知和广泛使用的。此处所用"饮食添加物"是动物除正常饮食外计划摄入的产品。 此处所用"为人消耗配制的食物产品"是人计划摄入的任意组合物。 为使说明书清楚和简明，此处描述了某些实施方案，但是应该理解这 些实施方案的特征可以在本发明的范围内进行多种组合或分离。发明描述发明者发现含益生生物(例如粪肠球菌NCIMB 10415 (SF68))的饮食 添加物可以增加小猫的CD4+淋巴细胞数。相应地，本发明的多个方面通 过提供改良动物免疫性和促进动物中疫苗效能的食品组合物和方法利用这 些发现。组合物本发明的一方面特征是由一种或多种益生生物以在动物中调控免疫性或增强疫苗效能的有效量组成的组合物。在一个优选实施方案中，益生生 物调控动物的先天免疫。在更优选的实施方案中，益生生物调控动物的适 应性免疫应答。在另外的优选实施方案中，益生生物在动物中增加对抗FHV-1、 FCV和FPV的疫苗的效能。益生生物可以是组合物的组成成分或附加成分。益生生物可以是原核、 真核或古细菌。在组合物的多种实施方案中，益生生物包含至少一种单独 的任意合适菌林或肠道球菌亚种，或与其他益生生物结合，包括链球菌属、 乳杆菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属、或酵母属。肠道球菌属 包括(不限于)粪肠球菌，尤其是粪肠球菌菌林SF68，和其他肠道球菌，例 如粪肠球菌DSM 10663 (M74)、粪肠球菌GHR 017 DSM 7134、粪肠球菌 CECT 4515、粪肠球菌CL15/ATCC 19434、粪肠球菌NCMB 11181/DSM 5464、粪肠球菌1MB 52/DSM 3530、粪肠球菌CNCM MA 17/5U、粪肠球 菌202DSM4788/ATCC53519、粪肠球菌301 DSM 4789/ATCC 55593、粪 肠球菌ATCC 19434、粪肠球菌EF-101 ATCC 19434和粪肠球菌AK 2205 BCCM/LMG S-16555。链球菌属包括(不限于)粪链球菌、嗜热链球菌和唾 液链球菌。乳杆菌属包括(不限于)嗜酸乳杆菌(Lactobadllus acidophilus), 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、 保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casd)、纤维二糖乳杆菌 (Lactobacillus cellobiosus)、 巻曲乳才干菌(Lactobacillus crispatus)、 弯曲乳 杆菌(Lactobacillus curvatus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus ferme幽m)、 GG 乳杆菌(鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)或干酪乳杆菌鼠李糖亚种 (Lactobacillus casei subspecies rhamnosus))、 力口氏乳軒菌(Lactobacillus gasseri)、 干酷乳軒菌(Lactobacillus johnsonii)、胚芽乳軒菌(Lactobacillus pantarum)、 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarus)、 罗 <尹乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)、 干酪乳杆菌LAI (Lactobacillus johnsonii LAl)、 嗜酸乳杆菌NCFB 1748、干酪乳杆菌(LactobacillusShirota)、嗜酸乳杆菌 NCFM、嗜酸乳杆菌DDS-1、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)德氏亚 种、德氏乳杆菌保加利亚亚种2038型、嗜酸乳杆菌SBT-2062、唾液乳杆菌UCC118、副酪蛋白乳杆菌(Lactobacillusparacasei)STll、和副酪蛋白 乳杆菌副酪蛋白亚种F 19。乳球菌属包括(不限于)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和植物乳球菌(Lactococcus plantarum)。杆菌属包括(不限于)枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)。双歧杆菌属包括(不限于)青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolescentis)、 两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、 动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、 长双歧杆菌 (Bifidobacterium Iongum)、 假长双歧軒菌 (Bifidobacterium pseudolongum)、嬰儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和乳酸双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)。酵母菌属包括(不限于)哞酒酵母(Saccharomyces boulardii)(cerevisiae)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物是宠物或动物食品组合物。 这些最好包括供给必需饮食需要的食物和零食(treats)(例如饼干)或其他饮 食添加物。任选地，宠物或动物食品组合物可以是干的组合物(例如粗粒)、 半湿组合物、湿的组合物、或其任意混合。在具体实施方案中，组合物是 为猫科动物消耗配制，包括(但不限于)家猫。在另 一优选实施方案中，本发明的組合物是为人消耗配制的食物产品。 这些有利地包括供应人必需饮食需要的食品和营养,和其他人饮食添加物。 在一个详细的实施方案中，为人消耗配制的食物产品是完全的和营养平衡 的。在另一优选实施方案中，组合物是饮食添加物，例如肉汁、饮用水、 饮料、浓缩液体、酸乳酪、粉末、颗粒、糊剂、悬浮液、咀嚼剂、小片食 物(morsel)、零食(treat)、点心、片剂、丸剂、胶嚢、药片、或其他形式。 饮食添加物可以是为特定动物消耗特异配制的，例如陪伴或非陪伴动物， 尤其是猫科动物或人。在一个详细的实施方案中，饮食添加物可以由高浓 度的益生生物组成，因而添加物可以小量向动物施用，或者任选地可以稀 释后向动物施用。在向动物施用前，饮食添加物需要与水混合。组合物可以是冷却的或冷冻的。益生生物可以预先与组合物的其他成分调和从而提供所需要的有益量，可以涂布到宠物食品组合物、饮食添加 物、或为人消耗制备的食物产品上，或可以在例如使用粉末或混合物添加 到组合物中之后提供给动物。有效量的益生生物。宠物食品和为人消耗配制的食物产品可以配制成每克组合物含有约102到约10"菌落形成单位(CFU)的益生生物。饮食添加物可 以配制成含有高几倍浓度的益生生物，从而可以以片剂、胶囊、浓缩液体 或其他类似剂型的形式施用于动物，或者在施用前稀释，例如用水稀释、喷雾或洒水到宠物食品上，或其他类似的施用类型。在一个实施方案中，组合物中益生生物的浓度是调控免疫功能所必需 的量的函数，包括动物血中CD4+淋巴细胞的比例和/或数目的增加。在另 一实施方案中，组合物中益生生物的浓度是增加在血清、粪便、分泌物(例 如乳、泪和唾液)中针对特异病原体抗原的免疫球蛋白浓度所必需的量的函 数。动物血清、粪便、分泌物(例如乳、泪和唾液)中CD4+淋巴细胞的水平 和免疫球蛋白浓度可以通过本领域内技术人员所公认和理解的方法测定。本发明的组合物任选地包含添加物质，例如矿物质、维生素、盐类、 香料、色素、和防腐剂。添加矿物质的非限制性实例包括钙、磷、钾、钠、 铁、氯化物、硼、铜、锌、镁、锰、碘、硒等等。添加维生素的非限制性 实例包括维生素A、多种维生素B、维生素C、维生素D、维生素E和维 生素K。也可以包括另外的饮食添加物，例如烟酸、泛酸、旋复花粉、叶 酸、维生素H、氨基酸等等。本发明的组合物任选包含一种或多种促进或维持健康免疫系统或进一 步调控免疫性的添加物质。此类物质包括(不限于)L-精氨酸、类固醇例如 7-氧代脱氢表雄酮(7-氧代DHEA)、类胡萝卜素例如a-和(3-胡萝卜素、抗氧 化剂、和草药或草药提取物例如黄芪和紫锥花(echinacea)。在多种实施方案中，本发明的动物食品或饮食添加物组合物的干物质 可以包含以组合物重量计从约15%到约50%的粗蛋白质。粗蛋白质物质包 含植物蛋白(例如大豆、棉籽和花生)或动物蛋白(例如酪蛋白、白蛋白和肉蛋白质)。此处所用肉蛋白质的非限制性实例包括猪肉、羊肉、马、家禽、 鱼和其混合物。组合物的干物质还可以包含以组合物重量计从约5%到约40%重量的脂肪。组合物还可以包含碳水化合物来源。组合物的干物质可以包含以组合物重量计从约15%到约60%重量的碳水化合物。此类碳水化合物的非限制性实例包括谷物或粮食，例如稻、玉米、高粱、苜蓿、大麦、大豆、油菜、燕麦、小麦和其混合物。组合物也可以任选的包含其他物质，例如干 乳清和其他牛奶副产品。组合物也包含至少 一种纤维来源。可以利用本领域内普通技术人员所 公知的多种可溶或不可溶的纤维。纤维来源可以是甜菜果肉(来源于甜菜)、 阿拉伯胶、塔尔哈胶(gumtalha)、蚤草、米糠、角豆胶、柑橘果肉、果胶、 短链寡聚果糖外附加的低聚果糖、甘露糖寡聚果糖、大豆纤维、羽扇豆纤 维、阿拉伯半乳聚糖、半乳寡聚糖、阿拉伯木聚糖、或其混合物。可选择 地，纤维来源可以是可发酵纤维。可发酵纤维如上所述有益于陪伴动物的 免疫系统。也可以在组合物中掺入本领域技术人员已知的提供促进肠益生 微生物生长的益生组合物的可发酵纤维或其他组合物，从而帮助增强本发 明对动物免疫系统的有益作用。在一个具体的实施方案中，组合物是完全的和营养平衡的宠物或动物 食品。在本说明书中，宠物食品可以是湿食品、干食品或含水量中等的食 品，正如本领域技术人员所公认的宠物食品配方和制造。"湿食品"描述通 常以罐或箔袋装售卖的宠物食品，其含水量通常在约70%到约90%范围 内。"干食品，，描述与湿食品组分相似的宠物食品，但是其含水量有限， 通常在约5%到约15%范围，并且因此例如以小的饼干状粗粒形式存在。 组合物和^E:食添加物可以为成年动物、或老年或年幼动物，例如"幼犬"、 "小猫，，或"老年"配方特异地配制。通常，特定的配方包含适合动物不 同发育或年龄阶段所需的能量和营养。本发明的某些方面优选用于与完全和平衡的食品(例如在国家研究委员会，2006,狗和猫的营养需求，国家学术出版社，华盛顿，或美国饲料 控制协会，官方出版物1996中所描述的)组合使用。即包含根据本发明某 方面的益生生物的组合物优选与高质量商品化食品使用。此处所用"高质 量商品化食品"指经加工产生的主要营养物的消化率达80%或更高的饮 食，例如上述国家研究委员会为狗和猫所推荐的，或美国饲料控制协会所 制定的。对于其他动物也使用类似的高营养标准。熟练的技术人员应该理解如何确定在给定组合物中加入合适量的益生 生物。应该考虑到的因素包括组合物的类型(例如宠物食品组合物、饮食添 加物或为人消耗所配制的食物产品)、不同动物对特定类型组合物的平均消 耗、和制备组合物的制造条件。可以基于动物的能量和营养需求来计算加 入组合物的益生生物浓度。根据本发明的某些方面，可以在制造和/或加工 组合物过程中的任意时间加入益生生物。这包括(不限于)作为宠物食品组 合物、饮食添加物或为人消耗所配制的食物产品的组成部分，或涂布于宠 物食品组合物、饮食添加物或为人消耗所配制的食物产品上的包被。可以根据本领域内任意合适方法制备组合物，例如在Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, ATB Edney编辑，Chapter by A. Rainbird,标题 为"均衡饮食"在57到74页，Pergamon Press Oxford中所描述。方法本发明的另一方面为调控动物免疫性的方法，包含向动物施用由以调 控动物免疫性的有效量的一种或多种益生生物组成的组合物。而本发明的 另一方面为增强动物中疫苗效能的方法，包含向动物施用由以增强动物中 疫苗效能的有效量的一种或多种益生生物组成的组合物。在某些实施方案 中，疫苗是猫瘟病毒、猫鼻气管炎病毒或猫杯状病毒的疫苗。在本发明上述两方面的任一的详细实施方案中，组合物是此处举例的 宠物或动物食品组合物、饮食添加物或为人消耗配制的食物产品。在更详 细的实施方案中，益生生物包括单独的至少一种肠道球菌，优选粪肠球菌， 最优选菌林SF68，或与其他益生生物组合，所述其他益生生物包括如上所述的一种或多种链球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌 属或酵母菌属。动物可以包括任意上述家养的或陪伴动物，或可以包括人。 在某些实施方案中，该动物是陪伴动物，例如猫。在另一实施方案中，该 动物是人。可以以多种可选择的施用途径的任一种向动物施用组合物。此类途径 包括(不限于)口腔、鼻内、静脉内、肌肉内、胃内、经幽门、皮下、直肠 等等。优选地，通过口腔施用组合物。此处所用术语"口腔施用"或"口 腔给药"指动物:摄入或人被指导喂给动物以一种或多种此处所述本发明的 组合物。其中人被指导喂组合物，此类指导可能是指示和/或告知人使用组合物 可以和/或将会有参考的益处，例如调控免疫性或增加动物中疫苗效能。此 类指导可以是口头指导(例如通过医师、兽医或其他健康专家的口头指导、 或广播或电视媒体(即广告)、或书面指导(例如通过医师、兽医或其他健康 专家的文字指导(例如处方))、销售专业人士或组织(例如通过销售宣传册、 小册或其他教育性资料)、书面媒体(例如互联网、电子邮件或其他计算机 相关媒体)、和/或组合物的包装(例如储存组合物的容器上的标签))。可以以基于需要或期望的基础施用，例如一月一次、 一周一次、每天 一次或每天多次。同样，可以隔天、隔周、隔月、每三天、每三周或每三 月、每四天、每四周或每四月等等施用。可以每天多次施用。当作为通常 饮食需求的添加物使用时，组合物可以直接施用于动物或者另外与每日的 饲料或食品接触或混合。当作为每日饲料或食品使用时，此种施用是普通 技术人员所熟知的。也可以基于常规基础施用，例如作为动物饮食的一部分。饮食可以包含动物有MJ'J地4聂入由以在动物中调控免疫性或增强疫苗效能的有效量的 一种或多种益生生物组成的组合物。有规则摄入基于每日或每周可以是每 天一次、或两次、三次、四次、或更多次。同样，有规则施用可以是每两 天或周、每三天或周、每四天或周、每五天或周、或每六天或周，并且此 类饮食可以每天多次施用。有规则施用的目的是向动物提供如此处举例的优选每日剂量的益生生物。可以以每个动物每天所施用的菌落形成单位(CFU)的方式来测量益生 生物的每日剂量。益生生物的每日剂量可以在约105到约1(^CFU/天的范 围。更优选地，益生生物的每日剂量为约107到约1(^CFU/天。更优选地， 益生生物的每日剂量为约108到约1(fCFU/天。最优选地，益生生物的每 日剂量为约108 CFU/天。根据本发明的方法，由一种或多种益生生物组成的组合物的施用，包 括作为々欠食部分的施用，可以跨越动物从妊娠期到整个生命期的范围。通过以下实施例更详细地描述本发明。他们意在说明而不是限制本发明。实施例实施例1 动物和实验参数猫研究群体。20只6周大的SPF小猫购自Liberty实验室(Liberty， NY)。经ELISA鉴定，小猫为猫白血病病毒抗原和猫免疫缺陷病病毒抗体 血清阴性。(SnapCombo，IDEXX实验室，波特兰，ME)。实验，没计。IO天平衡期之后，将小猫随机分为两组，每组10只，从7 周龄开始治疗研究。将0.25-0.28 g ( 5 x 109 CFU，基于稀释液的计数测定) 的LBC ME5 PET粪肠球菌SF68 (NCMB 10415) (Cerbios-Pharma SA，瑞 士)加入到50mL圆锥底聚丙烯离心管中，盖紧，并储存于4。C直到开始研 究。也同样制备等分试样的增味剂(通常使用的宠物食品包被包含肝消化物 作为主要成分)，每管150 mg。使用等分试样进行吸水率的测定，如果益 生菌或增，朱剂出现凝集则丟弃。在施用之前，将等分试样的增味剂转移到 一个储存粪肠球菌SF68的管中(治疗组)或空管中(安慰剂组)，并用室温的 7jC稀释至总体积为10 mL。将内容物涡旋至少3分钟，吸入12 cc注射器。 悬浮液涡旋后，立即向小猫口腔施用lml粪肠球菌SF68(日总剂量每天 5xl08 CFU)或只有增味剂(对照小猫)， 一直到27周龄。两组均随意喂养干的猫食(符合所有AAFCO需求的常用猫生长配方，使用鸡肉和稻作为主 要成分)，并分置于两个分离的房间从而避免益生菌的交互污染。在9-12 周龄，所有的小猫皮下接种由美国猫医生协会推荐的用于猫疱渗病毒-1、 杯状病毒和猫瘟病毒的减毒活组合疫苗(辉瑞动物健康，Exton， PA)。 (Richards J等人(2001))。统计评估。在每个样本日，测定所有测量参数的组平均值。用适合重 复测量实验的混合ANOVA模型分析益生菌治疗组和安慰剂组之间的差 异。模型中包括的时间为连续变量。计算各组猫在研究期间的产气荚膜杆 菌(C. perfringens)肠毒素或难辨梭菌(C. difficile)毒素A或B的阳性猫样本 的百分比和细胞表面标记阳性的门控细胞的百分比，并以双尾t检验来比 较。(GRAPHPAD Prism, GRAPHPAD软件公司，San Diego， CA)。认为 p<0.05具有统计学显著性。实施例2样品收集和临床监测研究过程中每天监测小猫的态度和行为。每周测量体重。在第7周龄 和第9、 15、 21和27周龄，开始补充益生菌或增味剂之前，收集所有小猫 的血、唾液和粪便。另外，收集28周龄的治疗组小猫的粪便。对于各组小 猫，每天随机从公用垃圾中选出5个粪便样品，用标准图表评分卡进行评 分，并测定每日组平均值。根据Benyacoub J等人(2003)描述的方法测量 粪便提取物中的总IgA和IgG。所有样品储存于-80。C直到成批测定。在补充的早期阶段(7周龄)，所有小猫的粪便都是正常的。由于与研究 不相关的原因从各组移除一只小猫，因此也从最终数据分析中移除。在整 体时间或在任意个别时间点，两组的体重和粪便评分没有统计学差异(
图1)。在研究过程中，两组猫之间的全血细胞计数、生化参数和体重相似。 两组之间粪便评分也相似，说明使用此处所述剂量的SF68并不能显著诱 导临床差异。实施例3 粪便测定在每个样品日，以8个系列的10倍稀释将来自各小猫的粪便涂布于 KF链球菌琼脂平板上，在37。C需氧培养48小时。用无菌环挑取每个形态 学类型的10个菌落，置于1.2 mL脑心浸液培养基(BHI) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)中，在测定期间储存于-80。C。对于从各样品分离的细 菌菌林进行RAPD-PCR，来确定治疗组小猫的粪便中是否存在有活力的粪 肠球菌SF68，并评估益生菌是否意外地从治疗组小猫传递给安慰剂组小 猫。热循环参数如下95。C变性l分钟、40。C退火l分钟、72。C延伸4分 钟，30个循环。25.5 nL反应混合物包括2.45 jiL 10 x无镁緩冲液(100mM Tris-HCl， pH 8.3， 500 mM KC1、 3.22 mM MgCl2、 0.4 fiL (1个单位)起动 DNA聚合酶(希格玛D-4184,希格玛-奥尔德里奇公司，圣路易斯，MO)、 1.9 nL dNTP混合物(2.5 mM)、 1 |iL引物(IOO nM)、 15.47 pL PCR水和1 细菌培养物。所用引物的序列为5，- GGTTGGGTGAGAATTGCACG-3'。 5-10 nL的PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，将条带模式与阳性SF68 对照相比较。使用商业上可获得的ELISA测定在所有小猫的粪便中是否存 在产气荚膜杆菌肠毒素或难辨梭菌毒素A/B (产气荚膜杆菌(ELISA，试剂 盒号92-000-22)和难辨梭菌(ELISA，试剂盒号94-0150-KT), Techlabs， Blacksburg， VA.)。 粪便的沙门氏菌0S"/附o"e"" s/，p.)和弯曲杆菌 (Oww/y;/o6fl"c ^/7.)常规需氧培养由美国科罗拉多州大学诊断实验室进 行。9个治疗组猫中有7个的粪便在研究过程中的至少一个时间点呈现 SF68阳性。然而，在停止补充之后一周(28周)，从任何治疗的猫的粪便中 都不能扩增出SF68 DNA。从粪便中也不能生长出沙门氏菌或弯曲杆菌。 来自安慰剂组猫的所有样品经RAPDPCR都呈现SF68阴性。在研究期间 两组之间的难辨梭菌毒素A/B或产气荚膜杆菌肠毒素的阳性样品数(表1) 没有不同。补充SF68并不能诱导沙门氏菌和弯曲杆菌的释放。在两组小猫中的几个粪便样品为难辨梭菌或产气荚膜杆菌肠毒素阳性；然而，组间的阳性样本数没有显著差异，并且阳性结果与腹泻不相关。在补充期间多数治疗组小猫的粪便中可检测到SF68，但是在停止补充之后的一周不再能检测 到，这表明生物在猫中仅为短暂持续。因此，施用此处所述剂量的SF68 没有有害作用，并且研究期间的施用是安全的。实施例4免疫测定在科罗拉多州大学的临床病理学实验室进行全血细胞计数、血清生化 检测和尿检验。通过使用适当的先前公开的ELISA测定来测量血清FHV-1 -特异性IgG、 FHV-l-特异性IgA、 FCV-特异性IgG和血清中猫瘟-特异性 IgGlO、以及唾液中FHV-1特异性IgG和IgA水平，来评估抗原特异性体 液免疫应答。(Lappin MR等人(2002);和Ditmer DA等人(1998))。对于 FHV-1特异性IgG和IgA，通过每个样品的三个测试孔的平均吸光率和通 过计算ELISA单位百分数(测试样品的平均吸光率减去阴性对照样品平均 吸光率/阳性对照样品平均吸光率减去阴性对照样品平均吸光率，再除以 IOO来计算结果)。对于FCV和FPV,使用平均吸光率。通过使用商业上 可获得的ELISA测定或放射免疫扩散测定(贝氏实验公司(Bethyl Laboaratories， Inc.), Montgomery, TX)来评估血清、粪便提取物和唾液中 总 IgG和IgA的浓度。通过流式细胞计数和全血细胞增殖测定来评估细胞免疫应答。在收集 血液后的12小时之内，用500 jiL抗凝血剂(EDTA)在红细胞裂解緩冲液 (0.155 M NH4C1/0,010 M KHC03/5 x l(T4 %酚红(0.5%))中室温培育，进行 流式细胞计数。细胞用PBS洗两次，获得的细胞沉淀在含PBS、 0.1%叠 氮钠和2%胎牛血清的FACS緩沖液中重悬，可能得到浓度为1 x 106细胞 /100 nL的溶液。对于细胞不足的样品至少要用500 nL的上述悬浮液来计 数，并记录细胞浓度。将100fiL各细胞悬浮液加入到圆底96孔板的各孔中，用于免疫染色。添加10%正常猫血清以阻断非特异性结合。(杰克逊 免疫研究实验公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), West Grove, PA)。免疫染色在4。C FACS緩沖液中于黑暗条件进行。染色淋巴 细胞以观察CD4和CD8的表达(vpg34;抗-CD4-fitc， vpg9;抗-CD8-rpe抗 体；Serotec， Raleigh, NC (Oxford, UK))和CD44的表达(IM17;抗 画CD44画pe/cy5抗体；Pharmingen， Franklin Lakes, NJ)。对于B细月包的分冲斤， 裂解的全血细月包用B220 (ra3-b62;抗腦B220-生物素化抗体；eBioscience， 圣地亚哥,CA)、CD21 (b-ly4;抗-CD21-apc抗体；BD画Biosciences， Franklin Lakes, NJ)、和II类MHC (抗-II类MHC -fitc抗体；克隆CAG5-3D1， Serotec， Raleigh, NC (Oxford, UK))交叉反应抗体进行免疫染色。对细胞基 于向前和侧向散射的特性来门控活的淋巴细胞群用于分析。用CyanMLE cytometerp收集数据，并用Summit软件进行分析。(Dako画Cytomation，柯 林斯堡，CO)。进行三次增殖测定，在加入促细胞分裂剂或抗原之前，使用lOpL预 先准备的全肝素化血液在100 jiL完全肿瘤培养基中于37。C、 5% C02培 育30分钟。(完全肿瘤培养基补充必需和非必需氨基酸的改良Eagle's培 养基+ 10%FBS)。细胞只在培养基中(非刺激)、或用刀豆球蛋白A (10 fig/mL: Con ASigma画Aldrich，圣路易斯，MO)、或FHV-1抗原制品(l ^L/ 孑L，在研究开始前制备并分装保存于-8(TC)在37°C、 5% C02条件下刺激 96小时。(VeirJK等人(2005))。用每孔1 pCi氚化胸腺嘧啶脉沖细胞，并 于18小时后收集到纤维玻璃滤器上。(Wallac-Microbeta Perkin -Elmer,波 士顿，MA)。用MicroBetas液体闪烁计数器读数。计算所有样品的平均刺 激指数(每个刺激样品的平均最大计数除以每个非刺激样品的平均最大计 数)。全血细胞计数和生化i普是在正常范围内所有猫年龄组的所有时间点进 行。在分析的所有时间和任何个体时间点，组间没有统计学差异。在21 和27周龄，治疗组的血清中FHV-l-特异性IgA的平均水平比安慰剂组中 的大，但是差异不是统计学上的差异(图2)。在15、 21和27周龄，使用两种测定方法，治疗组的FHV-l-特异性血清IgG平均水平比安慰剂组中的 大，但是差异不具有统计学上的差异显著性(图3)。在唾液中没有检测到 FHV-1特异性IgG。两组血清中FCV-特异性-IgG水平相似(图4)。在第15 周龄，治疗组血清平均FPV-特异性IgG水平比安慰剂组的大，但是差异 不是统计学上显著的差异(图5)。两组间血清中总IgG和IgA浓度相似(数据未显示)。在唾液中没有检 测到总IgG，两组间唾液中总IgA浓度相似(数据未显示)。在27周龄，治 疗组粪便提取物中总IgG平均浓度比安慰剂组的大，但是差异不是统计学 上的差异(图6)。两组间粪便提取物中的总IgA浓度相似(图6)。使用10 ng/mL刀豆球蛋白A或1 nLFHV-1抗原制品作为刺激物的增 殖测定中，在任一时间点均不产生组间平均最大计数的显著性差异。在前 4个时间点，组间的任意细胞表面标记没有统计学上的差异(图7)。在27 周龄，治疗组(平均值13.87%)的CD4门控淋巴细胞阳性的百分数显著高 于安慰剂组(平均值10.61%, p=0.0220)。其他的比较没有显著性差异。在27周龄，治疗组中的CD4+计数与安慰剂组相比有所增加，而CD8+ 计数没有同时增加，证明益生菌对系统的免疫调控作用。在某些采集时间 点监测到的体液免疫应答参数增大表明出现了 Thl应答的刺激。在小狗中 补充SF68的研究发现可以支持此假设(Benyacoub J等人(2003))。接种以后，各小猫发展了 FHV-1、 FCV和FPV-特异性的血清抗体应 答，这与其他研究相似，表明它们具有免疫能力，并且使用的减毒活疫苗 是有活力的(Lappin MR等人(2002))。几个结果也表明喂以益生菌会影响 这些小猫的体液和细胞介导的免疫应答。这些包括在27周龄检测到的统计 学上显著增大的CD4+淋巴细胞计数，和与安慰剂组相比较，在21和27周 龄血清和唾液中FHV-1特异性IgA、在15、 21和27周龄血清中FHV-1-特异性IgG水平、在15周龄血清中FPV-特异性IgG水平和在27周龄粪 便提取物中的总IgG浓度的平均值均增大。参考文献Benyacoub J， Czarnecki-Maulden GL， Cavadini C， Sauthier T， Anderson RE， Schiff7rn EJ, von der WT (2003)， Supplementation of food with Enterococcus faedum (SF68) stimulates immune functions in young dogs. J. Nutr.\2>2>: 1158-1162Ditmer DA， Lappin MR, Carman J, Collins JK (1998)， Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of feline herpesvirus 1 IgG in the serum, aqueous humor, and cerebrospinal fluid. J. Vet. Diagn. Invest 10: 315-319Drisko JA， Giles CK， Bischoff BJ (2003)， Probiotics in health maintenance and disease prevention. Altern. Med. Rev. 8:143-155Isolauri E， Sutas Y， Kankaanpaa P, Arvilommi H, Salminen S (2001a)， Probiotics: effects on immunity. Am. J. CHn. Nutr. 73: 444SIsolauri E (2001b), Probiotics in human disease. Am. J. CHn. Nutr. 73: 1142S-1146SKim LM， Morley PS， Traub國Dargatz JL， Salman MD, Gentry- Weeks C (2001)， Factors associated with Salmonella shedding among equine colic patients at a veterinary teaching hospital. J. Am. Vet. Med. Assoc. 218: 740-748Lappin MR, Andrews J， Simpson D (2002), Use of serologic tests to predict resistance to feline herpesvirus 1， feline calicivirus, and feline parvovirus infection in cats. J. Am. Vet. Med. 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权利要求
1.组合物，其包含在猫科动物中调控免疫性或增强疫苗效能的有效量的一种或多种益生肠道球菌。
2. 权利要求l的组合物，其中该组合物是食品组合物或饮食添加物。
3. 权利要求1或2的组合物，其中益生肠道球菌是粪肠球菌菌株 SF68。
4. 任意前述权利要求的组合物，其中每克制剂中含有益生肠道球菌的 存在量至少为约102到约10"菌落形成单位(CFU)。
5. 任意前述权利要求的组合物，还包含7-氧代-DHEA。
6. 任意前述权利要求的组合物，还包含至少一种其他类型的益生生 物。
7. 任意前述权利要求的组合物，其中猫科动物是家猫。
8. 任意前述权利要求的组合物，其中疫苗是FVH-1疫苗、FCV疫苗 或FPV疫苗。
9. 任意前述权利要求的组合物，其中改良的免疫性包含抗FVH、 FCV 或FPV的免疫性。
10. 在猫科动物中调控免疫性的方法，包括基于常规基础向动物施用组 合物，该组合物包含调控动物免疫性的有效量的一种或多种益生肠 道球菌。
11. 权利要求10的方法，其中该组合物是动物食品组合物或饮食添加 物。
12. 权利要求10或11的方法，其中益生肠道球菌是粪肠球菌菌林 SF68。
13. 权利要求10到12的任一项的方法，其中每克制剂中存在的益生肠 道球菌的量为至少约102到约10" CFU。
14. 权利要求10到13的任一项的方法，其中猫科动物是家猫。
15. 权利要求10到14的任一项的方法，其中改良的免疫性包括抗FVH 、FCV或FPV的免疫性。
16. 在动物中增强疫苗效能的方法，包括基于常规基础向动物施用组合 物，该组合物包含增强动物中疫苗效能的有效量的一种或多种益生 肠道球菌。
17. 权利要求16的方法，其中该组合物是动物食品组合物或饮食添加 物。
18. 权利要求16或17的方法，其中该益生肠道球菌是粪肠球菌菌林 SF68。
19. 权利要求16到18的任一项的方法，其中每克制剂中存在的益生肠 道球菌的量为至少约102到约10" CFU。
20. 权利要求16到19的任一项的方法，其中该猫科动物是家猫。
21. 权利要求16到20的任一项的方法，其中该疫苗是FVH-1疫苗、 FCV疫苗或FPV疫苗。
22. 权利要求16到21的任一项的方法，其中在动物中增强的疫苗效能 导致动物中CD4+淋巴细胞的产生增加。
23. 权利要求16到22的任一项的方法，其中在动物中增强的疫苗效能 导致动物的血清、粪便、乳、泪、唾液、呼吸上皮、或胃肠上皮中针对特异性病原的抗原反应的免疫球蛋白浓度增加。
24. —种或多种益生肠道球菌在制备调控动物的免疫性的药物或组合 物中的用途。
25. 权利要求24的用途，其中该动物是猫科动物。
26. 权利要求24或25的用途，其中该组合物是动物食品组合物或饮食添力口物o
27. 权利要求24到26的任一项的用途，其中该益生肠道球菌是粪肠球 菌菌抹SF68。
28. 权利要求24到27的任一项的用途，其中每克制剂中存在的益生肠 道球菌的量为至少约102到约10" CFU。
29. 权利要求24到28的任一项的用途，其中该动物是家猫。
30. 权利要求24到29的任一项的用途，其中抗FVH、 FCV或FPV的 免疫性是改良的。
31. —种或多种益生肠道球菌在制备增强动物中疫苗效能的药物或组 合物中的用途。
32. 权利要求31的用途，其中该组合物是动物食品组合物或饮食添加 物。
33. 权利要求31或32的用途，其中该益生肠道球菌是粪肠球菌菌株 SF68。
34. 权利要求31到33的任一项的用途，其中每克制剂中存在的益生肠 道球菌的量为至少约102到约1011 CFU。
35. 权利要求31到34的任一项的用途，其中该动物是猫科动物。
36. 权利要求31到35的任一项的用途，其中该动物是家猫。
37. 权利要求31到36的任一项的用途，其中该疫苗是FVH-1疫苗、 FCV疫苗或FPV疫苗。
38. 权利要求31到37的任一项的用途，其中增强动物中的疫苗效能导 致动物中CD4+淋巴细胞的产量增加。
39. 权利要求31到38的任一项的用途，其中增强动物中的疫苗效能导 致动物的血清、粪便、乳、泪、唾液、呼吸上皮、或胃肠上皮中针 对特异性病原的抗原反应的免疫球蛋白浓度增加。
全文摘要
本发明公开了用于调控动物中的免疫性和疫苗效能的组合物和方法。该组合物和方法使用益生生物，特别是益生肠球菌(Enterococcus)菌株，并且特别适用于猫科。
文档编号A23K1/00GK101277708SQ200680036778
公开日2008年10月1日 申请日期2006年10月6日 优先权日2005年10月6日
发明者C·卡瓦迪尼, E·萨蒂亚拉, J·本雅各布, R·诺尔 申请人:雀巢技术公司