专利名称：去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗种苗的方法
技术领域：
本发明涉及甘蔗种苗的繁殖生产，尤其是关于去除甘蔗宿根矮化病菌的技术
背景技术：
甘蔗(&"h/7/瓜是我国主要的糖料作物及具有良好发展前景的生物质
能作物。甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,简称RSD )是一种世界性的 重要甘蔗病害，也是我国蔗区的一种主要甘蔗病害，对甘蔗产量影响较大， 一般新 植蔗产量损失10%-15%,宿根蔗产量损失20%-25%,且影响宿根蔗年限，是甘蔗 品种退化的重要原因之一。甘蔗RSD病原细菌寄居于蔗茎维管東中，尚无有效的化 学防治方法；同时由于缺乏抗源材料，甘蔗RSD抗病育种成效不大，至今未育成抗 性较好的生产品种，其较有效的控制措施是种植健康种苗。 . 培育甘蔗健康种苗的主要目的是去除以甘蔗RSD为主的种苗传播病害。早期比较 传统的去除甘蔗RSD病菌的方法是5(TC热水浸种2-3h或.54-58'C热空气处理蔗种 8h,可在一定程度上杀死感病蔗茎中的RSD病原菌，大大减轻RSD的发生程度，但 上述热处理方法具有不能彻底去除RSD病菌、易伤害蔗芽、水温难控制、去菌效果 不稳定及种苗繁殖系数低等不足之处，不适合我国蔗区生产实际，难以在生产上大 面积推广应用。近年也有利用热处理结合茎尖分生组织(lmm以下)培养去除甘蔗 RSD病菌的报道，但该种方法切取的外植体特别细小，需要在解剖镜下切取，操作 难度较大，且由于外植体特别细小，导致培养过程中酴污染率极高，诱导成苗率极 低，生产成本较高，难以在生产上推广应用。因此，生产上迫切需要一种能高效去 除RSD病菌、繁种速度快，同时生产成本低、搡作容易的甘蔗健康种苗生产方法， 来满足我国甘蔗健康种苗生产的实际需要。
发明内容
本发明的目的是提出一种去除甘蔗宿根矮化病菌和快速繁殖甘蔗健康种苗的 方法，其具有去菌彻底、能规模化、快速、经济的地繁殖甘蔗健康种苗的效果。 本发明的技术方案如下
一种去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗种苗的方法，包括如下步骤
1. 原种处理和生产采集甘蔗品种主茎，砍成双芽段，选取若干有效芽段，经
49. 5 — 50. 5'C水浴处理2 ~ 3h,放在35°C ~ 38。C光照培养箱中催芽3d ~ 5d， 催芽后育苗于35'C以下温室中，待蔗苗长成2~4片叶时，定植于网室苗圃 中，待甘蔗生长至10个芽左右，用经75%酒清浸泡消毒的蔗刀砍取整条蔗茎， 并取汁采用斑点酶标免疫试验法(Dot blot enzyme immunoassays,简称 DB-EIA)检测RSD病菌；
2. 外植体选取与灭菌取步骤1)中经DB-EIA检测结果呈阴性且生长健壮的 蔗茎的顶芽，经灭菌处理，作组织培养外植体；
3. 外植体诱导培养将步骤2)灭菌处理后的顶芽在无菌条件下，切取其3~ 5mm的茎尖组织接种于诱导培养基上，诱导产生丛芽；
4. 继代增殖培养将步骤3)诱导分化的丛芽切成单株接种于增殖培养其上， 进行继代增殖培养，在27 - 28。C散射光下培养，15 20d继代一次，继代数 以不超过10代为宜；
5. 促根培养将步骤4 )长至5 ~ 6cm高的小苗转接于生根培养基上，进行生根 培养；
6. 假植当步骤5)生根小苗生长至6~8cm高，根系发育健壮后，将生根瓶 苗移到自然光下炼苗2~3d,取出洗去苗上的培养基，种植于苗圃(塘泥、 泥碳土和河沙混合的基质)上，按常规管理，苗高35 45cm且生长健壮的假 植苗可移栽于大田进行扩繁；
7. 苗圃扩繁将步骤6)假植苗定植于大田建立一级健康种苗圃，再通过二级 或三级苗圃扩繁，在从上级苗圃采苗进入下级苗圃扩繁时，采苗工具需用75% 的酒精浸泡消毒5min以上，方可用于采苗，以防交叉感染；
8. 种苗RSD检测将步骤7)扩繁的种苗，在种苗出圃用于大田生产用种前， 抽样取蔗茎汁用DB-EIA检测RSD病菌，当蔗茎感染率为0时，种苗合格，可 供大田生产种植。
与现有技术对比，本发明有如下突出特点和显著进步 一、以高效彻底去除甘蔗种苗RSD病菌，确保种苗质量
本发明采用两次去除RSD病菌的方法(热水处理及茎尖培养)，确保种苗RSD
病菌去除率100%。
二、 以快速大量繁殖甘蔗健康种苗，其种苗无变异
本发明采用组织培养微体快繁及田间多级苗圃扩繁技术，种苗年繁殖系数在 l万倍以上，本发明釆用茎尖培养，未诱导产生愈伤组织，不存在变异问题。
而现有技术中热水处理种苗年繁殖系数约IOO倍；心叶愈伤组织培养虽然 也能高效去除RSD病菌且繁殖系较高，但愈伤组织培养易产生变异，种苗遗传稳 定性差。
三、 本发明培植的甘蔗健康种苗，具有明显的增产、增糖、提高抗單性能效果 由于本发明生产的健康种苗，能彻底去除RSD病菌，保持蔗茎维管束畅通，
有利于水份和营养物质的运输，从而具有显著的增产、增糖效果。
具体实施例方式
下面用二个具体实施例来对本发明作进一步的说明 实施例一
一种高效去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗种苗的方法，包括如下步
骤
1. 原种处理和生产于8月中甸采取甘蔗品种粵糖00-236主茎10条(株龄8个 月)，砍成双芽段，选取蔗芽质量较好的有效芽段40段，经50±0. 3'C水洛处理 2h，放在35。C光照培养箱中催芽3d,蔗芽萌动后在玻璃温室(28~30°C)中， 用细沙育苗，待蔗苗长成3-4片叶、假茎高25cm时，移栽于试验基地网室中， 待甘蔗生长至12~13个芽，用经75%酒清浸泡5min以上的蔗刀砍取20条生长 正常的蔑茎(保留蔗梢)，并给每条蔗茎编号，砍每条蔗茎基部1~4节中的1 个节，用气泵取汁200 ~ 300 mL,保存于-2(TC。C冰箱中，3d内用DB—EIA方法 检测RSD病菌。
2. 外植体选取与灭菌取检测结果为阴性的蔗茎的蔗梢，剥去外叶，切取茎尖1~ 2cm,在超净工作台上，用75% (V/V)的酒精擦拭，然后用0.1%的升汞溶液浸泡 消毒12 15min,再用无菌水冲洗4遍，将茎尖组织浸泡在500mg/L PVP溶液中， 切取3 ~ 5mm的茎尖组织作外植体。
3. 外植体诱导培养将步骤2 )的外植体在无菌条件下接种于液体茎尖诱导培养基
(1/2MS + 0. 2mg/L 6-BA + 30§/1^蔗糖+ lg/L活性炭(AC )， PH=6. 2 ),在27 ~ 28'C光照静置培养7 ~ 15d诱导出丛芽。
4. 继代增殖培养:将步骤3)诱导出的丛芽切成单株转接于继代增殖培养基(MS + 0. 5mg/L 6-BA + NAAO. 2mg/L +蔗糖30g/L,pH=6. 2)中，在28。C散射光下培养， 15 20d继代一次，总继代次数8次。
5. 促根培养将步骤4)长至5~6cm高的继代小苗转接于生根培养基(MS+IBA2 mg/L+蔗糖50g/L)上进行生根培养，经充分光照培养30d左右。
6. 假植当生根小苗长至6 8cm高，根系发育健壮后，将生根瓶苗移到自然光下 炼苗2 3d，取出洗去苗上的培养基，种植于由塘泥、泥碳土和河沙混合的基质 苗圃上，种植后7d内每天淋水1~2次，约7d小苗返青后薄施水肥，45d后苗 高35 45cm，生长健壮，即可移栽于大田进行扩繁。
7. 苗圃扩繁将步骤6)假植苗定植于一级苗圃中，定植规格为行距1.0m,株距 25~30cm, 2200 ~ 2500株/亩，定植前种植沟施呋呷3 ~ 5kg/亩，并用小锄使药 与土混合，定植时用手压实，边植边淋足定根水，定植时间以下午3点钟后为宜， 植后5 ~ 7d每天淋水至少1次，7d左右蔗苗返青，成活率95%,定植后15 ~ 20d 薄施水肥，以5-8Kg尿素/亩为宜，并及时除草，定植后约30d,蔗苗生长健壮， 其后田间管理按常规。当蔗株长至20个芽左右时，即可釆苗进入二级苗圃扩繁， 采苗前蔗刀需用75%酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染。当二级苗圃的蔗 株长至20个芽左右时，即可采苗进入三级苗圃扩繁，同样釆苗前蔗刀需用75% 酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染，当三级苗圃的蔗株长至20个芽左右时， 即釆苗用作生产用种，采苗前蔗刀也需用75。/。酒精浸泡消毒5min以上，以防交 叉感染。
8. 种苗RSD检测将步骤7)扩繁的种苗，在种苗出圃用于大田生产用种前，随机 采取20条蔗茎取汁检测RSD病菌(DB-EIA检测方法)，蔗茎感染率为0，种苗合 格。
至此，可将合格种苗用经酒精浸泡消毒的砍刀砍收，贴上合格标签供大田 生产种植。 实施例二
一种高效去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗种苗的方法，包括如下步
骤
1. 原种处理和生产于8月~9月釆取甘蔗品种新台糖22号主茎10条(株龄8 个月)，砍成双芽段，选取蔗芽质量较好的有效芽32个双芽段，经50±0. 3'C水 浴处理2. 5h,放在37。C光照培养箱中催芽4d,蔗芽萌动后在玻璃温室(28~30 。C)中，用细沙育苗，待蔗苗长成3-4片叶、假茎高26cm时，移栽于网室苗圃 中，待甘蔗生长10个芽左右，用经75%酒清浸泡5min以上的蔗刀砍取20条生 长正常的蔗茎(保留蔗梢)，并给每条蔗茎编号，砍每条蔗茎基部1~4节中的1 个节，用气泵取汁200 300)iL，保存于-2(TCTC冰箱中，3d内用DB—EIA方法 检测RSD病菌。
2. 外植体选取与灭菌取步骤l)中检测结果为阴性的蔗茎的蔗梢，剥去外叶，切 取茎尖l-2cm，在超净工作台上，用75% (V/V)的酒精擦拭，然后用0. 1%的升 汞溶液浸泡消毒12 15min,再用无菌水冲洗4遍，将茎尖组织浸泡在500mg/L PVP溶液中，切取3 ~ 5mm的茎尖组织作外植体。
3. 外植体诱导培养将步骤2)的外植体在无菌条件下接种于液体茎尖诱导培养基 (MS + 1. Omg/L 6-BA +0. lmg/LNAA +30g/L蔗糖+ 0, 5g/L活性炭(AC ) PH = 5. 8 )
上，以滤纸为支持物，在27土rC的摇床中黑暗条件下振荡培养5d，转速为40 ±lr/min,第6d转入光照培养，15d ~ 20d诱导出丛芽。
4. 继代增殖培养将步骤3)诱导出的丛芽切成单株转接于继代增殖培养基 (MS+6BAL Omg/L+KT0. 5mg/L+蔗糖30g/L)上培养，15-20d继代一次,增殖系
数3 5倍，总继代次数9代。
5. 促根培养将步骤4 )长至5 ~ 6cm高的继代小苗转接于生根培养基 (1/2MS+NAAlmg/L+蔗糖20g/L)上，经充分光照培养25d。
6. 假植当将步骤4)的生根小苗长至6-8cra高，根系发育健壮后，将生根瓶苗 移到自然光下炼苗2-3d,取出洗去苗上的培养基，种植于由塘泥、泥碳土和河 沙混合的基质苗圃上，种植后7d内每天淋水1 2次，约7d小苗返青后薄施水 月巴，45d后苗高35 — 45cm,生长健壮，即可移栽于大田。
7. 苗圃扩繁将步骤6)假植苗定植于一级苗圃中，定植规格为行距l.Om,株距
25~30cm, 2200 ~ 2500株/亩，定植前种植沟施呋呷3 ~ 5Kg/亩，并用小锄使药 与土混合，定植时用手压实，边植边淋足定根水，定植时间以下午3点钟后为宜， 植后5 7d每天淋水至少1次，7d左右蔗苗返青，成活率91°/。，定植后15~20d 薄施水肥，以5-8Kg尿素/亩为宜，并及时除草，定植后约30d,蔗苗生长健壮, 其后田间管理按常规。当蔗株长到至20个芽左右时，即可采苗进入二级苗圃扩 繁，采苗前蔗刀需用75%酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染。当二级苗圃 的蔗株长至20个芽左右时，即可采苗进入三级苗圃扩繁，同样釆苗前蔗刀需用 75%酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染，当三级苗圃的蔗株长至20个芽左 右时，即釆苗用作生产用种，釆苗前蔗刀也需用75%酒精浸泡消毒5min以上， 以防交叉感染。
8.种苗RSD检测将步骤7)扩繁的种苗，在种苗出圃用于大田生产用种前，随机 采取20条蔗茎取汁检测RSD病菌(DB-EIA检测方法)，蔗茎感染率为0,种苗合 格。
至此，可将合格种苗用经酒精浸泡消毒的砍刀砍收，贴上合格标签供大田生产 种植。
经田间评价试验表明，本发明生产的健康种苗，具有明显的增产效果， 一般新 植蔗增产10%~15%,宿根蔗增产20~30%，蔗糖份提高O. 5个百分点左右，延长宿 根年限1 2年。
附录
DB-EIA检测程序
压板取10 15张吸水纸，剪成与硝化纤维膜一样大小(硝化纤维膜的长度与 宽度略小于压板的长宽度)，硝化纤维膜用蒸镏水浸泡2-3min，将硝化纤维膜附到 一块带孔的压板上(注意膜与板上的孔对齐)，然后与吸水纸一起用压板压好,上紧 螺丝。
上样用微量移液器吸取100 - 130 nL蔗汁样品点于板孔中，每孔点一个样。 晾干将点好样的板，置于室温、通风的地方，待孔中的样液全部被硝化纤维 膜和吸水纸吸干(l 2h),用螺丝刀解开压板，取出硝化纤维膜。
干燥将晾千后的硝化纤维膜，置于8(TC的恒温鼓风干燥箱中lh。 封闭将硝化纤维膜置于3%的脱脂奶粉水溶液中，在摇床上摇动30rain。 洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。
加入RSD兔抗体(一抗)将RSD兔抗体溶于PBST中，将冲洗干净的硝化纤维 膜置于加入RSD兔抗体的PBST溶液中，并在摇床上温育1 ~ 2h。 洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。
加入羊抗兔碱性磷酸酶标记抗体(二抗)将碱性磷酸酶标记抗体溶于PBST中， 将冲洗干净的硝化纤维膜置于加入碱性磷酸酶标记抗体的PBST溶液中，并在摇床 上温育1 ~ 2h。
洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。
加入底物显色将NBT/BCIP加入到底物工作液中，将硝化纤维膜在加入 NBT/BCIP的底物工作液中温育(37°C),并在摇床上摇动30min。 洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。 漂白将冲洗后的硝化纤维膜在10%双氧水中漂白20min。 晾干、拍照、记录结果。
权利要求
1．一种去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗种苗的方法，其特征在于包括如下步骤①.原种处理和生产采集甘蔗品种主茎，砍成双芽段，选取若干有效芽段，经49.5～50.5℃水浴处理2～3h，然后在35℃～38℃光照培养箱中催芽3d～5d，催芽后育苗于35℃以下的温室中，待蔗苗长成2～4片叶时，定植于网室苗圃中，待甘蔗生长至10个芽左右，用经75％酒清浸泡消毒的蔗刀砍取整条蔗茎，并取汁用斑点酶标免疫试验法(DB-EIA)检测RSD病菌；②. 外植体选取与灭菌取步骤①中经DB-EIA检测结果呈阴性且生长健壮的蔗茎顶芽进行灭菌处理，作组织培养外植体；③. 外植体诱导培养将步骤②灭菌处理后的蔗茎顶芽在无菌条件下，切取其3～5mm的茎尖组织接种于诱导培养基上，诱导产生丛芽；④. 继代增殖培养将步骤③诱导分化的丛芽切成单株接种于增殖培养基上，进行继代增殖培养，在27～28℃散射光下培养，15～20d继代一次，继代数以不超过10代为宜；⑤.促根培养将步骤④长至5～6cm高的小苗转接于生根培养基上，进行生根培养；⑥.假植当步骤⑤生根小苗生长至6～8cm高，根系发育健壮后，将生根瓶苗移到自然光下炼苗2～3d，取出洗去苗上的培养基，种植于苗圃上，按常规管理，苗高35～45cm且生长健壮的假植苗可移栽于大田进行扩繁；⑦.苗圃扩繁将步骤⑥中的假植苗定植于大田建立一级健康种苗圃，再通过二级或三级苗圃扩繁，在从上级苗圃采苗进入下级苗圃扩繁时，采苗工具需用75％的酒精浸泡消毒5min以上，方可用于采苗，以防交叉感染；⑧.种苗RSD检测将步骤⑦扩繁的种苗，在种苗出圃用于大田生产用种前，抽样取蔗茎汁用DB-EIA检测RSD病菌，当蔗茎感染率为0时，种苗合格，可供大田生产种植。
全文摘要
本发明涉及甘蔗种苗的繁殖生产，提供一种去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗种苗的方法，包括如下步骤热水处理少量原种并生产、以其再生植株经斑点酶标免疫试验(DB-EIA)检测为阴性的茎尖为外植体，经诱导培养、继代增殖培养、促根培养、假植及二级或三级苗圃扩繁生产健康种苗，并在苗圃扩繁中注意砍种工具(蔗刀)的消毒，在种苗出圃用于大田生产用种前，抽样取蔗茎汁用DB-EIA检测RSD病菌，确保提供合格种苗。本发明的优点是能彻底去除甘蔗种苗宿根矮病病原菌，年繁殖系数高达1万倍以上，且种苗无变异，具有快速、高效、安全的优点，适合工厂化、规模化、标准化生产甘蔗健康种苗。
文档编号A01H4/00GK101361459SQ20081019863
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月19日 优先权日2008年9月19日
发明者何慧怡, 睿 刘, 杨湛端, 沈万宽, 邓海华, 陈仲华 申请人:广州甘蔗糖业研究所