专利名称：：异甘草甙的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物杀菌剂
技术领域：
，具体涉及一种甘草提取物中有效成分异甘草甙在防治植物病害中的新用途。
背景技术：
：近年来，随着植物病理学、生物学等相关学科的不断发展，农药中杀菌剂的研究已进入了一个崭新的时期。高效内吸性杀菌剂如Strobilurn类杀菌剂的出现，一方面使植物病害的防治获得了突破性进展，另一方面也造成病原菌对药剂的抗性问题日益突出。寻求对环境相容性好，对病原菌具有持久效果的无公害农药，在绿色食品日益被重视的今天显得格外重要。天然产物常表现出许多生物活性，数百年来广为人们所用。其中，植物源杀菌活性成分的研究和开发是解决当前化学杀菌剂诸多负面效应的一个重要研究方向。植物是生物活性化合物的巨大天然宝库，其产生的次生代谢产物超过400000种，据报道，现在地球上的35万多种植物中，约有2400种植物具有控制有害生物的活性。多年以来，国内外科研工作者对多种植物如楝科Meliacea植物中米仔兰属Aglaia植物、樟科Lauraceae植物印度鳄梨Perseaindica、天南星科Araceae、植物菖蒲等进行了杀虫物质的研究，而植物源抑菌、杀菌活性物质的研究相对较少，实际上据报道有1389种植物有可能作为杀菌剂，植物中的抗毒素、类黄酮、罹病相关的蛋白质、有机酸和酚类化合物等均有杀菌和抗菌活性。植物源杀菌物质大多为复合的抑菌有效成分，且具有多种作用位点和作用机制，因而植物被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源。甘草是豆科甘草属植物，其根和根茎是最常用的中药，主产于内蒙古和新疆维吾尔自治区，除用作药品外，还广泛用在食品、酿造和化妆品工业上，有着越来越广的应用前景。近些年，甘草的活性研究已成为关注的焦点。在临床医学上，该属植物广泛用于抗炎、镇痛、镇咳、抗溃疡、抗肝炎、解毒、治疗内分泌系统疾病等方面，即具有抗肿瘤作用、抗炎及抗变态反应作用、抗病原微生物作用、免疫调节作用等功效，作为抗病原微生物药物还可以应用在食品的保鲜防腐方面。在甘草属植物中，人们己对乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草、黄甘草、粗毛甘草等进行了化学成分的研究，如不同种、同种不同产地、植株不同部位、不同组织结构中甘草次酸(Clycyrrhetinicaci)含量的对比。实际上，从甘草属植物中已分离出约170余种化合物，其主要化合物是黄酮类和三萜类化合物，还有少量的生物碱，木质素，香豆素和多种氨基酸；在研究的成分种类上，主要有甘草甜素(Glycyrrhizin)、甘草多糖类(Glycyrrhizapolpsacchride)、甘草黄酮类(Glycyrrhizaflavonoides)，分别研究了它们的性质及用途。甘草的杀菌活性可见于医学上的报道，而关于甘草提取物对植物病原菌的抑菌活性未见报道，尤其是对甘草中具体是哪一种活性成份具有杀菌活性未见有技术报道。研究甘草提取物对植物病原菌的抑菌活性，将甘草提取物质应用到植物病害的防治上，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问驛具有重要的意义。而具体研究甘草提取物中活性成分对植物病原菌的抑菌活性将可以提高防治的针对性和提高防治效率，具有重要的应用前景，目前没有见到相关技术报道。
发明内容本发明的目的是克服植物杀菌剂技术的不足，提供甘草提取物活性成分异甘草甙在杀菌方面的新应用。本发明的目的通过以下技术方案来予以实现提供异甘草甙(isoliquiritin)在防治植物病害中的应用。所述异甘草甙(isoliquiritin)为为甘草甲醇提取物中活性成分。所述异甘草甙(isoliquiritin)的制备方法是采集甘草全株，优选甘草根，置于5(TC电热恒温鼓风干燥箱中烘干；粉碎机粉碎，过40目筛，所得甘草粉用密封袋密封避光处保存备提取用。采用现有常规技术对甘草粉粉进行提取。甘草粉甲醇提取物再进行活性成份的分离、提纯以及结构鉴定确认活性成分为异甘草甙(isoliquiritin)。将异甘草甙(isoliquiritin)配制成一定浓度的供试药液，采用菌丝生长速率法、孢子囊芽管萌发法、离体叶片法对霜疫霉属(i^roMO/p/^/ZzonaChen)、疫霉属(尸/z^to//2f/7oraca/w/c/Leonian)、芽枝霉属(C7^/ospoW謂LK.exFr)、核盘菌属(5Wera"'m'a入炭疽菌属(Co〃etoWc/mmCorda)等属的常见植物病害进行了室内毒力测定并进行了温室盆栽试验。试验结果表明，异甘草甙(isoliquiritin)对供试病原菌具有良好的抑制效果，可以开发其在防治植物病害中的新用途。作为一个优选方案，本发明提供了所述异甘草甙(isoliqiiiritin)以400pg/mL的干粉浓度应用于防治辣椒辣椒疫霉病。本发明的有益效果是本发明突破传统的甘草仅应用于医药学的限制，对甘草的应用提出了新的思路，并确定了甘草提取物活性成分异甘草甙(isoliquiritin)用于防治植物病害的技术方案。为植物替代化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。实施例1异甘草甙(isoliquiritin)的制备采集甘草根，置于5(TC电热恒温鼓风干燥箱中烘干；粉碎机粉碎，过40目筛。所得植物粉用密封袋密封避光处保存备提取用。本发明采用现有常规的超声波提取法制备甘草提取物，也可以参用现有的其他常规技术提取制备。将制备得到的甲醇提取物经分离、提纯以及结构鉴定得到异甘草甙(isoliquiritin)。实施例2:异甘草甙(isoliquiritin)对霜疫霉属(尸ero/，A^/oraChen)病菌的抑制作用用75%甲醇作为溶剂溶解提取物，然后再与PDA培养基配制成带毒培养基，以菌丝生长速率法测定不同浓度提取物对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑制作用。具体操作是-采用菌丝生长速率法用75%甲醇作为溶剂将异甘草甙(isoliquiritin)配制成一定浓度的供试药液，准确吸取lmL药液加入到49mL融化的PDA培养基中(约50°C)混合均匀后倒入灭过菌的培养皿中(直径9cm)，每瓶均匀倒入3个培养皿中，配制成所需浓度的带毒培养基。以混入相同体积的无菌水或75°/。甲醇做对照。供试病菌荔枝霜疫霉病菌在直径9cm的培养皿内用约17mLPDA培养基培养，培养5天后在菌落边缘菌丝生长旺盛处用打孔器打取直径为0.6cm的菌饼，分别接种于每个培养皿中央，有菌丝的一面向下。每个培养皿放一个菌饼，每个处理做三个重复，25。C培养箱中培养数天后，采用十字交叉法测定菌落直径(cm)，按以下公式计算抑菌率，实验结果见表l:抑菌率(％)=(CK菌落直径一0.6)—(处理菌落直径一0.6)CK菌落直径一0.6:100表1异甘草甙(isoliquiritin)对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的抑制作用(7天)处理浓度(干粉)mg/mL(cm)(f±S,￡.)平均抑菌率(%)CK(1.5%甲醇)107.422.68土0.031h1.43士0.021k0.78士0.031L63.836c80.683b89.443a注1)表中结果为三次重复的平均值；2)同一列数据后标有相同字母者表示在5%水平上差异不显著(DMRT法)。实验表明，异甘草甙(isoliquiritin)对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的抑制率明显高于处理，在10mg/mL、5mg/mL、lmg/mL干粉浓度时抑制率达89.443%、80.683%、63.830%，显示出很强的抑菌作用。实施例3:异甘草甙(isoliquiritin)对霜疫霉属(尸erOT0p力7"araChen)病菌的抑制作用采用载玻片法(方中达，1998)测定将在PDA培养基上培养IO天的荔枝霜疫霉病菌用无菌水洗下孢子囊，加入药液制备成含各种浓度药液的孢子囊悬浮液，孢子囊浓度调整为每视野(10x10倍)约4060个孢子囊，取50pL孢子囊悬浮液滴在载玻片上，再将载玻片置于已放一张滤纸的9cm培养皿内，并在滤纸上滴加少量无菌水以保湿，盖上培养皿，置于28匸下光照培养4小时后观察孢子囊萌发情况。按下式计算药剂处理的孢子囊萌发率和药剂对孢子囊萌发的抑制百分率。孢子囊萌发数孢子囊萌发率(°/。)=^^一——x100观察孢子囊数对照孢子囊萌发率一药剂处理孢子囊萌发率孢子囊萌发抑制率(％)=-xioo对照孢子囊萌发率采用载玻片法测定了异甘草甙(isoliquiritin)在1.3、1.0、0.7、0.5、0.3、0.15mg/mL下对荔枝霜疫霉孢子囊芽管萌发的抑制活性。实验结果表明处理后4小时，显微镜下观察，随着处理浓度的升高，孢子囊萌发率相应降低，抑制率依次为97.84%、86.45%、67.27°/。、52.67%、30.21%、13.26%，具体实验结果见表2。将平均抑制率值进行百分率一概率转换，以概率几率值为横坐标，处理浓度的对数值为纵坐标，求取回归曲线，得到毒力回归方程y=3.0474x+5.9922，相关系数R=0.9288，EC5Q为0.47mg/mL，95%置信限0.450.49。表2异甘草甙(isoliquiritin)对荔枝霜疫霉病菌孢子囊芽管萌发的抑制活性(4小时)处理(mg/mL)孢子囊总数萌发孢子囊总数萌发率(%)(f士S.五.)抑制率(%)1.3679182.16±0.4297.84士0.42fL07394213.55±1.0786.45士1.07e0.76729032.73±0.9667.27±0.96d0.572027847.33±0.9952.67士0.99c0.379474769.79±1.7630.21士1.76b0.1573369886.74±1.9713.26士1.97aCK70868997.28±0.882.72±0.88注1)表中萌发率、抑制率结果分别为五次重复的平均值;2)同一列数据后标有相同字母者表示在5%水平上差异不显著(DMRT法)。实施例4:异甘草甙(isoliquiritin)对疫霉属(尸力ytop力t力oracapw'cj'Leonian)病菌的的温室盆栽试验辣椒疫霉病菌孢子囊液的制备采用MSS溶液法(常彩涛等，1995)诱导辣椒疫霉病菌产生大量孢子囊，即将在PSA上培养7天的菌丝块，接种于含PS液体培养基的三角瓶中，在2527。C下培养4860小时后，滤去液体培养基，用20mLMSS液将滤纸上的菌丝清洗冲回三角瓶，在2527C下光照培养24小时后，取培养菌液用于接种辣椒苗上。试剂配方如下(1)MSS液配方MgS047H20,KN03Fe-EDTA蒸馏水(2)Fe-EDTA的配方:EDTA-Na2FeS047H20蒸馏水0.004mol/L0.05mol/LlmL1000mL14.86g24,9glOOOmL盆栽试验在塑料大棚中进行。每个塑料盆钵装自然风干菜园土0.5kg，移栽4叶期健壮辣椒苗。每处理3个重复，每个重复5盆，每盆4株。在幼苗长到45片真叶时，先喷药液，对照喷自来水，并设甲霜灵对照，2h后喷接制备好的辣椒疫霉病菌孢子囊悬浮液，并立即覆盖塑料薄膜保湿24h。2、4、7d分别观察发病情况，记录温度，发病程度一株为单位，按04级的分级标准调査0级无病；l级l片叶发病；2级2片叶发病；3级3片叶发病；4级4片以上叶发病或茎受害i:(病级叶片数x病级级数)病情指数=叶片总数X最高病级级数处理病情指数防治效果(％)=(1对照病情指数xiooxioo实验结果见表3所示表3异甘草甙(isoliquiritin)对辣椒疫霉病的盆栽防治效果2d5d10d浓度|ig/mL病情指数(%)防效(%)病情指数(%)防效(%)病情指数(%)防效(%)对照24.17/52.5/80.00/508.3365.53b29.1744.43c52.5034.38c1006.6772.40b13.3374.6lab40.0050.00b2003.3386.22ab9.1782.53a25.0068.75ab3002.5085.65ab8.3384.13a20.0075.00a4000.8396.56a5.8388.89a10.8386.46a53%雷多米尔锰锌3.3386.22ab7.5085.71a16.6779.16a注1)53%雷多米尔处理为稀释500倍液；2)表中数据为3次重复的平均值；数据后标有相同字母者表示在5%水平上差异不显著(DMRT法)。室内盆栽测试结果显示，异甘草甙(isoliquiritin)对辣椒疫霉病有较好的防治效果，防治效果随处理浓度的升高而提高。供试浓度为50、100、200、300、400ng/mL时，处理2天后防效依次为65.54%、72.40%、86.22%、85.66%、96.57;处理5天后防效依次为44.44%、74.61%、82.53%、84.13%、88.90%;处理10天后防效依次为34.38%、50.00%、68.75%、75.00%、86.46%。结果还显示处理浓度为400Mg/mL的防效优于对照药剂雷多米尔锰锌。实施例5:异甘草甙(isoUquiritin)对3种病原菌的抑菌活性采用菌丝生长速率法测定异甘草甙(isoliquiritin)对3种分属于芽丰支霉属(C7a^wpcWwmLK.exFr)、核盘菌属(5Weraf/m'a入炭疽菌属(Co//etoWc/mwCorda)的花生黑霉病、大麦条纹病、香蕉炭疽病原真菌的抑制效果。在无菌条件下，配制不同浓度药剂，再倒入已融化的培养基(温度约为60°C)中，充分摇匀，趁热倒入90cm的培养皿中制成含药培养基平板。平板凝固冷却后用接种针接进大小一致、生长一致的各种植物病原真菌菌饼(O=5.0mm)，每皿接1个菌饼，生长有菌落的一面朝下，每处理3个重复，同时设清水空白对照、1%甲醇对照。置于生化培养箱中，25匸条件下培养5天，再用十字交叉法测量供试真菌菌落直径的大小，按以下公式计算抑菌率，进而计算药剂处理对不同病菌的有效抑制中浓度(EC5())及相关系数(。值。加es。n—[CK(o)-原菌饼o]-[处理(o)-原菌饼①]x100抑菌率(^)一[CK(①)-原菌饼①]Xl00抑菌活性测定结果见表4<表4异甘草甙对3种植物病原真菌的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1、异甘草甙在防治植物病害方面的应用。2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述异甘草甙为甘草干燥根的甲醇提取物中活性成分。3、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述异甘草甙的制备方法是采集甘草全株，烘干，粉碎得甘草粉；甘草粉经提取得到甘草提取物；提取物经分离、提纯和结构鉴定得到异甘草甙。4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述植物病害包括霜疫霉属、疫霉属、芽枝霉属、核盘菌属和/或炭疽菌属植物病害。5、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述异甘草甙以400pg/mL的浓度应用于防治辣椒辣椒疫霉病。全文摘要本发明公开了一种异甘草甙的应用，具体应用于防治植物病害。通过室内生物测定和盆栽试验，本发明提供了甘草甲醇提取物中活性成分异甘草甙(isoliquiritin)对霜疫霉属(PeronophythoraChen)、疫霉属(PhytophthoracapsiciLeonian)、芽枝霉属(CladosporiumLK.exFr)、核盘菌属(Sclerotinia)、炭疽菌属(ColletotrichumCorda)等属的常见植物病害良好的防治应用。本发明对甘草及其提取物用于防治植物病害的新用途提出了新的思路，为植物替代化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。文档编号A01N43/16GK101543214SQ20091003835公开日2009年9月30日申请日期2009年3月31日优先权日2009年3月31日发明者勇曾,林庆胜,罗建军,胡美英,郝卫宁,钟国华申请人:华南农业大学