专利名称：一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用。
背景技术：
抗生素能够抑制或杀伤病原微生物，其应用对保障人类健康发挥了重要的作用。 然而，由于抗生素的过度使用，增加了细菌的耐药性，导致抗生素的疗效下降。抗菌肽是 生物中存在的具有抗菌活性的小分子多肽，它们是生物抵御病原微生物入侵的一道重要防 线。抗菌肽可以作用于病原菌的细胞膜，使膜去极化或者形成“孔洞”，造成细胞内含物外流 或者肽分子进入细胞内部与靶标作用，进而杀死细菌。由于抗菌肽可作用于细菌的多个位 点，所以不易引起细菌的抗性，并且抗菌谱宽。因此，抗菌肽有可能成为新的抗菌药物。另 外，除临床应用外，抗菌肽的应用领域还包括用于食品防腐剂、饲料添加剂、化妆品领域以 及提高植物抗病性等。第一个报道的抗菌肽是天蚕素(cecropins) (Boman et al, 1974)，随后，蛙皮素 (Magainins)、蜂毒素(Melitins)、防御素(Defensins)等先后被发现(石强等，2000)。三十 多年来，人们鉴别获得了上千个抗菌肽，所采用的主要筛选策略大致可分为如下几种一是 基于分离技术的筛选策略；二是利用差异显示技术筛选抗菌肽编码基因；三是基于同源序 列筛选抗菌肽编码基因；四是用生物信息学方法鉴别抗菌肽；五是高通量筛选鉴别抗菌肽 的策略(王海娇等，2007)。2006年，成雄鹰等发展了一种简便的高通量方法，该方法基于各 种cDNA表达文库或人工合成的oligo表达文库，将支持物(如微孔滤膜)放在含有合适抗 性的固体培养基上，表达文库按一定的密度涂在支持物上，待菌落长到一定大小后，将支持 物转到含有诱导物的培养基上继续培养，然后染色；鉴别克隆或细胞的活性。如果诱导表达 产物对宿主有害，使宿主活性降低或死亡，则死体被染料染色后着色。脱水素(Dehydrin)最早由Close等人发现，这是一类可被外源ABA、干旱及盐分诱 导的蛋白质，这些蛋白质具有很强的亲水性(Close et al，1989)。此后，人们陆续报道了不 同植物中的脱水素质白质。按Dure对逆激蛋白质的分类，脱水素蛋白质属于LEA D-II家 族，分子量从9kD到200kD不等，其结构中一般含有以下三个保守片段Y、K和S片段(Dure et al. 1993)。其中，K片段富含赖氨酸，为所有Dehydrin家族蛋白质所共有，其保守序列 为EKKGIMDKIKEKLPG(Close et al. 1997)。但到目前为止，还没有脱水素蛋白质能够抑制细 菌生长的报道。利用高通量筛选体系，本发明人从水稻、青蛙等表达文库中鉴别获得了几十个对 大肠杆菌生长有抑制作用的克隆，与未诱导培养基中细胞的生长相情况比较，细胞生长程 度明显下降。为了进一步验证水稻脱水素蛋白质的抑菌功能，本发明利用大肠杆菌体系表 达了脱水素蛋白质及其片段，体外合成了脱水素蛋白质的片段，并进行了水稻脱水素蛋白 质的抑菌活性实验。
发明内容
本发明的目的是提供一种有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用于抑菌实践。本发明的第一个目的是提供一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质(英文名称 为Dehydrin)，来源于水稻(Oryzae Sativa L.)是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白 质1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)将序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白质；3)序列表中的SEQ ID NO=I的15个氨基酸以上片段；上述具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质(Dehydrin)的编码基因，也属于本发明 的保护范围，其核苷酸序列符合下述特征之一1)序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列；2)与序列表中SEQ ID No 2的DNA序列有85%以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列；3)序列表中SEQ ID No 2的DNA序列中长于45bp的片段，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列。本发明的另一个目的是水稻脱水素蛋白质在抑菌中的应用。实验证明，所述的水稻脱水素蛋白质或其片段在细菌中表达后，其细菌裂解液或 纯化蛋白质能够抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黄八叠球菌及金黄色葡萄球菌等革兰 氏阳性细菌的生长，同时，体外合成的所述蛋白质片段能够抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆 菌、黄八叠球菌及金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的生长。所以，该蛋白质在细菌、真菌或植物中表达或纯化的形式以及含有上述基因序列 的质粒、菌株及转基因植物也可应用于对细菌生长的抑制。本发明的有益效果用筛选水稻cDNA表达文库的方法，获得了具有抑菌活性的脱水素(Dehydrin)克 隆，在细菌中表达Dehydrin蛋白质，其裂解液对革兰氏阳性菌具有抑菌活性；将Dehydrin 蛋白质分段表达，表明De-K3片段对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、金黄色 葡萄球菌等有明显的抑制效果；进一步体外合成了 Dehydrin片段，也证明具有抑菌活性。 将细菌、真菌或植物中表达的Dehydrin蛋白质或片段掺入饲料、食品和化妆品中，可用于 对细菌的抑制；另外，将Dehydrin基因或片段转入植物，使其编码蛋白质在特定生物逆境 诱导下表达，可提高植物对逆境的抵抗能力；
图1是本发明所述的从水稻cDNA文库中筛选获得的RR46克隆的液体培养生长曲线。图2是本发明所述的水稻脱水素蛋白质的细菌裂解液的体外抑菌实验结果。1为 诱导后的Dehydrin表达细菌的裂解液；2为诱导后的pET28a空载体表达细菌的裂解液；3 为未诱导Dehydrin表达的细菌裂解液；4为未诱导的pET28a空载体的细菌裂解液。图3是本发明所述的De_K3片段裂解液的体外抑菌实验结果。其中1为诱导后的De-K3表达细菌裂解液；2为诱导后的pET28a空载体的细菌裂解液；3为未诱导De_K3表达 的细菌裂解液；4为未诱导pET28a空载体的细菌裂解液；图4是本发明所述的体外合成的Dehydrin片段的体外抑菌实验结果。其中1、2、 3所用合成多肽的浓度分别为lmM、0. 5mM和0. 25mM。
具体实施例方式下述实施例中所用方法均为分子生物学实验室所用的常规方法。生物材料、主要试剂和仪器水稻表达cDNA文库(载体pBlueSCript，受体菌S0LR)，大肠杆菌菌株 BL21-DE3-pLysS ；表达载体pED8a，指示菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)均为本实验室保存。细菌指示菌短小 芽孢杆菌(Bacillus pumilus,CVCC709)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,CVCC717)、大 肠杆菌(Escherichia coli，CVCC1570)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea,CVCC1600)均购买 自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。DNA测序及Oligo合成由北京华大基因研究中心完 成，多肽合成由上海华大天源生物科技有限公司完成。IPTG购自北京赛百盛生物技术有限 公司；氨苄青霉素、卡那霉素购自上海生工；微孔滤膜购自北京升河膜生物技术公司；台盼 蓝(Typan Blue)和溴酚蓝购自Sigma公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；超声破碎仪购 自宁波新芝生物科技股份有限公司。实施例1、脱水素克隆的获得及细菌的生长曲线按Cheng等(Cheng et al,2009)的筛选方法，用来自水稻根的表达文库进行筛 选，经IPTG诱导后，挑选台盼蓝染色变蓝的菌落，经2轮诱导表达验证后，选取35个克隆进 行了末端测序，测序结果进行BLASTX分析，发现有7个克隆编码Dehydrin蛋白质，其中4个 克隆为编码SK3-Dehydrin蛋白质的基因，它们的编号分别为RR46、RR51、RR142和RR306。取RR46克隆的过夜菌，按1 %比例接种IOOmL含有氨苄青霉素100 μ g/mL LB液 体培养基，37°C振荡培养至0D600值0. 1左右时，取出50mL加入IPTG (终浓度lmmol/L) 诱导，剩余的作为未诱导的对照，每Ih取样一次测0D600，绘制RR46克隆菌的生长曲线，带 pBluescript空载体的SOLR菌为负对照，从生长曲线可见，诱导后的阳性克隆生长明显慢 于不诱导的菌株和对照菌株(图1)。实施例2、脱水素基因的克隆及蛋白质的表达以RR46质粒DNA为模板，扩增获得了 dehydrin基因，克隆到pET28a表达载体中 (翟从劼等2009)，将克隆的pET28a-Dehydrin质粒转化到大肠杆菌BL21_DE3-pLysS菌株 中，划线挑取单菌落接种3mL含卡那霉素50 μ g/mL LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。 按1 %接种量转接IOOmL含卡那霉素50 μ g/mL LB液体培养基，37°C培养至0D600 = 0. 6 0.8，取出50mL加入IPTG至终浓度lmmol/L，诱导池，其余细菌培养相同时间。离心，弃上 清，清洗菌体3次，每次15mL无菌水。再用5mL PBS缓冲液重悬，冰上超声破碎(开/关 =5S/5S) IOmin, 12000r/min，4°C离心lOmin，上清即为Dehydrin蛋白质细菌裂解液。收集 250mL Dehydrin诱导表达菌，离心去上清，清洗3次，每次15mL无菌水，超声破碎后12000r/ min，4°C离心lOmin，上清用Ni柱纯化，收集蛋白质含量较高的组分。实施例3、脱水素蛋白质对细菌生长的抑制
用文件打孔器裁打直径约0. 7cm圆形滤纸片，灭菌后烘干，铺到新鲜制备的含有 待试菌的培养基表面，将20 μ L待测的液态蛋白质加到滤纸上，37°C培养过夜，第二天观察 抑菌圈并拍照，结果表明，细菌裂解液对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、金黄 色葡萄球菌有明显的抑菌效果，但对大肠杆菌、水稻白叶枯病菌没有可见的抑菌效果(图 2)，纯化的Dehydrin蛋白质没有抑菌活性(数据未附)。实施例4、脱水素蛋白质片段的表达Dehydrin蛋白质可分为二部分，为了确定负责抑菌活性的片段，进行了 Dehydrin 基因的亚克隆实验。扩增De-S片段所用引物为，5 ‘ -GGAATTCCATATGGAGGATGAGAGGAACACGG -3'和 5 ‘ -CGGGATCCTTAGCCGTTGTCATCGATCACC-3 ‘.，扩增 De_K3 片段所用引物为 5 ‘ -GG AATTCCATATGGAGGTGATCGATGACAAC-3‘和 5' -CGGGATCC TTAAGCGCTGCTCTTGTGC-3‘，其中 下划线为限制性内切酶Nde I和BamH I的识别位点。PCR扩增后将产物克隆到pET28a载 体中，测序验证后诱导表达二个片段蛋白质。然后分别用它们的细菌裂解液和纯化的蛋白 质对上述指示菌进行抑菌实验，结果表明，De-K3片段裂解液对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆 菌、藤黄八叠球菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果(图幻，而De-S片段裂解液、纯化的 片段蛋白质没有可见的抑菌效果(数据未附)。实施例5、体外合成的脱水素蛋白质的抑菌活性为了进一步验证De_K3的抑菌效果，体外合成了 De_K3的片段，其序列为 KKKKGLKEKIKEKLPGHK，并进行了合成多肽的抑菌实验，结果表明，三种浓度(lmM，0. 5mM和0.25mM)的多肽溶液对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，而对 藤黄八叠球菌没有可见抑菌效果(图4)。实施例6、多肽的最小抑制浓度(MIC)和最小杀死浓度(MBC)检测采用培养基稀释法检测(Woong et al，2006)，在96孔中加入不同浓度的体外合成 多肽，然后加入105CFU/mL的指示菌，使多肽与细菌总体积为200 μ L。37°C培养1 后，观 察96孔板各孔的混浊度，以肉眼不可见微生物生长的最低多肽浓度为最小抑制浓度MIC， 将上述肉眼看不到细菌生长的样品取出，涂到LB平板上37°C培养12h，没有细菌生长的最 低多肽浓度即为最小杀死浓度MBC，上述试验至少重复三次。经检测，体外合成多肽对短小 芽孢杆菌的最小抑制浓度为130μ g/mL，最小杀死浓度为> 400μ g/mL。参考文献· Boman HG, Nordstrom K, Normark S. Characteristics of an inducible cell-free antibacterial reaction in hemolymph of Samia cynthia pupae. Infect Immun,1974，10(1) :136-145. 石强刘飞鹏.抗菌肽克隆基因的表达和转基因研究现状.生物工程进展， 2000,20(1) :37-40.# Dure L. Response of plants to eel lular dehydration during environmental stress. Rockville :American Society Physiologists,1993. 91-103.· Cheng XY, Liu GZ, Ye GY, Wang HJ, Shen XJ, Wu KC, Xie JH, Altosaar1.Screening and cloning of antimicrobial DNA sequences using a vital staining method. Gene,2009，430 :132-139.參 Woong SJ, Hong KK, Ki YL, Sun AK, Yeon SH, In HL, Antifungal activityof synthetic peptide derived from halocidin, antimicrobial peptide from the tunicate, Halocynthia aurantium. Federation of European Biochemical Societies, 2006,580 :1490-1496. 王海娇李莉云刘国振.抗菌肽的筛选策略及其应用研究进展.生物技术通报 2007,5 :29-33.· Close TJ, Kortt AA, Chandler PM, A cDNA-based comparison of dehydration-induced proteins (dehydrins)in barley and corn.Plant Molecular Biology,1989，13 :95-108.# Close TJ. Dehydrins -.a commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature. Physiol Plant, 1997,100 :291-296.# Close TJ. Dehydrins :emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins.Physiol Plant, 1996,97 :795-803.· Campos F, Zamudio F, Covarrubias AA. Two different late embryogenesis abundant proteins from Arabidopsis thaliana contain specific domains that inhibit Escherichia coli growth.Biochemical and Biophysical Research Communications,2006, 342 :406-413. 翟从劼王海娇李莉云刘国振。水稻脱水素蛋白质的体外表达及纯化研究，植 物生理与分子生物学研究，2009, 206-209.序列表<110>河北农业大学<120> 一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用<130><160>2<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>196<212>PRT<213>0ryza sativa<400>1Glu Val lie Asp AspAsnGlyGluValValLysArgLysLysLysLys1 51015Gly Leu Lys Glu LyslieLysGluLysLeuProGlyHisLysAspHis202530Ala Gly Glu His AlaProProProAlaAlaThrGlyPheProAlaPro354045Ala Pro Pro Ala SerValValThrAlaAlaProThrProAlaProAla505560Pro Val Val Thr HisGlyAspHisHisHisAspThrAlaValProVal65707580Glu Lys lie GluAla Pro Glu Glu 100 GlyLeu ProGly 115 AlaGly Asp His Ala Lys 85Glu Lys Lys His Lys LysGly Phe 105 GluPro Ala 130Pro Pro Ala ThrPro 120 ProPro 145 LysSer Pro Ala Ala 135Glu ValGly lie LeuGlu 150LysAla Ser lie Met GluGly Ser Gly Lys SerGlu 180 AlaGly 165Glu Asp Lys ThrSer 195<210>2<211>591<212>DNA<213>0ryza sativa <400>2Thr90LeuAspThrSerGluAspAlaThrPro 155 LeuAla 185Lys 170Ala AlaAlaLysThrPro 140 AspProAlaThr Leu lieAla 125 AlaGlyGlyThrLys 110 ValProLysTyrGly 190Pro95GluProAlaGluHis 175 GluArgLysProHisLys 160 LysHisgaggtgatcgatgacaacggcgaggtggtcaagaggaagaagaagaaggggctcaaggag60aagatcaaggagaagctgcccggccacaaggaccatgccggtgagcatgctcctccgccc120gcggcgacgggcttccccgcgccggctccgcctgcatccgtggtgacggccgcgcccacg180ccagctcctgctcccgtggtgactcacggcgatcaccaccacgacaccgccgtccccgtg240gagaagatcgagggtgatcacgccaagacggaggcgaccctgccacgtgcacccgaggag300gagaagaagggcttcctcgacaagatcaaggagaagctgcccggcggccacaagaagccg360gaagacgcaactgctgtgccgccgccggccgcctcaccggctgctcctgccactactccg420gcgccagcacacccaccgccggctacagaggaagtgagcagcccggatgg gaaggagaag480aagggtatactgggcaagatcatggagaaactgcccggttaccacaagggctccggcgag540gaagacaagaCCgCCgCCgCcgccaccggcgagcacaagagcagcgcttaa59权利要求
1.一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有下述氨基酸残 基序列之一1)序列表中的SEQID NO 1 ；2)将序列表中SEQID NO 1的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白质；3)序列表中的SEQID NO 1的15个氨基酸以上片段；
2.如权利要求1所述的具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质的编码基因，其特征在于其 具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 2的核苷酸序列；2)与序列表中SEQID No :2的DNA序列有85%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列；3)序列表中SEQID No 2的DNA序列中长于45bp的片段，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。
3.表达权利要求1中的蛋白质的细菌，其裂解液在抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、 黄八叠球菌及金黄色葡萄球菌的用途。
4.表达权利要求1中的蛋白质或多肽的细菌，其裂解液在抑制革兰氏阳性细菌生长中 的用途。
5.体外合成的权利要求1的蛋白质或多肽片段，其在抑制革兰氏阳性细菌生长中的用途。
6.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系，其特征在于其应用于植物对生物逆境的 抵抗。
全文摘要
本发明公开了一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质，该脱水素蛋白质是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白质；3)序列表中的SEQ ID NO1的15个氨基酸以上片段；本发明体外表达的水稻脱水素蛋白质、蛋白质片段及体外合成的片段，均具有对特定革兰氏阳性菌的抑菌活性，提取本发明公开的植物中的脱水素蛋白质可用于对革兰氏阳性菌的抑制，将本发明的水稻脱水素蛋白质编码基因转入植物中可提高对生物逆境的抗性。
文档编号A01P1/00GK102040656SQ200910075648
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月12日 优先权日2009年10月12日
发明者兰金苹, 刘丽娟, 刘国振, 成雄鹰, 李莉云, 翟从劼 申请人:河北农业大学