专利名称：一种斑玉蕈及其育种中漆酶转化体系的建立方法
技术领域：
本发明属于斑玉蕈技术领域，更具体涉及一种斑玉蕈及其育种中漆酶转化体系的建立方法。
背景技术：
斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，白蘑科，玉蕈属， 是一种珍稀名贵食用菌，经济价值极高；但在栽培生产中周期较长，菌体的生长速度较慢抑 制杂菌的能力较差，在生产过程中极易染菌，降低了原料的利用率也增加了生产成本，在一 定程度上限制了斑玉蕈的推广生产。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家 族，能氧化酚类和芳香类化合物并能降解木质素，漆酶具有降解木质素为菌体生长提供养料 的能力，所以具有此酶活性的菌种一般生长速度较快、生产周期较短、原料的利用率也较高 。漆酶在降解木质素的同时还产生了酚类或醌类化合物，这些物质可有效地抑制杂菌的生长 繁殖，所以具有漆酶活性菌株的抗菌能力也相对较强。由于斑玉蕈中不含有漆酶，其生产周 期长达120-150天；生长速度较慢、生产周期较长，抗菌弱。
原生质体融合技术，是利用溶壁酶或其他理化方法去除细胞壁，在融合剂的诱导作用下 ，裸露的原生质融合，两细胞的基因组相互接触、交换、重组，而形成的具有双亲特性重组 子的过程。由于去除了细胞壁，解除了细胞间在物理上、生理上的主要障碍，所以可以提高 融合率，而且使遗传差距较大的远缘杂交成为可能。原生质体融合技术是近代生物工程的主 要内容，也是近代生物技术的重大突破，其最显著的特点是不依赖生物本身的性功能，即能 有效地克服性因子的障碍，用物理、化学方法使细胞融合，从而为获得具有突出优良性状的 细胞类型开辟了新途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种斑玉蕈及其育种中漆酶转化体系的建立方法，要解决现有技术 中的斑玉蕈不具有漆酶活性、生长速度较慢、生产周期较长，抗菌弱的问题，本发明的方法 培养的斑玉蕈新菌株具有漆酶活性高、生长速度快、生产周期短等优异性状。
本发明的斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)新菌株金山l号，具有漆酶活性，已经于 2009年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.3120。本发明的斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)新菌株金山l号的具有漆酶活性高、生长速 度快、生产周期短等优良性状，通过实验测定在PDA平板上斑玉蕈菌丝日均生长速度为5.7 mm，金山1号菌丝的日均生长速度为6.8 mm，明显快于斑玉蕈。出菇实验结果显示，金山l号 出菇时间比斑玉蕈早4 6天，生长周期与斑玉蕈相比縮短了10 15天，产量提高了0.26倍。 金山l号在农艺性状上与斑玉蕈也有差异，菌盖颜色为浅灰色并带有少许的淡黄色，而斑玉 蕈菌盖呈灰褐色，在菇型上金山l号菌盖直径为2.5 4cm，斑玉蕈菌盖直径为2 3cm。
本发明的金山1号的其他农艺性状与斑玉蕈基本一致。
本发明采用具有漆酶活性的凤尾菇与斑玉蕈进行原生质体融合，建立斑玉蕈中的漆酶转 化体系。
本发明的显著优点是运用原生质体融合技术在斑玉蕈育种中建立漆酶的转化体系，将
漆酶活性较高、生长速度较快、生产周期较短的凤尾菇与斑玉蕈进行原生质体杂交融合建立 漆酶转化体系，以期获得具有漆酶活性高、生长速度快、生产周期短等优良性状的又具有斑 玉蕈优良性状的融合菌株，为斑玉蕈的规模化、工厂化栽培生产奠定基础。食用菌原生质体 融合育种技术的进展同其他生物相比，显得十分缓慢，其中原因与原生质体再生率以及难以 形成子实体有关，而最重要的原因是原生质体融合技术选育的新品种后代缺乏明显的筛选标 记，后期筛选过程工作量大，鉴定费时费力，本发明利用漆酶特性，应用于食用菌菌种的遗
传改良研究，在此体系基础上建立用含RB亮蓝的培养基筛选此体系转化后产生的融合子，该 筛选方法筛选杂交种，目标明确，简单快速，这一点具有一定的原创性。
图1是本发明的斑玉蕈育种中漆酶转化体系的建立方法技术路线图。
具体实施例方式
凤尾菇在真菌分类学上属担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属；据研究发现其生长速度 较快、生产周期较短(50-60天左右)，其漆酶活性较高。
采用本身就具有漆酶活性的凤尾菇与斑玉蕈进行原生质体融合，建立斑玉蕈中的漆酶转 化体系，并将融合后的斑玉蕈新菌株通过筛选鉴定获得具有漆酶活性、生长速度快、生长周 期短同时又具有斑玉蕈优良性状的融合菌株。
以下就实现本发明的技术特征通过实施例具体说明。
实施例
具体步骤包括
a:分别培养具有漆酶活性的凤尾菇菌种与一般的斑玉蕈菌种(1) 斑玉蕈与凤尾菇菌丝形态观察与比较 将两种菌分别接种到PDA平板上25'C恒温培养4 6d，凤尾菇接种第2天新菌丝即开始萌
发，而且菌丝粗壮、浓密呈放射状生长，斑玉蕈在接种第3 4天才有少许菌丝产生，菌丝较 细，不如凤尾菇菌丝浓密，用接种针分别挑取斑玉蕈与凤尾菇的幼嫩菌丝，用棉兰染色并制 成玻片在光学显微镜下观察菌丝顶端生长情况、核相及有无锁状联合。观察发现，凤尾菇菌 丝顶端多分枝，双核菌丝具有锁状联合。斑玉蕈单核菌丝直径为1.0 2.0um，细胞狭长， 有分隔，少分枝，无锁状联合；双核菌丝直径为2.0 3.0um，细胞狭长，有明显锁状联合
(2) 相同培养条件下生长速率的比较
用直径为O. 5cm打孔取样器取凤尾菇与斑玉蕈的菌块分别接种于PDA平板上，25。C恒温 培养测定其菌丝直径的大小并计算其日均生长速度。凤尾菇菌丝长满平板(90 mm)需要ll 12 d，日均生长速度7. 5 8.2 mm，斑玉蕈菌丝长满平板需要15 16 d，菌丝的日均生长 速度为5. 6 6. 0 mm。
(3) 漆酶活性的测定与比较参考文献(兰瑞芳，2002; C. Srinivasan， 1995) 采用ABTS法测定漆酶活性。将斑玉蕈与凤尾菇分别由试管斜面转接至PDA液体培养基中
，25°C、 140 r.min—1振荡培养5 7 d，将发酵液经纱布过滤，4°C、 8000 r min—1离心 10 min，上清液即为粗酶液。以ABTS为底物，3 mL反应体系中含有NaAc - HAc缓冲液(pH 5.0) 2.7 mL、粗酶液IOO yL和l mmol L—1 ABTS溶液200 y L，测定反应开始的前3 min内，在420 nm吸光值的增加。将粗酶液在沸水中煮IO min作对照。定义每分钟使吸光度 增加0.01所需的酶量为1个酶活力单位。经计算测得凤尾菇的酶活为32.4U *mL—、斑玉蕈提 取的粗酶液加入反应体系中前三分钟内吸光度几乎没有变化。 b:斑玉蕈与凤尾菇原生质体的制备及融合，
(1) 斑玉蕈与凤尾菇菌丝体的培养和原生质体的制备，参考文献(彭卫红，2005):
(2) 灭活的凤尾菇原生质体与具有活性的斑玉蕈原生质体在融合剂的诱导下进行融合
取l mL制备好的凤尾菇原生质体于55'C水浴灭活处理45 50 min，然后加入l mL具有活 性的斑玉蕈原生质体和2 mL融合剂于32。C水浴温育25 30 min 。
融合剂的制备为聚乙二醇(PEG-4000) 25% (w/v) ， CaCl2 H20 50 mmol/L，甘露 醇O. 6mol/L，用水配制，pH 8.0， 121。C灭菌20min;
(3) 融合子的再生培养及初步筛选吸取经b步骤(2)培养的斑玉蕈和凤尾菇的融合原生质体100 uL，在含有再生培养基 的平板上涂布，于25。C恒温培养5 7 d，然后将形成的单菌落转接至RB-PDA平板上于25。C恒 温培养，具有漆酶活性的融合菌株会使RB-PDA平板形成赤黄色，反之RB-PDA平板不会变色。 将变色明显的融合菌株转试管斜面保存。
再生培养基蔗糖0.4mol/L，发干酵母粉O. 5wt%，蛋白胨0.05 wt%，琼脂下层用2 wt%，上层用0.3 wt%，其余为水，121°C灭菌20 min;
RB亮蓝溶液RB亮蓝(Remazol brilliant blue R)购于Sigma公司，RB亮蓝加水配制 成5 mg/ml的溶液，12rC灭菌20 min，在倒平板时与PDA培养基混匀终浓度为O. 05 wt %;
根据以上步骤建立斑玉蕈中的漆酶转化体系。
融合菌株的鉴定和遗传稳定性分析的具体步骤包括
(1) 通过RB-PDA亮蓝平板检测法对具有漆酶活性的融合菌株进行鉴定，具有漆酶活性 的融合菌株在RB-PDA上变色极明显而不具有漆酶活性的融合菌株在RB-PDA上不变色，据此性 状的差异在初筛中能够快速筛选出具有漆酶活性的融合菌株。
(2) 采用ABTS法测定融合菌株中漆酶的活性，参考文献(兰瑞芳，2002; C. Srinivasan, 1995);
(3 )通过设计引物和PC財广增鉴定融合菌株中是否含有漆酶基因 根据已报道的真菌平菇漆酶基因序列(如可以根据NCBI数据库检索真菌平菇(凤尾菇为 平菇的一种)的漆酶基因序列)设计引物、合成引物、进行PC財广增、电泳分析，以此鉴定 融合菌株中是否含有漆酶基因。电泳结果显示凤尾菇及斑玉蕈新菌株金山l号确实含有漆酶 基因而实验出发菌株斑玉蕈无漆酶基因。
(4)采用上述方法对继代培养的融合菌株进行漆酶活性分析，以测定漆酶基因能否稳 定遗传。
将筛选鉴定的具有漆酶活性的融合菌株进行出菇实验，并对菇体进行组织分离培养。然 后采用RB-PDA平板法，ABTS漆酶活性测定及漆酶基因检测法对融合菌株下一代进行鉴定。实 验结果显示继代培养的融合菌株在RB-PDA平板上变色明显，用ABTS法测定其漆酶活性也较稳 定，说明漆酶基因已经完全整合到斑玉蕈的基因组内并且能够稳定遗传。
斑玉蕈新菌株金山l号具有漆酶活性高、生长速度快、生产周期短等优良性状，通过实 验测定在PDA平板上斑玉蕈菌丝日均生长速度为5.7mm，金山l号菌丝的日均生长速度为 6.8mm，明显快于斑玉蕈。用组织培养瓶装栽培料进行出菇实验(每个瓶子装料量相当，接 种量相同，每个菌种接5瓶，24。C恒温培养)，结果显示斑玉蕈菌丝满瓶时间为40 42天，金山1号满瓶时间为34 35天。经过相同时间的菌丝后熟期培养，金山1号出菇时间比斑玉蕈 早4 6天，整个生长周期为85 90天，而玉蕈菌的生长周期一般为110 115天。玉蕈菌平均 每瓶的鲜菇重量为34. 58 g，金山1号平均每瓶的鲜菇重量为43.62 g是玉蕈菌的l. 26倍。金 山l号在农艺性状上与斑玉蕈也有差异，主要表现在菇体的色泽与菇体的形状。金山l号菌盖 颜色为浅灰色并带有少许的淡黄色，而斑玉蕈菌盖呈灰褐色，在菇型上金山l号菌盖直径为 2.5 4cm，斑玉蕈菌盖直径为2 3cm。金山l号的其他农艺性状与斑玉蕈基本一致。 制备方法中的参考文献
兰瑞芳.孢薪菇漆酶的提取及其理化性质[J].福建师范大学学报.2002， 9 (3): 58 0.
C. Srinivasan， T. M. D' Souza， K. Boominathan， C. A. Reddy. Demonstration of Laccase in the White Rot Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium BKM-F1767. Appl. Environ. Microbiol. 1995，61(12): 4274 277
彭卫红，甘炳成，郑林用等.茯苓与凤尾菇目间原生质体融合研究初报.菌物学报， 2005， 24 (1) : 42-47.
权利要求
1.一种斑玉蕈，其特征在于所述斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)金山1号，其CGMCC No.3120。
2 根据权利要求l所述的斑玉蕈，其特征在于所述斑玉蕈具有漆酶活性。
3 一种如权利要求l或2所述的斑玉蕈育种中漆酶转化体系的建立方 法，其特征在于采用具有漆酶活性的凤尾菇与斑玉蕈进行原生质体融合，建立斑玉蕈中的 漆酶转化体系。
4 根据权利要求3所述的斑玉蕈育种中漆酶转化体系的建立方法，其 特征在于所述建立方法的具体步骤包括a:分别培养具有漆酶活性的凤尾菇菌种与一般的斑玉蕈菌种(1) 斑玉蕈与凤尾菇菌丝形态观察与比较 将两种菌分别接种到PDA平板上25。C恒温培养4 6天，用接种针分别挑取斑玉蕈与凤尾菇的幼嫩菌丝，用棉兰染色并制成玻片在光学显微镜下观察菌丝顶端生长情况、核相及有无 锁状联合；(2) 相同培养条件下生长速率的比较无菌的条件下用直径为O. 5cm打孔取样器取凤尾菇与斑玉蕈的菌块分别接种于PDA平板 上，25'C恒温培养测定其菌丝生长直径的大小并计算其日均生长速度；(3) 漆酶活性的测定与比较采用ABTS法测定漆酶活性； b:斑玉蕈与凤尾菇原生质体的制备及融合(1) 斑玉蕈与凤尾燕菌丝体的培养和原生质体的制备；(2) 灭活的凤尾菇原生质体与具有活性的斑玉蕈原生质体在融合剂的诱导下进行融合取lmL制备好的凤尾菇原生质体于55'C水浴灭活处理45 50min，然后加入lmL具有活性 的斑玉蕈原生质体和2 mL融合剂于32。C水浴温育25 30 min;CaCI2. H2〇融合剂的制备为聚乙二醇(PEG-4000) 25% (w/v) ; 50 mmol/L;甘露醇O. 6mol/L;用水配制；pH 8.0， 121。C灭菌20min; (3)融合子的再生培养及初步筛选吸取经b步骤(2)培养的斑玉蕈和凤尾菇的融合原生质体IOO yL，在含有再生培养基 的平板上涂布，于25。C恒温培养5 7天，然后将形成的单菌落转接至RB-PM平板上于25。C恒 温培养，具有漆酶活性的融合菌株会使RB-PM平板形成赤黄色，反之RB-PM平板不会变色， 将变色明显的融合菌株转试管斜面保存，再生培养基蔗糖0.4mol/L，发干酵母粉O. 5wt%，蛋白胨0.05 wt%，琼脂下层用2 wt%，上层用0.3 wt%，其余为水，121°C灭菌20 min;RB亮蓝溶液RB亮蓝加水配制成5mg/ml的溶液，121。C灭菌20 min，在倒平板时与PM 培养基混匀终浓度为O. 05 wt %;根据以上步骤建立斑玉蕈中的漆酶转化体系。
5.根据权利要求4所述的斑玉蕈育种中漆酶转化体系的建立方法，其 特征在于斑玉蕈通过筛选鉴定获得具有漆酶活性、生长速度快、生长周期短同时又具有斑 玉蕈优良性状的融合菌株。
6.根据权利要求5所述的斑玉蕈育种中漆酶转化体系的建立方法，其 特征在于融合菌株的鉴定和遗传稳定性分析的具体步骤包括(1)通过RB-PM亮蓝平板检测法对具有漆酶活性的融合菌株进行鉴定，具有漆酶活性 的融合菌株会使RB-PM平板变为赤黄色而不具有漆酶活性的融合菌株在RB-PM上不变色，据 此性状的差异在初筛中能够快速筛选出具有漆酶活性的融合菌株；(2 )采用ABTS法测定融合菌株中漆酶的活性(3) 通过设计引物和PC財广增鉴定融合菌株中是否含有漆酶基因 根据真菌平菇漆酶基因序列设计引物、进行PC財广增、电泳分析，以此鉴定融合菌株中是否含有漆酶基因；(4) 采用上述方法对继代培养的融合菌株进行漆酶活性分析，以测定漆酶基因能否稳 定遗传；将筛选鉴定的具有漆酶活性的融合菌株进行出菇实验，并对菇体进行组织分离培养； 然后采用RB-PDA平板法，ABTS漆酶活性测定及漆酶基因检测法对融合菌株下一代进行鉴定。
全文摘要
本发明提供一种斑玉蕈及其育种中漆酶转化体系的建立方法，属于斑玉蕈技术领域。要解决现有技术中的斑玉蕈不具有漆酶活性、生长速度较慢、生产周期较长，抗菌弱的问题，本发明的斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)新菌株金山1号，具有漆酶活性，已经于2009年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.3120；本发明采用具有漆酶活性的凤尾菇与斑玉蕈进行原生质体融合，建立斑玉蕈中的漆酶转化体系。本发明的方法培养的斑玉蕈新菌株具有漆酶活性高、生长速度快、生产周期短等优异性状。
文档编号A01H15/00GK101642054SQ20091030660
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月4日 优先权日2009年9月4日
发明者刘建忠, 孙淑静, 芳 熊, 胡开辉, 陈明祥, 饶榆平 申请人:福建农林大学