专利名称：西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点荧光自动化检测方法
西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点荧光自动化检测方法技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AQ致病位点荧光标记引物PCR检测方法。
背景技术：
家畜遗传缺陷多呈现隐性遗传模式的原因可能与家畜的生产方式不无关系， 尤其是奶牛。人工授精(Artificial Insemination, Al)及精液低温冻存技术(Semen Cryopreservation Techniques)在奶牛生产繁育中的应用，为奶牛的人工授精育种体系 (Al breeding system)的建立奠定了坚实基础。公牛因AI技术可承担更多母畜配种任务， 因而可以被广泛应用于群体当中，获得大量后代，使得高产的基因在群体中迅速传播。精液低温保存技术使优秀种用公牛不受时间和地域限制，实现全球范围内遗传物质的交流(张沅，2001)。经严格遗传评定的验证公牛(Tested Bulls)在奶牛遗传改良中发挥巨大的推动作用。
人工授精技术的广泛应用使全世界种质资源交换日益频繁。对种公牛的高强度选择，使奶牛基因库缩小，群体平均近交系数大大增加。有研究表明，美国荷斯坦牛的群体近交系数以每年0. 的速度持续增长，2004年出生的母牛平均群体近交系数高达5. 0% (Hansen等，200 。近交导致群体有效大小减小，一些不利基因的纯和，尤其是隐性基因控制的遗传缺陷，由于携带者表现正常，不易通过常规临床检测方法检出，致病基因“潜伏”在群体中很难被剔除。只有当群体中隐性突变基因频率达到一定程度时，临床阳性的个体大量出现，带来不利影响和经济损失。如荷斯坦牛的Weaver综合征(单雪松等，2006)、白细胞粘附缺陷病(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)(孙艺等，2006)、脊椎畸形综合征(Complex Vertebral Malformation, CVM) (Chu 等，2008)等。因而，寻找隐性缺陷病的致病突变，对致病突变建立准确快速的分子检测方法，注重对有害基因的识别与淘汰是奶牛育种工作的重要任务之一。
综上所述，动物遗传缺陷的致病基因研究是遗传学的重要组成部分。在家畜育种工作中，建立快速有效的动物遗传缺陷致病位点的分子检测方法，对种用动物、进口的遗传种质、甚至某些发病群体全群进行致病位点检测，对携带致病基因的个体进行标记或淘汰， 降低遗传缺陷在动物群体中的传播与蔓延带来的经济损失。
自1975年，Rieck和khade首次报道了德系西门塔尔牛群体中出现的一种新的犊牛先天畸形，并定名为牛蜘蛛腿综合征(AS)。Buitkamp等Q008)年报道了自2004 年-2007年，绝迹三十多年的AS病例又在西门塔尔牛中重新出现，并且相继报道了大量的病例；系谱分析及后期测交试验证实了该病在德系西门塔尔牛群体中是属于常染色体单位点控制的隐性遗传缺陷。Buitkamp等Q009)将德系西门塔尔牛AS致病基因定位于BTA23。 Buitkamp等QOl 1)年对AS的精细定位及群体检测证实M0CS1基因c. 1224_1225delCA突变为西门塔尔牛AS的致病突变。但是，到目前为止，还没有一种适合商业操作的西门塔尔牛AS致病位点快速准确的检测方法。本发明需要解决的问题既根据目前的研究进展，设计一种快速准备，成本低廉的检测方法，以进行商业化试剂盒的生产。
商业化遗传病检测试剂盒的生产对我国的畜牧业蓬勃发展意义重大。随着中国奶牛杂交生产以及肉牛改良工作的开展，大量从国外，包括德国在内，引进西门塔尔优秀种公牛和公牛冻精，其中存在AS携带者。为了防患于未然，杜绝AS疾病给我国牛业带来不必要的损失，早发现、早淘汰是最好的途径。通过研究建立快速准确的携带者分子检测平台，完善我国牛遗传缺陷数据库，同时结合系谱分析，对引进西门塔尔牛以及现有群体中携带者的后代进行筛查，及时淘汰携带者，对我国奶业和肉牛业的发展都具有非常重要的意义。
荧光自动化检测分析方法其基本原理就是，通过在引物上标记荧光发色基团，经 PCR扩增后，再采用毛细管电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行产物分离，利用基于荧光扫描技术的遗传分析仪，结合分子量标准自动计算PCR产物长度大小，是一种常见的用于检测长度多态的技术手段。此法通过直接判定扩增片段的长度，能够实现高通量和自动化的分型。另外，该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能与其他位点检测进行组合检测实现高通量分型、自动化程度高、无污染性、具实时性、快捷性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS) 致病位点荧光检测自动化分析方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点荧光自动化检测分析PCR检测用引物，其核苷酸序列如下
5，-CTGAGTCTCCTCTTCTGTTTTCA-3，，
5 ’ -GTTGGCATCTGAGTCCAGGT-3’。
上述引物配合使用的荧光染料，其荧光染料优选为FAM、HEX或ΤΕΤ。
本发明还提供含有上述引物的检测试剂盒，其还包括DNA裂解液、荧光引物PCR 反应液、荧光电泳标准品、阴性模板和/或阳性模板。
本发明进一步提供利用上述引物或试剂盒检测西门塔尔牛蜘蛛腿综合征的方法， 所用引物为权利要求1所述引物，或所用试剂盒为权利要求2或3所述的试剂盒，其包括以下步骤
1)目的基因的扩增
以西门塔尔牛组织细胞DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩增产物；
2)基因分型
对上述PCR产物利用荧光毛细管电泳或者荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。
所述PCR扩增条件优选为95°C预变性5min，然后95°C变性30s、6(TC退火30s、 72°C延伸30s，共35个循环，72°C最终延伸IOmin。
所述引物用量为1. 5 μ L，引物的终浓度为10 μ Μ。
本发明还提供了上述所述方法在牛抗病育种中的应用。
该检测方法是在证实MOCSl基因的c. dell224_1225CA位点为西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AQ致病位点的基础上，结合荧光引物PCR，设计的一种快速准确遗传致病基因检测的方法。对西门塔尔牛AS致病突变位点准确有效的分子检测方法的建立，目的在于筛选出我国牛群中的突变携带者个体，进行不利基因的筛查和剔除，对我国进口的西门塔尔牛种用动物及遗传物质(冷冻精液，胚胎等)进行检测，防止AS在我国牛群中的传播，对我国西门塔尔牛及相关杂交品种的遗传改良提供保障。
本发明利用荧光自动化检测分析技术，对西门塔尔牛AS致病位点进行分型的试剂盒结果稳定，成本低，准确可靠，可实现高通量检测，对西门塔尔牛AS致病位点可以进行准确的分型，及时发现携带者个体。
图1为本发明牛冻精基因组琼脂糖检测结果；
图2为本发明牛血液基因组琼脂糖检测结果；
图3为本发明牛耳组织基因组琼脂糖检测结果；
图4为本发明多重PCR反应程序；
图5为本发明MOCSl基因c. dell224_1225CA突变PCR产物2%凝胶检测；
图6为本发明ROMEL及其两个后代测序结果；
图7为本发明MOCSl基因c. dell224_1225CA位点荧光引物PCR产物毛细管电泳检测判型结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1试验材料的准备和DNA的提取
本研究采用的试验材料来自两个部分4头德系西门塔尔公牛家系中的与配母牛和杂交后代抗凝血样及耳组织样；11个牛品种或品系的公牛管制冻精。
4个德系西门塔尔公牛家系(表1)，包括80头与配母牛及106头后代，分别来自中国鞍山恒利奶牛场(鞍山恒利)和内蒙古海拉尔市谢尔塔拉三河牛种牛场(海拉尔谢尔塔拉)。4个家系中，母牛品种为中国荷斯坦牛和中国三河牛，后代均为杂交牛(荷斯坦X德系西门塔尔杂交牛、三河牛X德系西门塔尔杂交牛)。4头德系西门塔尔牛分别为R0MEL、 BOSSAG, RIFURT, HIRMER(德国西门塔尔牛系谱查询网站http://www. zar. at/article/ archive/18981)。ROMEL为已知AS致病基因携带者，其他3头公牛均为不携带AS致病基因的正常个体。
表1 4头德系西门塔尔公牛家系信息
权利要求
1.一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点荧光自动化检测分析PCR用引物，其核苷酸序列如下5， -CTGAGTCTCCTCTTCTGTTTTCA-3，， 5’ -GTTGGCATCTGAGTCCAGGT-3，。
2.如权利要求1所述引物，其特征在于，还包括与引物配合使用的荧光染料。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述染料为FAM、HEX或ΤΕΤ。
4.含权利要求1 3任意一项所述引物的检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括DNA裂解液、荧光引物PCR反应液、荧光电泳标准品、阴性模板和/或阳性模板。
6.一种检测西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点方法，其特征在于，所用引物为权利要求1所述引物，或所用试剂盒为权利要求2或3所述的试剂盒，其具体包括以下步骤包括以下步骤1)目的基因的扩增以西门塔尔牛组织细胞DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩增产物；2)基因分型对上述PCR产物利用荧光毛细管电泳或者荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为95°C预变性5min，然后 95°C变性30s、60°C退火30s、72°C延伸30s，共；35个循环，72°C最终延伸IOmin。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物用量为1.5 μ L，引物的终浓度为 10 μ Μ。
9.权利要求6 8任意一项所述方法在牛抗病育种中的应用。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述牛为西门塔尔牛。
全文摘要
本发明涉及一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点荧光自动化检测分析方法，PCR扩增用引物，其核苷酸序列如下5’-CTGAGTCTCCTCTTCTGTTTTCA-3’，5’-GTTGGCATCTGAGTCCAGGT-3’。本发明利用荧光标记引物PCR扩增和电泳分型技术，对西门塔尔牛AS致病位点进行分型的试剂盒结果稳定，成本低，准确可靠，对西门塔尔牛AS致病位点可以进行准确的分型。
文档编号C12N15/11GK102533994SQ20111045793
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者俞英, 初芹, 孙东晓, 张毅, 张沅, 张胜利, 焦士会, 王雅春 申请人:中国农业大学