一种大菱鲆家系育种值评估方法
【专利摘要】一种大菱鲆家系育种值评估方法，本发明属于海水动物遗传育种领域，它包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理；相比于依靠物理系谱评估育种值的方法，本方法能提高个体间亲缘系数准确度，在育种值预测及其准确度方面发挥优势。以此更好的指导选育工作。
【专利说明】一种大菱鲆家系育种值评估方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海水动物遗传育种领域，具体地涉及一种可实现对大菱鲆家系进行育种值评估的方法
【背景技术】
[0002]大菱鲆(Scophthalmus maxi mu s L.)是原产于欧洲的底栖海水鱼类,具有生长迅速、耐低温、风味独特、性格温顺、宜于集约化养殖等优点，是欧洲等地的优良海水养殖品种之一。自1999年突破生产性育苗技术以来，大菱鲆养殖产业在我国得到迅速发展，已经成为我国北方沿海重要的鱼类养殖品种。由于我国不是大菱鲆的原产地，养殖生产中长期依赖于欧洲大菱鲆原产国提供、补充种源。同时，由于累代养殖和近亲交配比较严重，国内大菱鲆产业普遍出现了种质退化现象。主要表现为生长速度降低、白化率增高、出苗率降低等现象。良种选育已经成为我国大菱鲆养殖产业可持续发展的重要课题之一。基于完整物理系谱记录的良种选育模式是开展菱鲆良种选育的重要途径之一。完整、准确的系谱信息不仅可以有效指导亲本选留，避免近交衰退；同时利用系谱信息推算出的个体亲缘系数也是用来进行遗传参数评估的重要数据。但是由于大菱鲆性成熟周期长(2-3年)，目前绝大多数良种场亲鱼保有数量有限，更不用说完整的物理系谱记录信息；同时，大菱鲆属于引进物种，群体的遗传背景不清，这也为开展大菱鲆良种选育造成了很大的困难。虽然利用分子标记可以实现系谱重建，但是这种重建是很有限的，比如只能重建到父母本一代，只能推算出父母本的基因型组合，而无法推算出具体的父本、母本的基因型。良种选育过程中，最重要的遗传参数评估就是个体/家系育种值的评估。因此，目前迫切需要一种无需详细的物理系谱记录就能够对家系进行育种值评估的技术。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术 问题是提供一种大菱鲆家系育种值评估方法，以解决利用背景不清、物理系谱记录不全、或 者引进大菱鲆群体进行良种选育时，无法利用系谱信息推算出的个体亲缘系数从而进行遗传参数评估的问题。
[0004]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0005]一种大菱鲆家系育种值评估方法，包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理；
[0006]所述的家系个体数据采集:对于所构建家系的大菱鲆，在4月龄时，每个家系挑选体重排名前60的个体作为核心选育家系，测量体重数据，取其平均值作为家系核心选育家系平均值，同时从每个家系留种个体取20尾个体，提取DNA ；
[0007]所述的微卫星位点基因分型:利用大菱鲆已经公布的12个SSR位点进行SSR-PCR扩增，12对引物正相序列5 ‘端分别标记6-FAM，HEX及ROX荧光标记；利用全自动基因分析仪进行12个位点的微卫星位点基 因分型，最后利用GeneMapper3.7 (Applied Biosystems)准确读取并记录每一个体在每一个位点上的等位基因峰值；[0008]所述的数据处理:
[0009]SSR位点数据按照Coancestryl.0.1.2软件的要求输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关系数(rXY)；
[0010]根据分型个体两两之间的分子遗传相关系数（rXY)计算平均分子遗传相关系数(AMR)，来表示所有个体(包括未分型个体)间的遗传相关；
[0011]再利用R3.0.2软件将得到的结果转化为分子亲缘矩阵(Numerator Matrix)的形式；利用R3.0.2软件中corpcor程序包的make, positive, definite函数将上述矩阵进行正定(Bending),正定后再用is.positive, definite函数验证；
[0012]利用ASReml3.0软件根据线性混合模型估计方差组分及育种值。
[0013]本发明与现有技术相比的有益效果:相比于依靠物理系谱评估育种值的方法，本方法能提高个体间亲缘系数准确度，在育种值预测及其准确度方面发挥优势。在育种过程中，由管理及其他不可避免的失误造成的系谱潜在错误是经常发生的，尤其对大菱鲆这种生殖力较高的鱼类群体。因此，由系谱推断的分子亲缘系数往往是不够准确的。所以需要从分子水平上去估算个体间的遗传相关，以此来获得准确的育种值预测值，以此更好的指导选育工作。【具体实施方式】
[0014]实施例
[0015]下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0016]一种大菱鲆家系育种值评估方法，包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理；具体步骤如下:
[0017]—.大菱鲆家系构建
[0018]2013年初(1月份)对候选大菱鲆亲鱼通过控温控光进行生殖调控。4月末水温适合时，从候选亲鱼中挑选性腺发育成熟，体型完整，体色正常，摄食积极，无伤残健康活泼，体重2千克以上的个体进行人工受精，构建大菱鲆家系。具体为:受精卵放置在80X60X60cm孵化网箱内充气孵化，海水温度维持在14~15°C。孵化3天后吸取上浮卵并按照20ml/m2 (350粒/ml)的标准，由孵化池移入提前调好水温、盐度、PH及溶解氧的圆形玻璃钢缸中(0.5m2，容积0.5m3)微充气，静水孵化至出苗，各家系均单独培育。此后培育过程参照大菱鲆家系常规养殖方法，共培育大菱鲆家系19个。
[0019]二.家系个体数据采集与DNA提取:
[0020]待家系个体生长至4月龄时，每个家系挑选体重排名前60的个体作为核心选育家系，测量体重数据，取其平均值作为家系核心选育家系，1-19号家系体重平均值(g)分别为 8.11,5.71,6.07,7.11,5.15,5.48,6.35,5.73,5.39,4.79,4.39,5.64,4.92,5.66,4.97，
4.97,5.00,6.23,6.32。同时从每个家系留种个体随机选取20尾个体，取其鳍条末端组织(类似于取动物的毛发组织，不会对个体造成任何伤害)备个体基因组DNA提取。参照常规方法提取基因组DNA-75°C低温保存。
[0021]三.微卫星位点基因分型:
[0022]PCR及产物检测:选用大菱鲆已经公布的12个SSR位点进行SSR-PCR扩增，位点名称分别为 YSKr271, YSKr262, YSKrl08, YSKr231, YSKr80, YSKr244, YSKrl97, YSKrl 15, YSKr22I, YSKr124, YSKr218, YSKr259 (表 I), 12 对引物正相序列 5 ‘端分别标记 6-FAM,HEX 及 ROX荧光标记。PCR反应体系包括:总体积25 μ 1，其中基因组DNA2 μ I (50ng/ μ I)，TaqDNA聚合酶 0.2 μ I (5U/ μ I), 10XPCR Buffer2.5 μ l,Mg2+2y I (2.5mmol/L)，dNTP2 μ 1(2.5mmol/L),引物各 0.5μ l(10ymol/L)，ddH2015.3μ I。PCR 扩增条件为:95°C预变性 5min 后进入25个PCR循环:95°C变性40s，退火Imin (各引物的退火温度见表1)，72°C延伸lmin，最后于72°C延伸5min，4°C保存。
[0023]表1微卫星引物的基本特征
[0024]
【权利要求】
1.一种大菱鲆家系育种值评估方法，其特征在于所述方法包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理； 所述的家系个体数据采集:对于所构建家系的大菱鲆，在4月龄时，每个家系挑选体重排名前60的个体作为核心选育家系，测量体重数据，取其平均值作为家系核心选育家系平均值，同时提取每个家系留种个体的DNA ； 所述的微卫星位点基因分型:利用大菱鲆已经公布的12个SSR位点进行SSR-PCR扩增，12对引物正相序列5 ‘端分别标记6-FAM，HEX及ROX荧光标记；利用全自动基因分析仪进行12个位点的微卫星位点基因分型，最后利用GeneMapperf.7准确读取并记录每一个体在每一个位点上的等位基因峰值； 所述的数据处理: SSR位点数据按照Coancestryl.0.1.2软件的要求输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关系数； 根据分型个体两两之间的分子遗传相关计算平均分子遗传相关系数，来表示所有个体间的遗传相关系数； 再利用R3.0.2软件将得到的结果转化为分子亲缘矩阵的形式；利用R3.0.2软件中corpcor程序包的make, positive, definite函数将上述矩阵进行正定，正定后再用is.positive, definite 函数验证； 利用ASReml3.0软件根据线性混合模型估计方差组分及育种值。
2.根据权利要求1所述的一种大菱鲆家系育种值评估方法，其特征在于所述的家系个体数据采集步骤，提取每个家系20个个体的DNA，所述的20个个体为随机选取。
【文档编号】C12Q1/68GK103882144SQ201410148388
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】王伟继, 官健涛, 胡玉龙, 栾生, 孔杰 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所