一种海洋环境放线菌群落检测基因芯片及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种海洋环境放线菌群落检测基因芯片，包括有酸微菌科探针、Iamiaceae菌科探针、分枝杆菌科探针、纤维素单胞菌科探针、间孢囊菌科探针、微杆菌科探针、微球菌科探针、类诺卡氏菌科探针、丙酸杆菌科探针、腈基降解菌科探针及杂交阳性对照质控探针、杂交阴性对照质控探针和表面化学质控探针。本发明的海洋环境放线菌群落检测基因芯片可对海水放线菌群落进行快速、准确、高通量的鉴定，为海洋环境放线菌群落的监测提供了有力的技术支持，为建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系奠定了坚实的基础。
【专利说明】—种海洋环境放线菌群落检测基因芯片及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子检测【技术领域】，具体涉及一种海洋环境放线菌群落检测基因芯片及应用，本发明的芯片能识别海洋环境中不同科的放线菌。
【背景技术】
[0002]近岸海域作为各种海洋功能区的集中地带，是最为脆弱的生态区之一，也是海洋环境质量评价的重要区域。目前海洋环境质量的监测方法大致可以分为两大类:化学监测和生物监测。前者着重监测海洋环境各介质中污染物的存在形式和浓度。后者主要监测海洋环境中浮游生物、底栖生物、海草、红树植物、珊瑚等生物种类组成和数量分布。细菌作为一类多样性最高的生命形式，在地球化学循环(碳循环，氮循环，硫循环，磷循环和金属循环等)中承担着重要的生态功能。细菌复杂的群落结构、功能、相互作用和动态变化对海洋生态功能的维持有着重要意义。因此，增加对海洋环境各个细菌种类组成和数量分布的监测，对建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系来说十分必要。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测海洋环境放线菌群落的基因芯片及应用，即可平行、快速、高通量的检测海洋环境放线菌群落，使基因芯片技术更好的应用于海洋环境监测，从而弥补现有技术的不足。
[0004]本发明的基因芯片，包括有芯片载体，以及固定在芯片载体上的，用于检测海水中酸微菌科、Iamiaceae菌科、分枝杆菌科、纤维素单胞菌科、间孢囊菌科、微杆菌科、微球菌科、类诺卡氏菌科、丙酸杆菌科和臆基降解菌科的探针；
[0005]其中用于检测酸微菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ；
[0006]用于检测Iamiaceae菌科微生物的核酸探针,其核苷酸序列为SEQ ID N0:4 ；
[0007]用于检测分枝杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7 ；
[0008]用于检测纤维素单胞菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 10 ；
[0009]用于检测间孢囊菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 13 ；
[0010]用于检测微杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 16 ；
[0011]用于检测微球菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 19 ；
[0012]用于检测类诺卡氏菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:22 ；
[0013]用于检测丙酸杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:25 ；
[0014]用于检测腈基降解菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:28 ；
[0015]其中，用于检测酸微菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQIDNO:2-3中的任一种或几种；
[0016]用于检测Iamiaceae菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO:5-6中的任种或几种；
[0017]用于检测分枝杆菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO:8-9中的任一种或几种；
[0018]用于检测纤维素单胞菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO: 11-12中的任一种或几种；
[0019]用于检测间孢囊菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO: 14-15中的任一种或几种；
[0020]用于检测微杆菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO: 17-18中的任一种或几种；
[0021]用于检测微球菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO:20-21中的任一种或几种；
[0022]用于检测类诺卡氏菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO:23-24中的任一种或几种；
[0023]用于检测丙酸杆菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO:26-27中的任一种或几种；
[0024]用于检测腈基降解菌科微生物的核酸探针，还可以包括核苷酸序列为SEQ IDNO:29-30中的任一种或几种；
[0025]在本发明的基因芯片上还固定有杂交阳性对照质控探针、杂交阴性对照质控探针、表面化学质控探针中的任一种或几种，`
[0026]其中杂交阳性对照质控探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:31 ；
[0027]杂交阴性对照质控探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:32 ；
[0028]表面化学质控探针是一条用HEX染料标记的40个T的寡核苷酸序列。这些荧光探针点的位置可作为芯片上DNA微阵列坐标，在芯片检测过程中起到定位探针位置的作用。
[0029]本发明芯片所使用的探针可以快速、高通量地对海水中的放线菌群落进行检测，最大可以检测10个科的放线菌信息，从而为海洋环境细菌群落的监测提供了有力的技术支持，为建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系奠定了坚实的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1:本发明基因芯片的探针布局示意图(15X14方阵)。
[0031]其中:ID1_3是酸微菌科，ID4-6是Iamiaceae菌科；ID7_9是分枝杆菌科；ID10_12是纤维素单胞菌科；ID13-15是间孢囊菌科；ID16-18是微杆菌科；ID19_21是微球菌科；ID22-24是类诺卡氏菌科；ID25-27是丙酸杆菌科；ID28_30是腈基降解菌科；ID31是杂交阳性对照；ID32是杂交阴性对照；ID33是表面化学质控；NC_W是点样质控纯水。
[0032]图2:本发明基因芯片的特异性检测。
[0033]其中:1是酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.与本发明基因芯片的杂交结果；2是Iamiaceae菌科代表克隆Uncultured Iamiaceae与本发明基因芯片的杂交结果；3是分枝杆菌科代表菌株Mycobacterium smegmatis与本发明基因芯片的杂交结果；4是纤维素单胞菌科代表克隆Uncultured Cellulomonadaceae与本发明基因芯片的杂交结果；5是间孢囊菌科代表菌株Knoellia subterranea与本发明基因芯片的杂交结果；6是微杆菌科代表菌株Microbacterium Iacticum与本发明基因芯片的杂交结果；7是微球菌科代表菌株Arthrobacter oxydans与本发明基因芯片的杂交结果；8是类诺卡氏菌科代表菌株Nocardioides aestuarii与本发明基因芯片的杂交结果；9是丙酸杆菌科代表菌株Propionibacterium freudenreichi与本发明基因芯片的杂交结果；10是腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus与本发明基因芯片的杂交结果。
[0034]图3:本发明基因芯片的灵敏性检测；
[0035]其中:1-1是酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.原浓度DNA (8.4ng/y L)与本发明基因芯片的杂交结果；1-2是酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.2倍稀释DNA(4.2ng/ yL)与本发明基因芯片的杂交结果；1-3是酸微菌科代表菌株I Iumatobactersp.3倍稀释DNA (2.lng/yL)与本发明基因芯片的杂交结果；1_4是酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.4倍稀释DNA (1.05ng/ μ L)与本发明基因芯片的杂交结果；1_5是酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.5倍稀释DNA (0.525ng/μ L)与本发明基因芯片的杂交结果；10-1是腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus原浓度DNA (10.1ng/UL)与本发明基因芯片的杂交结果；10-2是腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptoralkaliphilus2倍稀释DNA (5.05ng/yL)与本发明基因芯片的杂交结果；10_3是腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus3倍稀释DNA (2.525ng/μ L)与本发明基因芯片的杂交结果；10-4是腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus4倍稀释DNA (1.2625ng/yL)与本发明基因芯片的杂交结果；10_5是腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus5倍稀释DNA (0.63125ng/μ L)与本发明基因芯片的杂交结果。
【具体实施方式】
[0036]下面结合实施例对本发明进行详细的描述，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0037]实施例1:放线菌群落检测基因芯片的探针设计
[0038]采用高通量测序技术和克隆文库技术获得东海海水中放线菌群落信息。根据放线菌群落16S rRNA基因序列信息，利用ARB软件对东海海水中10个主要的放线菌科(酸微菌科、Iamiaceae菌科、分枝杆菌科、纤维素单胞菌科、间孢囊菌科、微杆菌科、微球菌科、类诺卡氏菌科、丙酸杆菌科和腈基降解菌科)进行探针设计，并在BLAST中进行验证，获得用来制备基因芯片的探针序列(表1)。从灵敏度和检测特异性的角度出发，对上述可能作为探针的序列进行筛选，最终确定了如下的探针序列:
[0039]用于检测酸微菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1-3 ；
[0040]用于检测Iamiaceae菌科微生物的核酸探针,其核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6 ；
[0041]用于检测分枝杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7-9 ；
[0042]用于检测纤维素单胞菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 10-12 ；
[0043]用于检测间孢囊菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 13-15 ；
[0044]用于检测微杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 16-18 ；
[0045]用于检测微球菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 19-21 ；
[0046]用于检测类诺卡氏菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:22-24 ；
[0047]用于检测丙酸杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:25-27 ；[0048]用于检测腈基降解菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:28-30 ；
[0049]还有点制在芯片上的:
[0050]杂交阳性对照质控探针，采用的是细菌16S rRNA基因的保守性片段。其主要功能是与PCR扩增过程中扩增出来的基于16S rRNA基因的标记物杂交，从而对扩增、标记和杂交等检测过程的正确性进行有效控制，其核苷酸序列为SEQ ID NO:31 ；
[0051]杂交阴性对照质控探针，采用的是一段40个T的寡核苷酸序列。该探针不会与任何的扩增和标记产物结合，因此该探针可从反面监控杂交过程的可靠性，其核苷酸序列为SEQ ID NO:32 ；
[0052]表面化学质控是一条用HEX染料标记的40个T的寡核苷酸序列，可监测点样过程的可靠性，另外荧光探针点的位置可作为芯片上DNA微阵列坐标，在芯片检测过程中起到定位探针位置的作用。
[0053]实施例2:本发明的海洋放线菌群落检测基因芯片的特异性检测
[0054]从放线菌群落基因芯片所包含的10个科中分别选择一个代表性菌株或克隆(酸微菌科代表菌株 Ilumatobacter sp.、Iamiaceae 菌科代表克隆 Uncultured Iamiaceae>分枝杆菌科代表菌株Mycobacterium smegmatis、纤维素单胞菌科代表克隆UnculturedCe I Iulomonadaceae >间抱囊菌科代表菌株Knoellia subterranea、微杆菌科代表菌株Microbacterium lacticum、微球菌科代表菌株Arthrobacter oxydans、类诺卡氏菌科代表菌株Nocardioides aestuari1、丙酸杆菌科代表菌株Propionibacterium freudenreichi>腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus),对海洋放线菌群落检测基因芯片的特异性进行检测。
[0055]①DNA的提取:`用细菌基因组提取试剂盒分别提取8个菌株的DNA ;用质粒提取试剂盒分别提取2个克隆的DNA。
[0056]②16S rRNA基因的扩增:利用16S rRNA基因的通用引物27F(AGAGTTTGATCATGGCTCAG)和 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)分别对 8 个菌株的 16S rRNA基因进行线性扩增。利用克隆载体pEASY-ΤΙ通用引物M13F (GTA AAA CGA CGG CCA GT)和M13R (GTC CTT TGT CGA TAC TG)分别对2个克隆的16S rRNA基因进行线性扩增。扩增程序为 940C 5min，25 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s), 72°C IOmin0
[0057]③荧光标记:利用荧光标记的随机引物(Cy3_NNN NNN NNN)和Klenow酶对16SrRNA基因扩增产物进行标记。37°C 1.5h,70°C IOmin0
[0058]④杂交:将15 μ L荧光标记产物和5 μ L杂交液混合与放线菌群落基因芯片42°C杂交2h。芯片清洗，干燥后用扫描仪检测结果。
[0059]结果显不(图2),酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.、Iamiaceae菌科代表克隆 Uncultured Iamiaceae 和纤维素单胞菌科代表克隆 Uncultured Cellulomonadaceae分别只与本发明的基因芯片上相对应科的探针杂交，不与其他探针杂交，说明本基因芯片上的酸微菌科、Iamiaceae菌科和纤维素单胞菌科探针都具有良好的特异性。分枝杆菌科代表菌株Mycobacterium smegmatis、间抱囊菌科代表菌株Knoellia subterranea、微杆菌科代表菌株Microbacterium lacticum、微球菌科代表菌株Arthrobacter oxydans、类诺卡氏菌科代表菌株Nocardioides aestuari1、丙酸杆菌科代表菌株Propionibacteriumfreudenreich1、臆基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus与本发明的基因芯片上相对应科的探针杂交，也与一些非对应科的探针杂交。但是这些菌株与非对应科探针的杂交信号明显弱于与对应科探针的杂交信号。综上说明本发明的海洋放线菌群落检测基因芯片具有较好的特异性。
[0060]实施例3:本发明的海洋放线菌群落基因芯片的敏感性检测
[0061]分别提取酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.和腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus的DNA,并进行梯度稀释。分别对梯度稀释的菌株DNA进行线性扩增，并用此对海洋放线菌群落检测基因芯片的敏感性进行检测。
[0062]具体方法如实施例2，结果显示(图3)，本发明的海洋放线菌群落检测基因芯片最低可以检测到1.05ng/ μ L的酸微菌科代表菌株Ilumatobacter sp.,也可以最低检测到
1.2625ng/ μ L的腈基降解菌科代表菌株Nitriliruptor alkaliphilus。说明本发明的海洋放线菌群落检测基因芯片对微量的菌就可杂交出阳性结果，灵敏度很高，在实际操作中使用本发明的芯片检测的时候不会出现假阴性。
[0063]实施例4:利用芯片检测海水样品中的放线菌群落
[0064]分别将海水样品102和602与本发明的海洋放线菌群落检测基因芯片进行杂交，具体方法如实施例2。并与高通量测序的结果进行比较。结果如表1所示。
[0065]表1:海水样品中的放线菌群落的检测结果
[0066]
【权利要求】
1.一种基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片包含有芯片载体，以及固定在芯片载体上的，用于检测海水中酸微菌科、Iamiaceae菌科、分枝杆菌科、纤维素单胞菌科、间孢囊菌科、微杆菌科、微球菌科、类诺卡氏菌科、丙酸杆菌科和臆基降解菌科的探针； 其中用于检测酸微菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1; 用于检测Iamiaceae菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4 ； 用于检测分枝杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7； 用于检测纤维素单胞菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 10； 用于检测间孢囊菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 13； 用于检测微杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 16 ； 用于检测微球菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 19 ； 用于检测类诺卡氏菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:22； 用于检测丙酸杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:25 ； 用于检测腈基降解菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:28。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的用于检测酸微菌科微生物的核酸探针，包括有核苷酸序列为SEQ ID NO:2-3中的任一种或几种； 用于检测Iamiaceae菌科微 生物的核酸探针，包括核苷酸序列为SEQ ID NO:5_6中的任一种或几种。
3.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的用于检测分枝杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一种或几种； 用于检测纤维素单胞菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 11-12中的任一种或几种。
4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的用于检测间孢囊菌科微生物的核酸探针，核苷酸序列为SEQ ID NO: 14-15中的任一种或几种； 用于检测微杆菌科微生物的核酸探针，核苷酸序列为SEQ ID NO: 17-18任一种或几种； 用于检测微球菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:20-21中的任一种或几种。
5.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的用于检测类诺卡氏菌科微生物的核酸探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:23-24中的任一种或几种； 用于检测丙酸杆菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:26-27中的任一种或几种。
6.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的用于检测腈基降解菌科微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:29-30中的任一种或几种。
7.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的芯片载体上还固定有杂交阳性对照质控探针、杂交阴性对照质控探针、表面化学质控探针中的任一种或几种。
8.如权利要求7所述的基因芯片，其特征在于，所述的杂交阳性对照质控探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:31。
9.如权利要求7所述的基因芯片，其特征在于，所述的杂交阴性对照质控探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:32。
10.如权利要求7所述的基因芯片，其特征在于，所述的表面化学质控探针是一条用HEX染料标 记的40个T的寡核苷酸序列。
【文档编号】C12Q1/04GK103866044SQ201410148433
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】王敬敬, 黄志勇, 梁亚杰, 韩一凡, 王兴彪, 张晓霞 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所