利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法
【专利摘要】利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，涉及生物絮凝剂。将地衣芽孢杆菌(Bacillus?licheniformis)转接于斜面培养基培养；将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养；将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。利用地衣芽孢杆菌一种培养条件下合成同时以多糖和γ-PGA为活性成分的生物絮凝剂，原料成本较低、发酵周期短、合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好；特别是多糖在酸性、中性条件下絮凝效果比较好，γ-PGA在中性和碱性环境下絮凝活性较高，合成同时以多糖和γ-PGA为活性成分的生物絮凝剂满足了较大的pH适用范围，工业应用潜力大。
【专利说明】利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物絮凝剂，尤其是涉及利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法。
【背景技术】
[0002]生物絮凝剂是具有絮凝活性的微生物次生代谢产物或化学改性天然有机高分子，是利用生物技术，通过培养微生物的方法得到的一类新型絮凝剂，其化学成份主要是糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和核酸等物质，分子量约为几十万以上(华中科技大学学报(城市科学版)2004, 6:23-25)。絮凝性微生物能使离散微粒包括菌体细胞自身之间互相粘附，并能使胶体脱稳，形成絮状沉淀而从反应体系中分离。
[0003]微生物的絮凝现象最早发现于酿酒工业中，法国Louis Pasteur于1876年发现了发酵后期的酵母菌Levure casseeuse具有絮凝能力。20世纪50年代，日本学者发现微生物培养液具有絮凝作用。1976年,J.Nakamura等人对能产生絮凝效果的微生物进行了专门研究，掀起了微生物絮凝剂的研究热潮(Agric Biol Chem，1976,40(2):377-383)。在水处理中，传统的化学絮凝剂不仅具有投加量多、产泥量大的特点，而且产生的化学污泥不易被生物降解，排放至水体中对人体健康和水环境生态都具有潜在的危害作用。因此，化学絮凝剂在应用范围和使用条件上受到了限制，前景不容乐观。生物絮凝剂不仅具有普通絮凝剂所具有的絮凝性能，还具有普通絮凝剂所不具备的用量少、絮凝效果好、絮体易于分离、易生物降解、无二次污染、对人类健康无害、适用范围广等优点。因此，生物絮凝剂的研制和应用已成为新型高效絮凝剂开发的热点和重点。
[0004]生物絮凝剂按化学组成分类可分成多肽或蛋白质、多糖、脂类和DNA等类型。其中目前比较常见的是多糖类以及多肽或蛋白质类。
[0005]目前已经鉴定的生物絮凝剂有很多种属于多糖类物质。Paecilomycessp.1_1产生的PF-1Ol絮凝剂则是由氨基半乳糖以α-1，4-糖苷键相连而成的粘多糖(Agriculturaland Biological Chemistry, 1985，49 (11): 3159-3164)。Rhizobium sp.产生的絮凝剂的主要组分是纤维素，常附着于产生菌细胞壁上，直接引起菌细胞的絮凝沉降(Applied Microbiology, 1975，30(1):123-131)。
[0006]Sorangium cellulosum NUST06 在培养基(m/v):淀粉 30g L-1,葡萄糖 2g L-1,K2HPO40.2%, CaCl20.01%, MgSO40.03%, FeCl20.001%, KNO30.3% 中，以 30。。，pH 为 7.5 的条件培养36h，多糖絮凝剂产量可达17.5g L_\占总产物的58.5%。其中葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸各单体所占比例分别为51.3%, 39.2%，19.5%。最高絮凝率可达99.5%(Letters inApplied Microbiology2002, 34: 178 - 181)。
[0007]Kazuki TOEDA 利用 Alcaligenes cupidus KT201 以培养基(m/v):鹿糖 2%,(NH4)2SO40.01%, CaCl2.2Η200.002%, MgSO4.7Η200.02%, NaCl20.01%, FeSO4.7Η200.001%,KH2PO40.16%和酵母提取物0.02%，在30°C条件下培养6~8天，产生的多糖絮凝剂中葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和乙酸各单体所占比例分别为42.57%，36.38%, 8.52%和10.3%。最高絮凝活性大约为 10.80D-1 (Agricultural and Biological Chemistry, 1991, 55 (11): 2793-2799)。
[0008]Bacillus sp.DP-152 以培养基(g L-1):葡萄糖 40，NH4NO3L O, K2HPO40.3，KH2PO40.3，MgSO4.7Η200.LMnSO4.4Η200.I，NaCl0.05，CaCO30.4，酵母提取物 0.1，大豆蛋白胨0.1和胰蛋白胨0.1，在30°C，pH为7.0条件下培养3天，产生的多糖中葡萄糖、甘露糖、半乳糖和海藻糖单体比例为8:4:2:1。最高絮凝活性大约为430D4 (Journal of Fermentationand Bioengineering, 1997, 84(2):108-112)。
[0009]S.B.Deng 等利用 Bacillus mucilaginosus 以培养基(g L-1):可溶性淀粉 1.5,K2HPO40.6，酵母提取物 0.02，MgSO4.7Η200.02，NaCl0.01，在 30°C，pH 为 8.0 的最适宜条件下培养72h，产生的生物絮凝剂MBFA9主要成分为多糖，其中糖醛酸、中性糖和氨基糖所占的比例分别为19.1%, 47.4%和2.7%。处理高岭土的最高絮凝率为99.6%(AppI MicrobiolBiotechnol, 2003, 60:588 - 593)。
[0010]Corynebacterium glutamicum CCTCC M201005 在培养基(L-1):鹿糖 17g,玉米浸泡液 5ml,尿素 0.45g, KH2PO40.lg, NaCl0.1g and MgS04.7Η200.Ig 中在 28 °C，pH 为
7.8的条件下培养48h，产生的生物絮凝剂REA-11主要由半乳糖醛酸组成(BiochemicalEngineering Journal, 2002, 11:137 - 148),絮凝活性可达 520U/mL(BioresourceTechnology2004, 94:99 - 105)。
[0011]H.Salehizadeh 利用 Bacillus sp.As-1Ol 以培养基(m/v):蛋白腺 0.5%,(NH4)2SO40.2%，酵母粉 0.1%，CaCl2.2Η200.07%, MgSO4.7Η200.02%, NaCl20.01%, K2HPO40.1%，葡萄糖0.1%和琼脂0.3%，在30°C条件下培养10~15h，产生的生物絮凝剂中83%的成分是多糖，其余为蛋白质。组成该多糖的单体分别为葡萄糖、半乳糖、甘露糖，糖醛酸，丙酮酸和乙酸。最高絮凝活性为270D' 100°C处理15分钟后，絮凝活性降低50%(BiochemicalEngineering Journal2000, 5:39 - 44)。
[0012]Aspergillus parasiticus 以培养基(L_1):鹿糖 30, NaN0s3.0, MgSO4.7H200.5,KC10.5，FeSO40.01，KH2PO4L 0，在28°C初始pH为5.0~6.0的条件下培养3天，所得生物絮凝剂中含76.3%多糖。处理高岭土时，絮凝率最高可达98.1%，对印染废水的脱色率也高于 96%(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces2005, 44:179 - 186)。
[0013]Proteus mirabilis TJ-1 以培养基(g L-1):葡萄糖 10,胰蛋白胨 I, K2HP045,KH2P042, MgSO4.7H200.3，在30 °C，pH为7.0条件下培养48h，产生的生物絮凝剂中63.l%(w/w)为多糖。其中中性糖、糖醛酸、氨基糖比例为8.2:5.3:1。最高絮凝率为93.13%(Bioresource Technology2008, 99:6520 - 6527)。
[0014]Bacillus sp.F19 以培养基(g L-1):葡萄糖 10，酵母提取物 0.5，(NH4)2SO40.2,K2HP045, KH2P042，尿素0.5，NaCl0.1，在30°C，pH为7.0的条件下培养48h，产生的生物絮凝剂MBFF19为糖蛋白衍生物，其中中性糖、糖醛酸、氨基糖和蛋白质所占比例(w/w)分别为3.6%,37.0%、0.5%和16.4%，而两种中性糖的比例为1.2:1。处理高岭土的最高絮凝率为97%(Bioresource Technology2008, 99:7686 - 7691)。
[0015]Bacillus licheniformis X14 以培养基(g I71):葡萄糖20,酵母提取物0.5,尿素0.5，(NH4)2SO40.2,MgSO4.7Η200.2，K2HP045，KH2P042，NaCl0.1，在 37°C，pH 为 8.0 的最适条件下培养48h，产生的生物絮凝剂ZS-7含91.5%(w/w)的多糖，其中糖醛酸、丙酮酸和乙酸占总产物比例为16.4%、7.1%和0.5%。处理高岭土的最高絮凝率为99.2%，对低温饮用水的CODsfa和浑浊度去除率分别为 61.2% 和 95.6%(Bioresource Technology2009, 100:3650 - 3656)。
[0016]Aspergillus flavus S44-1 以培养基(g L-1):鹿糖 30,胰蛋白胨 3.0,MgSO4.7Η200.5，KC10.5，FeSO40.01，KH2PO4L 0，在 30°C，pH 为 6.0 的条件下培养 3 天，产生的生物絮凝剂IH-7含69.7%(w/w)的多糖，其中中性糖、糖醛酸和氨基糖占总产物比例为40%、2.48%和1.8%。中性糖组成成分为蔗糖、乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖，比例是2.4: 4.4: 4.1: 5.8: 9.9: 0.8: 3.1。处理高岭土的絮凝率可达95%以上(Bioresource Technology2013, 127: 489 - 493)。
[0017]Klebsiella pneumoniae LZ-5 以培养基(g I71):葡萄糖 20,酵母提取物 0.5,尿素 0.5，(NH4)2SO40.2，K2HP045，KH2P042，NaCl0.1，，在 30°C，pH 为 8.0 的条件下培养 3 天，产生的生物絮凝剂MBF-5含96.8%(w/w)的多糖和2.1%蛋白质，其中中性糖、糖醛酸和氨基糖占总产物比例为50%、3.44%和4.2%。中性糖组成成分为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、和氨基葡萄糖，比例是4.1: 1.3: 2.7: 3.2。处理高岭土的絮凝率可达98%上(BioresourceTechnology2013, 137:226 - 232)。
[0018]Ochrobactrum ciceri W2以培养基(g L-1):葡萄糖或果糖10,酵母提取物0.5，尿素 0.5，(NH4)2SO40.2，MgSO40.2，K2HP045, KH2P042, NaCl0.1，在 30。。，pH 为 7.5的最适条件下培养16h，产生由多糖和蛋白质组成的生物絮凝剂达最高产量3.Sg L-1,30h 时处理高岭土的絮凝率达最高，为 92% (Bioresource Technology, do1: 10.1016/j.biortech.2012.11.020)。
[0019]熊裕炎等利用Bacillus licheniformis CGMCC2876在培养基(g I71):鹿糖 15,尿素 1，酵母膏 1，KH2P045, MnSO4.H2O0.05，NaCl2 中，于 ρΗ7.2，200rpm，37°C 下摇床培养 48h,合成的生物絮凝剂含有89%多糖，絮凝活性达750U mL—1 (专利号:ZL200910111262)。
[0020] Asp.sojae AJ7002合成的絮凝剂的主要活性成分是蛋白质和己糖胺(Agricultural and Biological Chemistry, 1976，40:619-624);生物絮凝剂 N0C-1 也是一种蛋白质，并且该蛋白质分子中含有较多的疏水氨基酸(Agricultural and BiologicalChemistry, 1991，55:2663-2664)。包括丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等,最大分子质量为75万。Y-聚谷氨酸(Y-PGA)是由L-谷氨酸、D-谷氨酸单体通过酰胺键聚合而成的一种多妝分子(Applied Microbiology and Biotechnology, 2002，59 (I): 9-14),分子中含有大量游离羧基，是一种生物可降解的新型生物絮凝剂。
[0021]Shih 等利用 Bacillus licheniformis CCRC12826 在培养基(g L-1):谷氨酸 20，柠檬酸 12，甘油 120, NH4Cl7, MgSO4.7Η200.5，FeCl3.H2O0.004，K2HPO40.5 和 CaCl20.15 中，在37°C，pH为6.5的条件下发酵96h后得到、-PGA的粘度为17cp，其处理Ca(OH)2溶液絮凝率达到 110D-1 (Bioresoure Technology2001, 78:267-372)。
[0022]Bacillus sp.PY-90 在基础培养基(m/v):葡萄糖 2.0%，K2HPO40.2%,MgSO4.7Η200.05%，多蛋白胨1.0%，酵母提取物0.05%和琼脂2.0%中在30°C条件下发酵48h，所得Y-PGA在高岭土溶液絮凝活性为MOD—1，当温度到100°C时，絮凝活性开始降低(Journal of Fermentation and Bioengineeringl995, 79:378-380)。
[0023]Bacillus subtilis IF03335 以培养基(m/v):谷氨酸 3.0%，NH4Cll.0%,葡萄糖1.0%，K2HPO40.2%，酵母提取物0.2%和MgSO4.7H200.2%，在30 °C条件下发酵 72h,所得 Y-PGA 在酸性黏土中絮凝率为 140D-1 (Journal of Fermentation andBioengineeringl996, 82:84-87)。
[0024]Y-PGA 生产菌 Ruditapes phi lippinarum ZHT4-13 在培养基(g L-1):葡萄糖 20，(NH4)2SO40.2，尿素 0.5，酵母提取物 0.5，MgSO4.7Η200.2，ΚΗ2Ρ042.0，Κ2ΗΡ045.0 中在30°C, pH为8.0的条件下发酵4天后处理高岭土的絮凝率达到86.22%(BioresourceTechnology2009, 100:4996 - 5001)。
[0025]Y -PGA 生产菌 Bacillus subtilis R23 在培养基(g L O:葡萄糖 52.5,朽1檬酸 15.5，NaCl20, (NH4) 2S044.75，L-谷氨酸 20，KC10.66，K2HPO4I, MgSO4.7Η206.8，CaCl2.2Η200.18，NaHCO30.18，MgCl2.6Η204.7，α -酮戊二酸 5mM 和 MnSO4.7Η200.05 中，在37±2°C条件下发酵48h后处理高岭土的絮凝率达到30.320D—1 (Food and BioprocessTechnology2011, 4:745-752)。 [0026]Bacillus licheniformis P_104 以培养基(g L1):谷氛酸纳 50，葡萄糖 50，朽1 樣酸钠 12，NH4Cl7, K2HPO40.5，MgSO4.7Η200.5，CaCl2.2Η200.15 和 MnSO4.7Η200.104，在 37。。，pH为7.2的条件下发酵36h所得Y-PGA产量为41.6g ?Λ产率为1.07g L-V1。稀释20倍后培养液絮凝活性可达 46.66±2.890D-1 (Appl Biochem Biotechnol2013, 170:562 - 572)。
[0027]严珊等利用Bacillus licheniformis CGMCC2876在培养基(g L-1):柠檬酸三钠20，甘油 20，NH4C19，谷氨酸钠 10，MgSO4.7Η200.5，K2HPO40.5，ρΗ7.2，200rpm，37°C 条件下，培养20h，所得絮凝剂产量为21.8g L—1，其中￥^^^含量为94.3%，絮凝活性达1167即mL—1(参见中国专利CN103194499A)。
[0028]虽然目前有许多用微生物法生产以多糖类为主要成分或Y-PGA为主要成分的生物絮凝剂的研究较为详细，但是利用某一菌株在一种培养条件下同时合成以多糖类和Y -PGA为活性成分的生物絮凝剂的方法还鲜有报道。
【发明内容】
[0029]本发明的目的在于针对目前生物絮凝剂生产所存在的原料成本高、发酵周期长、絮凝活性低、热稳定性差、难以推广等问题，提供一种利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法。
[0030]本发明米用的微生物为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.2876 (参见中国专利CN101503709)。
[0031]本发明的具体步骤如下:
[0032]I)菌种活化:将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)转接于斜面培养基培养;
[0033]2)种子的制备:将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养；
[0034]3)发酵培养:将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。
[0035]在步骤I)中，所述斜面培养基的组成可为(g L—1):酵母膏2、牛肉膏2、胰蛋白胨
5、葡萄糖15、FeSO4微量、琼脂18、pH5~7.5 ;所述培养的条件可为37°C下200r/min培养12 ~18h。
[0036]在步骤2)中，所述种子培养基的组成可为(g L-1):葡萄糖10、酵母膏0.5、尿素0.5,K2HPO40.UKH2PO40.UNaCl0.UMgSO4.7H200.2 ;所述培养的条件可为:温度 37。。，摇床转速200r/min，培养时间16h。
[0037]在步骤3)中，所述转接的接种量可为3% ;所述发酵培养基的组成可为(g L-1):葡萄糖5~15、柠檬酸三钠10~15、甘油10~15、尿素I~3、酵母膏0.5~1、NH4C12~6、谷氨酸钠 2 ~6、MgSO40.3 ~0.5、K2HPO40.5 ~2、KH2PO4I ~5、NaCll ~3，pH5 ~7.5 ;所述培养的条件可为在200r/min，温度37°C的条件下于摇瓶培养，装液量为50mL/250mL，发酵时间为16~48h，所得生物絮凝剂以多糖和y-PGA为活性成分。
[0038]本发明利用地衣芽孢杆菌一种培养条件下合成同时以多糖和Y -PGA为活性成分的生物絮凝剂，该方法具有的优点有原料成本较低、发酵周期短、合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好；特别是多糖在酸性、中性条件下絮凝效果比较好，Y-PGA在中性和碱性环境下絮凝活性较高，合成同时以多糖和Y-PGA为活性成分的生物絮凝剂满足了较大的pH适用范围，工业应用潜力大。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1 为 Bacillus licheniformis CGMCC2876 的发酵曲线。
[0040]图2为苯酚-硫酸 法测定絮凝剂中总糖浓度。
[0041]图3为L-Glu标准品离子色谱图。
[0042]图4为絮凝剂水解液离子色谱图。
【具体实施方式】
[0043]以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。
[0044]实施例1.发酵培养基组成(g L-1):葡萄糖12、柠檬酸三钠15、甘油15、尿素2.5、酵母膏 0.6、NH4C15、谷氨酸钠 5、MgSO40.5、K2HPO40.5、KH2P045、NaC12。发酵时间为 20h 时，絮凝活性达到11179U ml/1 (参见图1)。
[0045]实施例2.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中葡萄糖的浓度为5g L—1。
[0046]实施例3.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中葡萄糖的浓度为15g L—1。
[0047]实施例4.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为IOg L'
[0048]实施例5.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为12g L'
[0049]实施例6.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中甘油的浓度为IOg L—1。
[0050]实施例7.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中甘油的浓度为15g L—1。[0051]实施例8.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中尿素的浓度为Ig L—1。
[0052]实施例9.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中尿素的浓度为3g L—1。
[0053]实施例10.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中酵母膏的浓度为0.5g L—1。
[0054]实施例11.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中酵母膏的浓度为Ig L—1。
[0055]实施例12.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中NH4Cl的浓度为2g L—1。
[0056]实施例13.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中NH4Cl的浓度为6g L—1。
[0057]实施例14.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中谷氨酸钠的浓度为2g L—1。
[0058]实施例15.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中谷氨酸钠的浓度为6g L—1。
[0059]实施例16.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中MgSO4的浓度为0.3g L—1。
[0060]实施例17.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中MgSO4的浓度为0.4g L—1。
[0061]实施例18.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中K2HPO4的浓度为1.2g L—1。
[0062] 实施例19.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中K2HPO4的浓度为2g L—1。
[0063]实施例20.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中KH2PO4的浓度为Ig L—1。
[0064]实施例21.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中KH2PO4的浓度为3g L—1。
[0065]实施例22.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中NaCl的浓度为Ig L—1。
[0066]实施例23.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中NaCl的浓度为3g L—1。
[0067]实施例24.与实施例1相同的培养条件，获得的絮凝剂利用苯酚-硫酸法测定其中多糖含量。(参见图2)
[0068]实施例25.与实施例1相同的培养条件，获得的絮凝剂利用离子色谱法检测其中的Y-聚谷氨酸(Y-PGA)。
[0069]以L-谷氨酸标准品作为参照，利用离子色谱法对产物酸水解液进行分析。从图3和4中可以看出L-Glu标准品和产物水解液出峰时间在29.1min左右，确定发酵产物含有由谷氨酸单体组成的多肽。
【权利要求】
1.利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于其具体步骤如下: 1)菌种活化:将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)转接于斜面培养基培养； 2)种子的制备:将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养； 3)发酵培养:将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。
2.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤I)中，所述斜面培养基的组成为:酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L、胰蛋白胨5g/L、葡萄糖 15g/L、FeSO4 微量、琼脂 18g/L、pH5 ~7.5。
3.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤I)中，所述培养的条件为37°C下200r/min培养12~18h。
4.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子培养基的组成为:葡萄糖10g/L、酵母膏0.5g/L、尿素0.5g/UK2HPO40.lg/L、KH2PO40.lg/L、NaC10.lg/L、MgSO4.7Η200.2g/L。
5.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养的条件为:温度37°C，摇床转速200r/min，培养时间16h。
6.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述转接的接种量为3%。
7.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述发酵培养基的组成为:葡萄糖5~15g/L、柠檬酸三钠10~15g/L、甘油10~15g/L、尿素I~3g/L、酵母膏0.5~lg/L、NH4C12~6g/L、谷氨酸钠2~6g/UMgSO40.3 ~0.5g/L、K2HPO40.5 ~2g/L、KH2PO4I ~5g/L、NaCll ~3g/L，pH5 ~7.5。
8.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述培养的条件为在200r/min，温度37°C的条件下于摇瓶培养，装液量为50mL/250mL，发酵时间为16~48h。
9.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于所述两种不同成分生物絮凝剂以多糖和Y-PGA为活性成分。
【文档编号】C12P1/04GK103937838SQ201410148579
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】何宁, 姚昊晟, 刘昱, 余文成, 严珊, 王远鹏, 李清彪 申请人:厦门大学