一株产环糊精葡萄糖基转移酶的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株产环糊精葡萄糖基转移酶的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株，菌株为嗜热脂肪地芽胞杆菌菌株（Geobacilluscaldoxylosilyticus）CHB1，该菌株已于2013年8月28日在中国典型培养物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCCM2013384，并证明该嗜热脂肪地芽孢杆菌所产酶为隶属α-淀粉酶家族的环糊精葡糖基转移酶(简称CGTase)，所产CGTase可以催化可溶性淀粉生成α-环糊精。本发明的优点在于：提供了一种新的产CGTase的菌株GeobacillusspCHB1，并且该菌产酶发酵液上清酶活最适反应温度为65℃，在40℃~85℃之间保持活性，该菌所产CGTase可以用来生产α-环糊精，还可应用于该温度范围的淀粉等的加工过程。
【专利说明】一株产环糊精葡萄糖基转移酶的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其应用，尤其发现一种新的产高温环糊精葡糖基转移酶(CGTase)菌株Geobacillus sp以及应用该菌株发酵生产环糊精葡糖基转移酶，属于发酵生产领域。
【背景技术】
[0002]环糊精葡萄糖基转移酶是可以催化淀粉转化成环状糊精的一类淀粉酶，属于α-淀粉酶家族的重要成员，其有环化、歧化、耦合和水解四种活性。生产中主要应用其环化反应生成环糊精，环糊精葡糖基转移酶催化产物为α、β和Y三种环状糊精，分别由6、7和8个葡糖糖分子以α-1.4糖苷键首尾相连而成。以主产物不同来定义环糊精葡糖基转移酶又可分为α-环糊精葡糖基转移酶、β-环糊精葡糖基转移酶和Y-环糊精葡糖基转移酶。环糊精外部亲水内部疏水的空腔结构可以结合多种小分子物质，起到缓释、遮蔽气味、保护等多种效果，在医药、食品、化妆品和农业等领域有重要应用。环糊精的生产主要是应用CGTase催化得到，目前国内应用和报道的CGTase生产菌株多为Bacillus属等常温菌，所产CGTase也为常温酶。高温酶具有催化速率快、耐受温度高等常温酶不可比拟的优点。本发明人发现一株产高温CGTase的菌株,且目前尚无Geobacillus caldoxy1siIyticus其它同种菌株产该酶的报道，通过液体发酵得到粗酶液，该粗酶液可以高效催化可溶性淀粉产生环糊精。基于以上发现提出了本发明。
[0003]
【发明内容】
本发明的目的是提供一株产环糊精葡萄糖基转移酶的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株，该菌株为嗜热脂肪地芽孢杆菌CHB1,鉴定为Geobacillus caldoxylosilyticus,命名为Geobacillus caldoxy1silyticu CHB1,该菌株于2013年8月28日在中国典型培养物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC M 2013384。且用该菌株发酵生成CGTase粗酶液，应用该酶液可以在高温(40°C~85°C)条件催化可溶性淀粉生成主产物α-环糊精，最适反应温度为60°C~65°C。
[0004]本发明是通过以下技术方案实施的:
首先实验室从福州一处鸡舍堆肥的土壤中分离到一株产糊精葡萄糖基转移酶的菌株CHBI,经鉴定后具体分类命名为Geobacillus caldoxylosilyticus CHBI,菌种保藏于2013年8月28日在中国典型培养物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC M 2013384，保藏地址为武汉大学。
[0005]用所述菌株Geobacillus caldoxylosilyticus CHBl 发酵生产 CGTase 粗酶液的具体步骤为: (O嗜热脂肪地芽孢杆菌CHBl的活化:用接种环将嗜热脂肪地芽孢杆菌CHBl划线于菌株活化培养基上，并于恒温培养箱中培养18 h~24 h ,并且培养温度为60°C~65°C ；
(2)制备种子液:将步骤(1)所获得的嗜热脂肪芽孢杆菌CHBl的单菌落接种于50 mL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养18 h~24 h，温度60°C~65°C，转速180rpm/min ；
(3)发酵粗酶液:按2%移种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的产酶培养基中培养，温度60 °C~65°C，转速180 rpm/min，培养时间为48 h ；
(4)环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液的制备:将步骤(3)所获得的液体发酵液10000g超速离心10 min，上清即为粗酶液；
所述菌种活化培养基的组分:牛肉浸膏0.5 %，大豆蛋白胨0.9 %，磷酸氢二钾0.1 %，磷酸二氢钾0.75 %，琼脂粉1.6 %，蒸馏水配制，pH 7.2 ；
所述种子培养基的组分:牛肉浸膏0.5 %，大豆蛋白胨0.9 %，磷酸氢二钾0.1 %，磷酸二氢钾0.75 %，蒸馏水配制，pH 7.2 ；
所述产酶培养基的组分:糊精I %，牛肉膏0.3 %，大豆蛋白胨0.5 %, CaCl2 0.2 %，K2HPO4 0.2 %，KH2PO4 0.2 %，MgSO4.7H20，FeSO4 0.2 %，蒸馏水配制，pH 7.0。
[0006]本发明的有益效果:本发明提供了一株嗜热脂肪地芽孢杆状细菌Geobacilluscaldoxylosilyticus CHBI,以此菌株做为发酵菌株，以糊精、牛肉膏和大豆蛋白胨等组成产酶培养基，发酵获得高温CGTase粗酶液。所获CGTase催化可溶性淀粉生成α-环糊精。本发明所提供的菌株在α-环糊精的生产方面具有很好的潜力。
[0007]【专利附图】
【附图说明】
图1 CHBl菌落图。
[0008]图2 CHBl光镜形态。
[0009]图3 CGTase产物薄层层析分析。
[0010]图4 CGTase最适反应温度。
[0011]图5 CGTase 最适反应 pH。
【具体实施方式】
[0012]实施例1
1、该菌株的分离
(1)取10g 土样于80 mL灭菌CldH2O摇匀，梯度稀释后涂布于NA固体平板培养基，60 V~65 °C恒温培养箱过夜培养；
(2)挑取步骤(1)中形状、颜色和大小等有差异的菌落，分别固体平板划线纯化，纯化三次后试管斜面保菌；
(3)挑取步骤(2)中纯化菌种点种于含1%可溶性淀粉的NA固体琼脂平板，60°C~65°C恒温下倒置培养过夜；
(4)碘液显色有淀粉分解圈者命名为CHBI。
[0013]2菌株CHBl的鉴定
该菌的生长温度范围为47V~75°C，最适生长温度为60V~65°C ;菌落圆形，淡黄色透明，表面光滑，边缘齐整(图1);光镜下菌体为杆状，端生芽胞，芽胞圆形，芽胞个体较小(图2);应用北京陆桥公司生化鉴定管对该菌生理生化特征进行了鉴定(表1)；
上述指标结合16S rDNA测序结果鉴定该菌为Geobacillus caldoxylosilyticus,将该菌命名为 Geobacillus caldoxylosilyticus CHBl0
[0014]表1菌株CHBl生理生化特征
【权利要求】
1.一种嗜热脂肪地芽胞杆菌菌株，其特征在于:所述菌株为嗜热脂肪地芽胞杆菌菌株(Geobacillus caldoxylosilyticus) CHB1,该菌株已于2013年8月28日在中国典型培养物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC M 2013384。
2.一种如权利要求1所述一种嗜热脂肪地芽胞杆菌菌株生产环糊精葡糖基转移酶的制备方法，其特征在于:其液体发酵粗酶液制备方法的具体步骤为: (O嗜热脂肪地芽孢杆菌CHBl的活化:用接种环将嗜热脂肪地芽孢杆菌CHBl划线于菌株活化培养基上，并于恒温培养箱中培养18 h~24 h ,并且培养温度为60°C~65°C ； (2)制备种子液:将步骤(1)所获得的嗜热脂肪芽孢杆菌CHBl的单菌落接种于50mL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养18 h~24 h，温度60°C~65°C，转速180rpm/min ； (3)发酵粗酶液:按2%移种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的产酶培养基中培养，温度60 °C~65°C，转速180 rpm/min，培养时间为48 h ； (4)环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液的制备:将步骤(3)所获得的液体发酵液10000g超速离心10 min，上清即为粗酶液。
3.根据权利要求2所述一种嗜热脂肪地芽胞杆菌菌株生产环糊精葡糖基转移酶的制备方法，其特征在于:所述菌种活化培养基的组分:牛肉浸膏0.5 %，大豆蛋白胨0.9 %，磷酸氢二钾0.1 %，磷酸二氢钾0.75 %，琼脂粉1.6 %，蒸馏水配制，pH 7.2 ； 所述种子培养基的组分:牛肉浸膏0.5 %，大豆蛋白胨0.9 %，磷酸氢二钾0.1 %，磷酸二氢钾0.75 %，蒸馏水配制，pH 7.2 ； 所述产酶培养基的组分:糊精I %，牛肉膏0.3 %，大豆蛋白胨0.5 %, CaCl2 0.2 %，K2HPO4 0.2 %，KH2PO4 0.2 %，MgSO4.7H20，FeSO4 0.2 %，蒸馏水配制，pH 7.0。
【文档编号】C12N9/10GK103981125SQ201410148657
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】林新坚, 陈济琛, 贾宪波, 林戎斌, 林陈强 申请人:福建省农业科学院土壤肥料研究所