粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种粉尘螨变应原Der?f4基因编码的蛋白质及其应用，根据该基因分别构建原核表达质粒pET-28b-Der?f4和真核表达质粒pGAPZα-A-Der?f4，制备其重组蛋白。本发明具有以下优点：本发明得到了粉尘螨变应原Der?f4全长基因序列，并根据该基因序列制备得到重组蛋白，编码的重组蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富。本发明可以应用于诊断患者是否因为粉尘螨变应原第4组分引起的过敏性疾病。
【专利说明】粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用生物学技术生产粉尘螨变应原，尤其涉及一种粉尘螨变应原Derf4基因编码的蛋白质及其应用。
【背景技术】
[0002]目前，用免疫印迹法和放射交叉免疫电泳等技术检测到尘螨粗提浸液中有30多条与过敏性哮喘患者血清IgE发生结合的条带，国际免疫学会联合会(The InternationalUnion of Immunological Societies, IUIS)命名数据库(nomenclature database,http://www.allergen.0rg/)已公布24组不同的螨类变应原，其中第1、2组分为主要变应原，可与50%以上螨粗提浸液阳性者血清IgE发生反应，且平均滴度达到50ng/mL以上[1’2] ([I]Thomas WR, Smith WA, Hales BJ, Mills KL, 0' Brien RM.Characterizationand immunobiology of house dust mite al I ergens.1nt Arch Al lergyImmunol2002;129 (I):1-18.[2]Thomas WRj Heinrich TK，Smith WAj Hales BJ.Pyroglyphidhouse dust mite allergens.Protein Pept Lett2007;14(10):943-53.);第 4、5、7 组分特异性IgE结合率均达到10%以上，被认为是中等效价变应原组分(mid-potencyspecificities) [3] ( [3]Batard T，Hrabina Aj Bi XZj Chabre H，Lemoine P，CouretMN，et al.Production and proteomic characterization of pharmaceutical-gradeDermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae extracts forallergy vaccines.1nt Arch Allergy Immunol2006;140(4):295-305.)。[0003]Dei*p4分子量为60kDa，是除了 Dei* pi和Dei* p2外最重要的变应原之一。其氨基酸序列是典型的α-淀粉酶，其同源建模结构为13糖基水解酶家族μ([4]Mills KL, Hart BJ, Lynch NR, Thomas WR, Smith ff.Molecular characterization ofthe group 4house dust mite allergen from Dermatophagoides pteronyssinusand its amylase homologue from Euroglyphus mayne1.1nt Arch AllergyImmunoll999;120(2):100-107.),即含有活性位点的 8 个 α/β 链。Der ρ4 和 Eur m4 氨基酸序列一致性为90%，与其它昆虫、哺乳动物、软体动物α -淀粉酶氨基酸序列一致性在50%左右。Der ρ4和Eur m4都有糖基化位点。第4组分与IgE结合率为25_46%，平均40%[5](([5]Mills KL, Thomas WR, Smith ff.Characterization of the group4allergens of thehouse dust mite.J Allergy Clin Immunol2002;109:S180.)。
[0004]目前还没有有关粉尘螨变应原Derf4全长基因的文献报道，本发明根据得到的粉尘螨变应原Der f4全长基因序列分别构建了原核表达质粒构建pET-28b-Der f4和真核表达质粒pGAPZ a -A-Der f4,并诱导这两种质粒表达，最后纯化重组蛋白。
[0005]目前，临床仍普遍采用变应原粗提浸液混合物皮下注射治疗的方法。与现阶段临床使用的粗提浸液相比，纯化得到的重组蛋白具有以下3个优点:(I)重组蛋白具有更高的纯度。现阶段临床使用的粗提物为多种变应原组分的混合物，即该混合物中除了变应原成份外，还有多种非变应原成份、酶类、酶的抑制剂、毒性蛋白等te] (Bessot JC, Pauli G.Miteallergens:an overview.Eur Ann Allergy Clin Immunol.2011，43(5): 141-156)。(2)重组蛋白具有较好的特异性。由于目前临床使用的粗提浸液是多组分的混合物，而患者病因可能只与粗提浸液中的某种或某些变应原有关，这就意味着该粗提浸液特异性差。但重组蛋白的纯度高，相对于临床使用的粗提浸液，其化学组分单一，特异性较好。(3)越来越多的研究表明，通过基因工程技术获得纯化的重组变应原能替代传统的天然变应原浸液，基因工程技术通过减少重组变应原IgE结合的抗原表位，能有效地降低IgE介导的过敏反应，同时通过保留变应原T细胞识别所必须的结构域，因而具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果[13]( [13]李国平综述，刘志刚，钟南山审校.支气管哮喘特异性免疫治疗与变应原疫苗的研究进展.国外医学呼吸系统分册，2004; 24 (I):34-37.)。
[0006]过敏体质者吸入尘螨分泌物、排泄物及尸体的降解产物后可发生I型变态反应，引起哮喘、鼻炎及异位性皮炎等多种变态反应性疾病，采用药物治疗可以暂时缓解症状，但是不能根除疾病。大量临床试验表明，采用变应原特异性免疫治疗(allergen-specificimmunotherapy, SIT)具有特异性、持久改善病情等优点。但是，临床采用变应原来源物质制备出的粗提浸液为多种变应原的混合物，不同批次粗提浸液含有的变应原种类不稳定，主要变应原组分的含量不稳定，并可能含有非变应原物质、某些免疫原性偏低的变应原、毒性蛋白等，用于临床治疗会引起局部和全身的不良反应，甚至危及生命。目前包括ELISA、Radio Allergo Sorbent Test、the CAP system (Pharmacia)在内的特异性 IgE 检测方法使用的是粗提浸液混合物，只能明确引起患者过敏的变应原来源，无法明确引起患者过敏的变应原种类。因此，提高变应原纯度，采用单一变应原进行特异性免疫治疗成为改善免疫治疗质量的首要任务。另一方面，要建立单一变应原组分的特异性检查方法。这样既可以检查出疾病是何种变应原组分所致，又可以用单一组分变应原进行治疗，减少临床治疗引起的局部和全身的不良反应。
【发明内容】
[0007]解决的技术问题:本发明提供了粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质及其应用，根据粉尘螨变应原Der f4基因分别构建原核表达质粒pET-28b-Der f4和真核表达质粒pGAPZ a -A-Der f4，制备重组蛋白。
[0008]技术方案:
[0009]粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0010]制备粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质的方法，包括以下步骤:以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获得目的基因；以Nco I与Xho I酶对PCR产物和pET-28b载体进行酶切，然后连接，转化至宿主菌，培养，得到原核表达质粒pET-28b-Derf4;将所得的原核表达质粒转化至大肠杆菌内，培养，破碎后，对蛋白质进行分离纯化。
[0011]制备粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质的方法，包括以下步骤:以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获得目的基因；以Xba I与Xho I酶对PCR产物和pGAPZ a -A载体进行酶切，然后连接，转化至宿主菌，培养，得到真核表达质粒pGAPZ a -A-Der f4 ;将所得的真核表达质粒转化至毕赤酵母内，培养，破碎后，对蛋白质进行分离纯化。
[0012]—种基因，其编码氣基酸序列如SEQ ID No:2所不的蛋白质。[0013]粉尘螨变应原Der f4基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0014]制备粉尘螨变应原Der f4基因的方法，包括以下步骤:以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获得目的基因。
[0015]粉尘螨变应原Der f4基因编码的重组表达载体，含有SEQ ID No:1所示的粉尘螨变应原Der f4基因序列。
[0016]上述的重组表达载体，是将SEQ ID No:1所示的粉尘螨变应原Der f4基因插入至pET-28b的Nco I与Xho I酶切位点之间。
[0017]上述的重组表达载体，是将SEQ ID No:1所示的粉尘螨变应原Der f4基因插入至pGAPZ a -A的Xba I与Xho I酶切位点之间。
[0018]粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质在制备诊断患者因为粉尘螨变应原第4组分引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0019]粉尘螨变应原Der f4基因编码的蛋白质在诊断患者因为粉尘螨变应原第4组分引起的过敏性疾病中的应用。
[0020]有益效果:
[0021](I)本发明得到了粉尘螨变应原Der f4全长基因序列，并根据该基因序列制备得到重组蛋白，编码的重组蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富。
[0022](2)本发明可以应用于诊断患者是否因为粉尘螨变应原第4组分引起的过敏性疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为粉尘螨变应原第4组分原核表达产物纯化后的SDS-PAGE分析。
[0024]图2为粉尘螨变应原第4组分酵母表达产物纯化后的SDS-PAGE分析。
【具体实施方式】
[0025]下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍。
[0026]粉尘螨变应原Der f4全长基因及其编码蛋白质制备所采用的质粒、菌株、试剂和仪器分别为:TP3000PCR 仪(Takara Bio Inc.), Mupid 电泳仪(Advance-Bio C0., Ltd),ImagcMastcrw VDS 电泳成像装置(Pharmacia Biotech), ABI PRISM?377XL DNA SequencerDNA 测序仪(Perkin Elmer)。
[0027]实施例1:简并引物RT-PCR扩增Der f4编码基因的部分片段
[0028]a.引物的设计。对屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)和腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)变应原第 4 组分 Derp4(GenBank N0.AF144060)> Eur m4(GenBank N0.AF144061)> Tyr p4 (GenBankN0.DQ983318)核苷酸序列进行比对，设计简并引物上游Fj' -CCNGTNAAYGARCAYGCNAT-3'(SEQ ID No:3)和下游 Rj' -TCRTGNCCRTGRAARTCRTT-3' (SEQ ID No:4)。
[0029]b.总RNA的提取。在解剖镜下挑取粉尘螨(Dermatophagoides farinae)600只，匀衆后用Takara RNAiso Reagent试剂盒提取总RNA。
[0030]c.cDNA 的合成及 PCR 扩增。使用 TaKaRa HighFidelityPrimeScript?RT-PCRKit (TaKaRa Code N0.DR027A)进行反转录实验，并设立 M-MLV (-)对照。取 I 支 Eppendorf 管，加入 Total RNAl μ L、dNTP Mixturel μ L、Random6mersl μ L、RNase Free dH207 μ L,立即置 65°C水浴 5min,然后冰浴 2min ;然后加入 5 XPrimerScriptRT Buffer4u L> RNase Inhibitor0.5 μ L> PrimeScript RTase (for2step) 0.5 μ L> RNaseFree H205 μ L，共 20 μ L，置 PCR 仪，反应条件设置为 30°C IOmin,42°C 30min、70°C 15min。使用 PnmeSTARHS DNA Polymerase (Takara Code N0.DR010S)进行 PCR 扩增，反应体系包括上述 RT 产物 I μ L、5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μ L、dNTP Mixture (各2.5mM) 4 μ L、上游引物 F1 (IOOpmoI/ μ L) I μ L、下游引物 R1 (IOOpmoI/ μ L) I μ L、PrimeSTARHS DNA Polymerase (2.5U/y L)0.5μ L、dH2032.5 μ L，反应条件是 98°C预变性 10sec、50°C变性10sec、72°C退火30sec条件下进行30个循环，72°C延伸5min。
[0031]d.PCR产物的验证。琼脂糖凝胶电泳后,用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0 (TaKaRa Code N0.DV805)切胶回收，对上述PCR产物进行测序验证，得到Der f4编码基因的中间片段。
[0032]实施例2 [0033]5' -RACE 试验:
[0034]a.设计引物、合成cDNA及PCR扩增。根据已获得的Der f4片段序列，设计引物R2 为 5' -ACCATACGACGAAATTGTTGTT-3' (SEQ ID No:5)和引物 R3 为 5' -TGATACCGTTCATACCAAGGTC-3' (SEQ ID No:6)，使用 5' -Full RACE Kit (TaKaRa N0.D315)对粉尘螨总RNA进行处理，并与5' RACE Adaptor连接，反转录合成cDNA，同时设立M-MLV(-)对照。反应体系包括 6 μ L ligated RNA>0.5 μ L Random9mers (50 μ Μ)、I μ L dNTP Mixture (IOmMeach)>2 μ L5 XM-MLV Buffer>0.25 μ L RNase Inhibitor(40U/μ L)>0.25 μ LReverseTranscriptase M-MLV(RNaseF) (200U/ μ L)，将此反应体系置 30°C水浴 10min、42°C水浴60min、72°C水浴 15min后，用 TaKaRa LATaq? with GC Buffer (TaKaRa Code N0.DRR02AG)
先后进行Outer PCR和Inner PCR扩增。Outer PCR反应体系包括2 μ L上述转录反应液、8yLlXcDNA Dilution Buffer I1、2yL 弓丨物 R2 (10 μ Μ)、2 μ L5 ' RACE OuterPrimer(10uM),25uL2XGC Buffer 1、0.5μ L TaKaRa LA Taq? (5U/μ L)、10.5 μ LdH20，将此反应体系置94°C预变性3min，94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 2min条件下进行30个循环，72°C条件下延伸lOmin。InnerPCR反应体系包括I μ L Outer PCR反应液、8yLdNTP (2.5mM θ&(Λ)、2μΙ^|*Κ3(10μΜ)、2μLν RACE Inner Primer (10 μ M)、25 μ L2XGC
Buffer 1、0.5μ L TaKaRa LA Taq? (5U/μ L)、11.5 μ L dH20,将此反应体系置 94°C 预变性3min，94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 2min 条件下进行 30 个循环，72°C条件下延伸 lOmin。
[0035]b.阳性菌落的筛选及鉴定。琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收上述5' -RACE产物，用DNA Ligation Kit Ver.2.0 (TaKaRa Code N0.D6022)中的连接酶将此 5' -RACE 产物与PMD20-T Vector (TaKaRa Code N0.D107)连接后，热转化至E.coli Competent Cells J1109中，涂布平板，37 °C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒测序。
[0036]3' -RACE 试验:
[0037]a.设计引物及合成cDNA。根据已获得的Derf4片段序列，设计引物 F2 为 5 ' -AACAAC AATTTCGTCGTATGGT-3 ' (SEQ ID No:7)和引物 F3 为5' -AATCAGGCCTAGGAACAAATGG -3' (SEQ ID No:8)，使用 3' -Full RACE Core SetVer.2.0 (TaKaRa N0.D314)合成 cDNA,同时设立 M-MLV (-)对照。
[0038]b.PCR扩增。取Eppendorf管I支，依次加入IyL粉尘螨总RNA、lyL3' RACEAdaptor (5 μ Μ) > I μ L dNTP Mixture (IOmM each) >4.5 μ L RNase FreeH2O, 70 V 水浴lOmin，立即置冰上放置2min，然后依次加入2 μ L5 XM-MLV Buffer,0.25 μ LRNaseInhibitor(40U/μ L)>0.25 μ L Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-) (200U/μ L),42°C水浴 60min，70°C水浴 15min。使用 TaKaRa LA Taq? with GC Buffer (TaKaRa Code
N0.DRR02AG)先后进行Outer PCR和Inner PCR扩增。Outer PCR反应体系包括2 μ L已知序列验证的 cDNA、8y LlXcDNA Dilution Buffer I1、2 μ L 引物 F2 (10 μ Μ)、2 μ L3' RACEOuter Primer (10 μ Μ)、25μ L2XGC Buffer 1、0.5μ L TaKaRa LA Taq? (5U/μ L)、
10.5μ L dH20，将此反应体系置 94°C预变性 3min，94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 2min 条件下进行30个循环，72°C条件下延伸lOmin。Inner PCR反应体系包括I μ L Outer PCR反应液、8 μ L dNTP(2.5mM each)、2 μ L 引物 F3(10 μ Μ)、2 μ L3' RACE Inner Primer (10 μ Μ)、
25μ L2XGC Buffer 1、0.5μ L TaKaRa LA Taq? (5U/μ L)、11.5 μ LdH2O,将此反应体系置94°C预变性3min，94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 2min条件下进行30个循环，72°C条件下延伸 IOmin0
[0039]c.阳性菌落的筛选及鉴定。琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收上述3' -RACE产物，用DNA Ligation Kit Ver.2.0 (TaKaRa Code N0.D6022)中的连接酶将此 3' -RACE 产物与PMD20-T Vector (TaKaRa Code N0.D107)连接后，热转化至E.coli Competent Cells J1109中，涂布平板，37 °C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒测序。 [0040]实施例3:粉尘螨变应原第4组分Der f4全长基因克隆
[0041 ] a.设计引物、合成cDNA及PCR扩增。由3' -RACE和5丨-RACE试验获得的序列与中间序列进行拼接，得到Der f4的全长序列，再根据全长序列设计上游引物:匕为5' -TACCCTCGAGGGATCCATGTTGCCAAAATTTTTTTTC~3/ (SEQ ID No:9)和下游引物 R4 为 5' -TAGACTGCAGGTCGACTTAAGATTCCACACGAGCAC-3' (SEQ ID No: 10)，两侧添加 BamH I /Sal I酶切位点，由宝生物工程(大连)有限公司合成。以粉尘螨Total RNA为模板，用TaKaRaPrimeScript? RT-PCR Kit (TaKaRa Code N0.DR014A)进行反转录，取 Eppendorf 管 I 支，加入 I μ L Total RNA> IuL dNTP Mixture (IOmM each) > I μ L Random6 (20 μ Μ)、7 μ L RNaseFree Η20，65°C水浴5min后立即冰上放置 2min，然后加入4 μ L5 XPrimeScript RT Buffer、0.5 μ L RNase Inhibitor(40U/μ L)>0.5 μ L PrimeScript TRase(for2step)>5 μ L RNaseFreeH2O,将此反应体系置30°C水浴IOmin、42 V水浴30min、95 V水浴5min进行反转录后，用 PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer (TaKaRa Code N0.DR044A)进行PCR扩增，反应体系包括IyL上述反转录反应液、25 μ L2 X PrimeSTAR GC Buffer,4y LdNTP Mixture (2.5mMeach)、I μ L 上游引物 F4、I μ L 下游引物 R4、0.5 μ L PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/μ L)、16.5 μ L dH20，将此反应体系置 94°C预变性 3min，98°C lOsec、55°C 15sec、72°C 1.5min条件下进行30个循环，72°C条件下延伸lOmin。
[0042]b.阳性菌落的筛选及鉴定。琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa Code N0.D823A)切胶回收目的基因，用 DNALigation Kit (TaKaRa CodeN0.D6020A)将目的基因与 pCold TF 连接后，热转化至 E.coliCompetent Cells J1109 (TaKaRa Code N0.D9052)，涂布平板，37°C过夜培养，挑取阳性菌落植菌，提取质粒，测序(委托大连宝生物公司进行测序)，测序引物为pCold TF Pl/pCold TFP2，测序结果如SEQ ID No:1所示，其推导出的编码蛋白质的序列如SEQ ID No:2所示。
[0043]实施例4
[0044]原核表达质粒pET_28b_Der f4构建:
[0045]a.设计引物、合成cDNA及PCR扩增。根据上述序列分析结果，去除信号肽序列后，设计并合成引物，分别引入Nco I与Xho I酶切位点，上游引物F5序列为5' -CACCATGGACTCTAAATTCTCTAACCCGCACTTCATCG-3' (SEQ ID No: 11)和下游引物 R5 序列为 5' -GTCTCGAGAGATTCAACACGAGCACCGATG TGGTAA GC-3' (SEQ ID No: 12)，PCR 扩增目的基因，反应体系包括 IOXLA PCR Buffer 5 μ L、TaKaRa Pyrobcst& DNA Polymerase 0.5 μ L、dNTP8 μ L、质
IipCold TF-Der f40.5 μ L、上游引物 I μ L、下游引物 I μ L和 ddH2034 μ L，总体积为 50 μ L0反应条件为:94°C变性2min后进入循环，循环参数为94°C 30s,55°C 30s,72°C 2.0min，循环数30次，循环后72°C延伸lOmin， 电泳鉴定扩增产物的大小正确后切胶回收目的片段。
[0046]b.载体构建、阳性菌落的筛选及鉴定。酶切PCR产物，酶切pET_28b载体，T4DNALigase连接酶将二者连接得质粒pET-28b-Der f4,将该表达质粒通过CaCl2法转化宿主菌E.coli5a感受态细胞，在含有50mg/L Kan的固体LB培养基平板上筛选重组菌，提取质粒，酶切鉴定，并进行测序验证。
[0047]质粒pET_28b_Der f4 诱导表达:
[0048]a.载体构建。将鉴定正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取菌落PCR检测，反应体系包括 IOXLA PCR Buffer5 μ L、TaKaRa Pyrobeste DNA Polymerase0.5 μ L、
dNTP8 μ L、质粒 pCold TF-Der f40.5 μ L、上游引物 I μ L、下游引物 I μ L 和 ddH2034 μ L,总体积为50 μ L。反应条件为:94°C变性2min后进入循环，循环参数为94°C 30s,55°C 30s、72°C 2.0min，循环数30次，循环后72°C延伸IOmin0
[0049]b.阳性菌落的筛选、鉴定及重组蛋白的纯化。将含有pET-28b_Der f4的BL21细菌接种至含有50mg/L Kan的LB液体培养基中，37°C过夜，再按1:100稀释至50mL含500mg/L Kan的新鲜LB液体培养基中，于37°C摇床培养至0D600值至0.6-0.8，把上述菌液分成2份，一份用ImM IPTG进行诱导表达，另一份为未诱导的对照。30°C和37°C分别继续培养，分别收集诱导2h和4h后的菌液各ImL,于室温5000g/min离心5min收集菌体。重悬于50Mm PBS (pH7.4)中，然后冰浴进行超声破碎(400WX 10次，每次超声5s，间歇3s，3min)，最后4°C，12000g/min离心10min，收集上清和沉淀，于100°C加热变性5min，进行SDS-PAGE分析。摇菌培养1L，12000rpm离心Ih收集菌体，用缓冲液(20mM TrispH7.4、150mM氯化钠)按菌液比1:10悬浮，高压匀浆，12000rpm离心Ih收集包涵体，用缓冲液(20mM TrispH7.4、8M尿素、500Mm氯化钠、5mM咪唑)溶解过夜，12000rpm离心Ih，收集溶解上清，SDS-PAGE验证，如图1所示，图中M代表marker, I~8条带是制得的,其他蛋白质大小与预期一致。
[0050]实施例5
[0051 ] 真核表达质粒pGAPZ a -A-Der f4构建:
[0052]a.设计引物、合成cDNA及PCR扩增。根据Der f4基因全长序列，设计、合成引物并引入Xba I与Xho I酶切位点，上游引物F6序列为5' -CACTCGAGAAAAGAGAG GCTGAAGCTGACTCTMATTCTCTAACCCGCACTTCATCG-3/ (SEQ ID No:13)，下游引物R6序列为 5' -GTTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGAGATTCAACACGAGCACCGATGTGGTAAGC-3' (SEQ ID No:14)。反应条件为:94°C变性2min后进入循环，循环参数为94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2.0min，循环数为40。循环后72°C延伸IOmin0
[0053]b.载体构建、阳性菌落的筛选及鉴定。电泳鉴定扩增产物的大小，验证正确后切胶回收目的片段。将PCR产物经限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化后与pGAPZ a -A质粒Xho I和Xba I双酶切产物连接，构建真核表达质粒pGAPZ a -A-Derf4，通过CaCl2法转化宿主菌E.coli ToplOF'的感受态细胞，在含有25mg/L Zeocin的低盐固体LB培养基平板上筛选重组菌。提取质粒，用Xho I和Xba I双酶切鉴定真核表达质粒，将筛选的阳性克隆测序鉴定。
[0054]真核表达质粒pGAPZ a -A-Der f4在毕赤酵母GSl 15中的表达及纯化:
[0055]a.载体构建。取10 μ g的真核表达质粒pGAPZ a -A-Der f4用Bln I进行线性化，以用于电转化毕赤酵母GSl 15感受态细胞，转化参数为:电压1500V，电容25 μ F，电击时间10ms。转化子在含有300mg/L Zeocin的YPD平板上初筛，28°C培养2_3d长出单菌落，然后通过利用 pGAPZ a -A 载体的通用弓丨物 pGAP Forward:5' -GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3' (SEQ ID No:15)和 3' AOXl:5/ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3' (SEQ ID No: 16)进行菌落PCR筛选阳性克隆，反应条件为:94°C变性2min后进入循环，循环参数为94°C 30s、53°C 30s,72°C 2.0min，循环数为 40。循环后 72°C延伸 lOmin。[0056]b.阳性菌落的筛选、鉴定及重组蛋白的纯化。挑取阳性酵母单菌落于含有IOOmg/L Zeocin的YI3D液体培养基中，300r/min，30°C培养，每隔48h取ImL发酵菌液样品，离心取上清，进行SDS-PA GE鉴定目的蛋白，如图2所示。取表达量丰富的菌株摇瓶培养1.5L，12000rpm离心Ih,取上清,调节pH至7.4,用于纯化，图中M代表marker, I~4条带是制得的，蛋白质大小与预期一致。
[0057]应用试验
[0058]本发明将制备获得的重组变应原用于临床诊治尘螨相关过敏性疾病患者，如根据经典的ELISA原理，以粉尘螨变应原第4组分重组蛋白为包被抗原，建立间接ELISA法检测患者血清中特异性IgE，可用于螨类变应原引起的哮喘的实验诊断。
[0059]案例实施:以Der f4原核表达产物/酵母表达产物为包被抗原，进行ELISA检测哮喘患者血清。ELISA检测操作流程为:①配制抗原包被液:吸取抗原(rDer f4)溶解在
0.1M PBS缓冲液中，终浓度为I μ g/mL,制成包被溶液。②抗原包被:每孔包被100 μ L，包被温度:2-8°C过夜，包被时间:不少于15小时。③配制PBST洗液后洗板，每孔液量300 μ L，洗2次，拍干。④配制封闭液后进行封闭，每孔加封闭液300 μ L，封闭温度为37°C，封闭时间2小时。洗板5次，拍干。⑤血清按照1:4的比例稀释(样本稀释液稀释)，加入100 μ L/孔，4°C过夜。⑥PBST洗涤5次，拍干。⑦鼠抗人IgE-HRP (二抗):1: 5000倍稀释，每孔10(^1^，371:温育111。⑧用PBST洗涤5次，拍干。⑨加入底物显色溶液，每孔100 μ L，避光显色15min。⑩加入终止液，50 μ L/孔，酶标仪测定OD4tl5值。
[0060]待测哮喘患儿阳性血清样本27份，由上海交通大学附属第一人民医院检验科提供，以血清总IgE>200IU/mL，浓度分级均大于2级为标准筛选得粉尘螨过敏阳性血清；变应原特异性IgE检测采用德国MEDIWISS公司生产的敏筛(Allergy Screen)变应原检测系统，由德国MEDIWISS公司生广的Rapid Reader (Model: ReadlOO)专用阅读仪，配套汉化软件，孵育暗盒和固定频率的混匀仪组成。阴性血清入选标准:患者既过敏史，体检正常，血清总IgE〈100IU/mL，浓度分级均为O级，筛选获得3份与粉尘螨粗提浸液呈阴性反应的血清混合以后作为阴性对照。以上述ELISA方法检测阴性血清的OD值，以其(平均值±3SD)为阈值，高于此值者即为阳性，从而判断患者是否是因为粉尘螨变应原第4组分引起的过敏性疾病。27份对粉尘螨粗提浸液阳性的患者当中，有11人对Der f4原核表达产物呈阳性反应，阳性率为40.7%，具体见表1 ;有17人对Der f4酵母表达产物呈阳性反应，阳性率为63%，具体见表2。
[0061]表1-以Der f4原核表达产物进行ELISA检测粉尘螨粗提浸液阳性血清结果
[0062]
【权利要求】
1.粉尘螨变应原Derf4基因编码的蛋白质，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.制备权利要求1所述的粉尘螨变应原Derf4基因编码的蛋白质的方法，其特征在于:包括以下步骤:以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获得目的基因；以Nco I与Xho I酶对PCR产物和pET-28b载体进行酶切，然后连接，转化至宿主菌，培养，得到原核表达质粒pET-28b-Der f4 ;将所得的原核表达质粒转化至大肠杆菌内，培养，破碎后，对蛋白质进行分离纯化。
3.制备权利要求1所述的粉尘螨变应原Derf4基因编码的蛋白质的方法，其特征在于:包括以下步骤:以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获得目的基因；以Xba I与Xho I酶对PCR产物和pGAPZ a -A载体进行酶切，然后连接，转化至宿主菌，培养，得到真核表达质粒pGAPZa-A-Der f4 ;将所得的真核表达质粒转化至毕赤酵母内，培养，破碎后，对蛋白质进行分离纯化。
4.基因，其特征在于:其编码权利要求1所述的蛋白质。
5.权利要求4所述的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID No:l所示。
6.制备权利要求5所述的基因的方法，其特征在于:包括以下步骤:以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获得目的基因。
7.粉尘螨变应原 Derf4基因编码的重组表达载体，其特征在于:含有权利要求5所述的基因序列。
8.权利要求1所述的粉尘螨变应原Derf4基因编码的蛋白质在制备诊断患者因为粉尘螨变应原第4组分引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
9.权利要求1所述的粉尘螨变应原Derf4基因编码的蛋白质在诊断患者因为粉尘螨变应原第4组分引起的过敏性疾病中的应用。
【文档编号】C12N15/56GK103923894SQ201410148757
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】崔玉宝, 周鹰 申请人:崔玉宝, 周鹰